Спосіб отримання біологічно активного селен-хром-ліпідного комплексу з хлорели

Реферат: Спосіб отримання селен-хром-ліпідного комплексу з Chlorella vulgaris Beij. включає культивування мікроводорості на живильному середовищі Фітцджеральда в модифікації Цендера і Горхема № 11 (22-25 °C, 2500 лк впродовж 16 год./доба). У середовище вносять 3 біологічно активні мікроелементи (натрію селеніту в концентрації 10,0 мг/дм по селену та 3 хрому хлориду в концентрації 5,0 мг/дм по хрому) з подальшою інкубацією культури впродовж семи діб та наступним виділенням лише фракції ліпідів без сторонніх домішок та інших органічних сполук з відповідною регульованою фармацевтичною дозою селену та хрому залежно від потреб організму. UA 122227 U (12) UA 122227 U UA 122227 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біологічної галузі, зокрема до технологій отримання біологічно активних препаратів на основі біомаси мікроводорості Chlorella vulgaris Beij., та може бути використана в медицині, харчовій промисловості та сільському господарстві. Відомий спосіб отримання препаратів на основі біомаси Chlorella vulgaris та доведення їх біологічної активності щодо регуляції метаболічних процесів в організмі експериментальних тварин [Chovancikova M., Simek V. Effects of high-fat and Chlorella vulgaris feeding on changes in lipid metabolism in mice // Biologia (Bratislava). - 2001. - Vol.56, No 6. - P. 661-666.; Lee H.S., Park H.J., Kim M.K. Effect of Chlorella vulgaris on lipid metabolism in Wistar rats fed high fat diet // Nutr. Res. Pract. - 2008. - Vol. 2, No 4. - P. 204-210], який полягає у тому, що для корекції ліпідного обміну мишей використовували висушену хлорелу з підвищеним вмістом біологічно активних речовин. Недоліком даного способу є можливе додаткове навантаження на певні ланки метаболічних процесів організму, у зв'язку із введенням додаткової кількості ліпідів та білків у раціон харчування, навіть незважаючи на їх позитивну дію у даних випадках. Відомий також спосіб використання селену, що входить до складу збагаченої біомаси мікроводорості спіруліна - "Селен-Спирулина" [Selenium // Alternative Medicine Review. - 2003. 8, № 1. - P. 63-71], який полягає у культивуванні водоростей неперервним способом з подальшим додаванням у відібрану біомасу неорганічних солей металів та неметалів. Недоліком зазначеного способу є використання субстанції з висушених і подрібнених нативних клітин цієї водорості, яка характеризується нестабільним вмістом селену та іонів металів, а, оскільки не є очищеною, то містить вторинні метаболіти, що мають алергенний ефект (наприклад, лізофосфоліпіди і деякі феофітини), які можуть утворюватися за нестабільності умов культивування водоростей. Запропоновано оптимальний спосіб культивування хлорели (Chlorella vulgaris Beij.) у присутності натрію селеніту та цинку сульфату, при якому селен і цинк ендогенно включається в ліпідні молекули хлорели in vivo за збереження при цьому природного стану метаболізму та складу біомаси [Боднар О.І., Вінярська Г.Я., Грубінко В.В., Лихацький П.Г., Фіра Л.С. Спосіб отримання біологічно активного селен-цинк-ліпідного комплексу з хлорели. Патент України № 114650. Дата реєстрації 10.03.2017 р. Бюл. № 5]. Суспензія готується з семиденної культури хлорели у присутності розчину натрію селеніту та цинку сульфату, які сприяють прискоренню і стимуляції її росту, а також інтенсивному ендогенному включенню селену та цинку в ліпідні біокомплекси клітин, що після гомогенізації і руйнування клітин хлорели виділяються шляхом хімічного екстрагування, очищення і ліофілізації. Спосіб дозволяє отримати селен-цинк-ліпідну біомасу хлорели, що містить селен-цинк-ліпідний комплекси з такими якісними характеристиками, що придатні для використання як лікувально-профілактичного препарату. Разом з тим, цей препарат загальної дії та не має визначеного спрямованого впливу на обмін речовин за патологій. Корисна модель належить до способів отримання біологічно активних препаратів на основі біомаси мікроводорості Chlorella vulgaris Beij. і може бути застосовано в медицині та виробництві кормових добавок. В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу отримання з біомаси хлорели ліпідного комплексу з оптимальним вмістом селену (Se IV) та хрому (Сr III), при збереженні природних властивостей хлорели і її ліпідного складу, шляхом вирощування хлорели у культуральному середовищі в накопичувальному режимі з подальшим внесенням до культури водних розчинів натрію селеніту та хрому хлориду на 7 діб, наступним екстрагування ліпідів з біомаси хлорели та отримання продукту, що містить в додаткових адекватних кількостях селен і хром. Поставлена задача вирішується тим, що водний розчин натрію селеніту (Na2SeO3) в заданій 3 концентрації по селену в розрахунку на кількість іонів Se (IV) -10,0 мг/дм , а також водний . розчин цинку сульфату (СrСl3 6Н2О) в заданій концентрації по цинку у розрахунку на кількість 3+ 3 Сr - 5,0 мг/дм , додають в спеціально приготовлений розчин суспензії Chlorella vulgaris у стандартному середовищі Фітцджеральда в модифікації Цендера і Горхема № 11 (22-25 °C, 2500 лк впродовж 16 год./доба) (Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике / Под ред. А.В. Топачевского. - Киев: Наукова думка, 1975. – 247 с.). Суспензія культури хлорели разом з добавками натрію селеніту та хрому хлориду витримується в живильному середовищі впродовж семи діб до досягнення стаціонарної фази росту. Клітини відокремлюються від розчину шляхом центрифугування. Отриманий щільний осад вручну ресуспендується в слабко притертому гомогенізаторі Поттера в хлороформметаноловій суміші у відношенні 2:1 за методом Фолча [Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов / М. Кейтс. - М.: Мир, 1975. - 322 с.]. Вміст селену у клітинах хлорели визначається спектрофотометрично з о'-фенілендіаміном при довжині хвилі 1 UA 122227 U 5 10 335 нм [Дедков Ю.М. Селен: биологическая роль, химические свойства и методы определения // Ю.М. Дедков, А.В. Мусатов. - ВИНИТИ. РЖ Химия. - № 1688-В 2002. - С. 19-23]. Вміст хрому після озолення ліпідного екстракту сумішшю нітратної (HNO3) і сульфатної (H2SO4) кислот в герметичних бюксах спектрофотометрично за допомою хромазуролу S при довжині хвилі 556 нм. [Яцків О.С, Пацай И.О. Спектрофотометричне визначення Сr (III) з допомою хромазуролу S в присутності Сr (VI). Методи і об'єкти хімічного аналізу. 2009; 4 (1): 43-47]. Результати щодо підбору оптимальних умов вирощування Ch. vulgaris у накопичувальній культурі для отримання потенційної сировини показали, що найефективнішими умовами є культивування водорості протягом 7-й діб з додатковим введенням натрію селеніту в 3 3 концентрації 10,0 мг Se (IV)/дм та іонів хрому (III) в концентрації 5,0 мг/дм (табл. 1). Таблиця 1 Вміст селену та хрому у ліпідному комплексі з хлорели, М±m; n=5 Вміст Селену, мкг/г сухої маси ліпідів Хрому, мкг/г сухої маси ліпідів Контроль 1,07±0,01 0,44±0,05 3 3+ 3 Дія 10,0 мг Se(IV)/дм +5,0 мг Сr /дм 3,7±0,15* 2,20±0,07* 3+ 15 20 25 30 35 40 Вміст селену за дії селеніту з Cr збільшився у 3,5 разу щодо контролю. Хлорела також активно накопичує хром у 5 разів більше щодо контролю. Отже, спосіб дозволяє в накопичувальному режимі досягти включення біля 3,7 мкг Se (IV) та 2,2 мкг Сr (III) на 1 г ліофілізованого ліпідного екстракту, що цілком відповідає фармакологічним дозам для виготовлення повноцінних профілактичних і лікувальних препаратів на основі хлорели. Склад і структура виділеного селен-хром-ліпідного комплексу встановлена методами тонкошарової хроматографії та мас-спектрометрії (рідинний хромато-мас-спектрометр Agilent 1200 SL/DAD/FD/MSD 6130; "Agilent Technologies", USA). Достовірність включення зазначених мікроелементів підтверджується результатами масспектрометричного дослідження структури селен-хром-ліпідного комплексу (рис. 1 а, б, в). За детекції спектра DAD і мас-детектора за позитивної і негативної іонізації MSD ESI +/- всі піки DAD та MSD узгоджені. Отримані спектри свідчать про включення атома селену (DAD 225 nm-1,6; MSD ESI (+) - 2; MSD ESI (-) - 2), атома хрому (DAD 225 nm-2; MSD ESI (+) - 2), гліцеролу (DAD 225 nm 13; MSD ESI (+) - 13) та жирнокислотних хвостів (DAD 225 nm-18-28 з максимумами 18, 21, 25; MSD ESI (+) - 18-28 з максимумами 19, 21, 23-26; MSD ESI (-) - 20-30 з максимумами 21, 22, 23, 27). Високоймовірнісне співпадіння максимумів речовин - складових комплексу, підтверджує його сталість. Біологічну активність селен-хром-ліпідного комплексу досліджували на білих безпородних щурах-самцям з масою тіла 160-180 г, що утримувалися на стандартному раціоні віварію. Зазначені комплекси розчиняли в 1 % водному розчині крохмалю, 1 мл якого у підсумку містив 1,85 мкг селену, 1,1 мкг хрому, 0,5 мг ліпідів, та вводили тваринам внутрішньо шлунково впродовж 14-и діб. На 14-у добу від початку експерименту проводили забій щурів шляхом евтаназії під тіопенталом натрію. У печінці та сироватці крові тварин визначали показники антиоксидантної системи та енергетичного обміну. Дослідження впливу селен-хром-ліпідного комплексу із хлорели на оксидативний статус щурів показало (табл. 2), що за його введення пригнічувалися оксидативні процеси як у сироватці крові, так і у печінці піддослідних тварин. Таблиця 2 Показники окиснювальних процесів в організмі щурів після застосування селен-хром-ліпідного комплексу (М±m; n=6) Показники ТБК-АП, мкмоль/л Дієнові кон'югати, ум. од./мл Відновлений глутатіон, ммоль/л Каталаза, мкат/л Сироватка крові Печінка Селен-хромСелен-хромКонтроль Контроль ліпідний комплекс ліпідний комплекс 56,41±4,63 30,07±3,20* 598,35±58,52 502,1±48,82* 8,68±0,61 5,29±0,44* 1,57±0,15 1,26±0,12* 6,63±0,51 16,86±1,73* 162,30±12,06 333,56±27,15* 2,23±0,17 3,43±0,25* 1,37±0,20 2,81±0,21* 2 UA 122227 U Продовження таблиці 2 Сироватка крові Селен-хромКонтроль ліпідний комплекс Печінка Селен-хромКонтроль ліпідний комплекс Глутатіон-пероксидаза, ммоль/хв.хл 0,09±0,01 0,13±0,03* 0,03±0,01 0,09±0,01* МСМ % 96,69±8,05 83,96±6,93 не визначали не визначали Показники 5 10 15 20 25 При вивченні процесів ліпопероксидації нами відмічено зниження вмісту ТБК-АП у сироватці крові щурів при застосуванні селен-хром-ліпідного комплексу на 47 %, а у печінці - на 18 % порівняно з контролем. Відповідно, зменшується і вміст дієнових кон'югатів: у сироватці крові - на 38 %, а у печінці на 20 %. Отримані результати з вивчення показників антиоксидантного захисту підтверджують активне включення мікроелементів, які в комплексі з ліпідами, проникають через плазматичні мембрани клітин, у структуру системи антиоксидантного захисту та зниження інтенсивності окиснювальних процесів в організмі: достовірне зростання активності каталази та вмісту відновленого глутатіону як в сироватці крові, так і в печінці, активності глутатіонпероксидази у сироватці крові та зменшення вмісту продуктів пероксидного окиснення. При цьому, зниження вмісту МСМ на 13 % дозволяють припустити можливість застосування використаних нами дослідних комплексів за різних патологічних станів організму, що супроводжуються поглибленням ендогенної інтоксикації, маркерами якої і є середньомолекулярні пептиди. В умовах патології селен-хром-ліпідний комплекс з хлорели, очевидно, зможе кон'югуватись із середніми молекулами, чим саме приводитиме до дезінтоксикації організму. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб отримання селен-хром-ліпідного комплексу з Chlorella vulgaris Beij., що включає культивування мікроводорості на живильному середовищі Фітцджеральда в модифікації Цендера і Горхема № 11 (22-25 °C, 2500 лк впродовж 16 год./доба), який відрізняється тим, що у середовище вносять біологічно активні мікроелементи (натрію селеніту в концентрації 3 3 10,0 мг/дм по селену та хрому хлориду в концентрації 5,0 мг/дм по хрому) з подальшою інкубацією культури впродовж семи діб та наступним виділенням лише фракції ліпідів без сторонніх домішок та інших органічних сполук з відповідною регульованою фармацевтичною дозою селену та хрому залежно від потреб організму. 3 UA 122227 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4