Спосіб одержання l- лізину

Изобретение относится к технологии получения L-лизина микробиологическим синтезом с использованием штаммовпродуцентов преимущественно типа Brevibacterium sp., ВНИИгенетика-90, Brevibacterium lactofermentum НИТИА-88 и им подобных и подходящих произвольных питательных сред. При этом термин "получение L-лизина" здесь и далее обозначает преимущественно процесс получение L-лизина" здесь и далее обозначает преимущественно процесс получения культуральных жидкостей, содержащих L-лизин как целевой продукт в смеси с остатками питательной среды, микроорганизмамипродуцентами и иными продуктами их жизнедеятельности, независимо от того, будет ли L-лизин впоследствии выделен в чистом виде, или использован иным образом, например, в виде концентрированной добавки в комбикорма для сельскохозяйственных животных и птиц, полученной обезвоживанием культуральной жидкости. Общеизвестно, что L-лизин относится к числу незаменимых аминокислот, производство которых в мировой экономике уже давно стало крупнотоннажным, оцениваемым в несколько сот тысяч тонн в год. Поэтому к технологическим процессам производства лизина предъявляется комплекс систематически ужесточающихся трудносовместимых требований. Действительно, весьма желательно, чтобы эти процессы были: как можно более производительными и как можно менее материало- и энергоемкими. Выполнение указанных требований может быть достигнуто различными средствами. Одно из наиболее активно разрабатываемых направлений поиска таких средств предусматривает использование штаммовпродуцентов, способных к так называемому "сверхсинтезу" L-лизина, под которым подразумевают их способность обеспечивать концентрацию целевого продукта в культуральной жидкости свыше 10 (предпочтительно - свыше 20) г/л. Штаммы такого типа обычно являются: ауксотрофными мутантами, то есть способными к росту только в присутствии в питательных средах специфических ростовых веществ, преимущественно некоторых аминокислот, способность к внутриклеточному синтезу которых была утрачена вследствие мутации (Бекер В.Ф., Бекер М.Е. Лизин микробного синтеза. - Рига, Зинатне, 1974. - С.17), или более приемлемыми аналог-резистентными ауксотрофными мутантами, синтез L-лизина которыми не ингибируется по мере нарастания его концентрации в культуральной жидкости (Жданова Н.И., Гусятинер М.М. Методы селекции и свойства штаммов микроорганизмовпродуцентов аминокислот // Обзорная информация. - Серия II. Селекция и генетика промышленных микроорганизмов. М.: ВНИИСЭНТИ, 1985. - С.4 - 17), или наконец, leakyмутантами (т.е. "ослабленными" мутантами) микроорганизмов, зависимыми от концентрации в питательных средах специфических ростовых веществ, способность к внутриклеточному синтезу которых была лишь понижена, но не утрачена вследствие мутации (см. в том же обзоре, с.6). Мутанты указанных типов обычно принадлежат к родам: Brevibacterium, Mlcrococcus и Corinebacterium. Другое направление поиска средств снижения издержек на производство L-лизина, очевидно связанное с первым, предусматривает разработку и применение все более совершенных питательных сред, наиболее полно учитывающи х потребности указанных штаммов в питательных вещества х. Примером может служить использование белково-витаминного концентрата (БВК, или паприна) в качестве основы питательных сред для культивирования микроорганизмов-продуцентов аминокислот (см., соответственно: 1. Бекер В.Ф., Бекер М.Е. Лизин микробного синтеза. - Рига: Зинатне, 1974. - С.37 - 38: 2. Панкова Т.Д. Применение кислотного гидролизата БВК при производстве лизина // Микробиологическая промышленность. - 1983. - №3. - С.9). Однако БВК, получаемый микробиологическим синтезом с использованием грибков рода Candida, культивируемых на парафинах нефти, в условиях систематического роста цен на энергоносители становится все менее доступным для промышленного микробиологического синтеза аминокислот. Кроме того, БВК опасен как аллерген для промышленного персонала, пожаро- и взрывоопасен при транспортировке и хранении и, наконец, служит источником трудноудаляемых балластных примесей в производстве высокоочищенного кристаллического L-лизина как целевого продукта. Если же учесть, что синтез БВК сам по себе экологически опасен, то ясно, что совершенствование процессов микробиосинтеза Lлизина не может ограничиваться лишь улучшением питательных сред. Тем не менее, по мере решения проблемы утилизации отходов различных отраслей пищевой (в особенности, мясоперерабатывающей и молочной) промышленности проблема сбалансированного питания штаммов-продуцентов L-лизина решается все более эффективно и экологически рационально. Примером может служить использование в процессах микробиологического синтеза частичного (по лактозе) гидролизата концентрированной молочной сыворотки как источника конвертируемых в аминокислоты моносахаридов (патент Фракции №2526808). Соответственно, все большее значение приобретает дальнейшее совершенствование технологии микробиологического синтеза L-лизина как таковой. В общих черта х эта те хнология, широко известная специалистам из многочисленных промышленных регламентов, предусматривает; приготовление исходной (стерильной) питательной среды, достаточно сбалансированной по комплексу питательных веществ; внесение порции такой среды в аппарат ("ферментер") для культивирования микроорганизмов; посев избранного штамма-продуцента Lлизина; ферментацию, то есть создание и поддержание условий для роста биомассы соответствующего штамма и микробиологического синтеза целевого продукта, включая: - подпитку ферментируемой (растущей) биомассы свежей питательной средой, содержащей: - ростовые вещества, источники углерода, фосфора и неорганического азота, - аэрацию и перемешивание культуральной жидкости, поддержание заданных значений температуры и pH среды; прекращение ферментации после достижения максимально возможной концентрации целевого продукта в культуральной жидкости, или после заполнения ферментера культуральной жидкостью до заданного уровня, смотря по тому, что наступит раньше; удаление культуральной жидкости из ферментера и повторение процесса. Полученная культуральная жидкость может быть переработана в различные товарные продукты. В частности, можно либо одним из подходящих известных способов извлечь из нее (и очистить) L-лизин, либо концентрированней (упариванием и-или сушкой) культуральной жидкости преобразовать ее сухой остаток в товарную добавку к комбикормам для сельскохозяйственных животных, птиц и рыб. Для стадии ферментации лизинпродуцирующи х микроорганизмов характерна конкуренция двух направлений потребления питательных веществ. Из них одно внешне выражается преимущественно в приросте биомассы и, в меньшей степени, в синтезе Lлизина, а второе - преимущественно в конверсии моносахаридов (в особенности, глюкозы) в Lлизин и некоторые сопутствующие аминокислоты (глутаминовую кислоту), валин, аланин, изолейцин и др.). Существенную роль на той же стадии играет и концентрация кислорода, растворенного в культуральной жидкости. Его недостаток приводит к переключению биосинтеза на продуцирование слабых карбоновых кислот типа молочной, яблочной и некоторых други х в ущерб синтезу целевого продукта, поскольку происходит неполное окисление углеводов. Избыток же кислорода стимулирует расход углеводов на дыхание микроорганизмов и. соответственно, активирует прирост биомассы и биосинтез сопутствующи х аминокислот в ущерб биосинтезу L-лизина (см., например, Руклиша М.П. Физиолого-биохимическая характеристика продуцента лизина Brevibacterium sp. 22 в периодическом и непрерывном процессе культивирования. Рига, 1974. Канд. диссертация). И, наконец, при ферментации микроорганизмов-продуцентов L-лизина явный недостаток углеводов в свежей питательной среде (и, соответственно, в культуральной жидкости) обуславливает прекращение синтеза лизина сверх необходимого для самообеспечения бактериальных клеток физиологического минимума, а явный избыток углеводов приводит к увеличению их расхода на синтез сопутствующи х L-лизину аминокислот. Это снижает производительность процесса в целом и удельный выход целевого продукта (в расчете на единицу массы потребленных углеводов). Если же концентрация углеводов в культуральной жидкости превышает 15% по массе, то наблюдается общеизвестное специалистам угнетение развития микроорганизмов (см. Куцева Л.С., Клюева Н.М. Прикладная биохимия и микробиология. - 1966. Т.2. - №6. - С.729). Однако, по имеющимся данным, в практике промышленного биосинтеза L-лизина указанные факторы до сих пор системно не регулируются. Из числа известных способов, учитывающих взаимосвязь и взаимовлияние указанных факторов, к предлагаемому по технической сущности наиболее близок способ получения Lлизина микробиологическим синтезом по а.с. СССР №1194020. Этот способ предусматривает: приготовление и подачу в ферментер периодического действия порции стерильной питательной среды; посев избранного штамма-продуцента Lлизина; ферментацию, включающую: - дробную (периодическую, дискретную) подпитку ферментируемой биомассы свежей питательной средой, содержащей ростовые вещества и источники углерода (углероды или, что то же самое, сахара)), проводимую по результатам определения интенсивности дыхания по соотношению углекислого газа и остаточного кислорода в отходящи х из ферментера газах, - аэрацию и перемешивание культуральной жидкости, поддержание заданных значений температуры и pH среды; прекращение ферментации; удаление культуральной жидкости из ферментера и повторение процесса. Указанную периодическую подпитку проводили при снижении интенсивности дыхания биомассы до 35 - 65% от максимального значения. Тем самым при использовании разных штаммов-продуцентов и различных по исходному составу питательных сред удавалось добиться повышения продуктивности биосинтеза преимущественно в аспекте повышения концентрации целевого продукта в культуральной жидкости. Однако стабилизация процесса одновременно по двум критериям: скорости прироста биомассы и скорости синтеза L-лизина - оказывалась недостижимой. Действительно, несмотря на то, что интенсивность дыхания служит интегральным показателем прироста биомассы и интенсивности биосинтеза целевого продукта, ее искусственное снижение вследствие периодичности введения подпитки, может привести только к снижению средней скорости биосинтеза и удельного выхода L-лизина по отношению к теоретически возможным значениям этих показателей. В связи с изложенным в основу изобретения положена задача путем изменения порядка и режимов подпитки ферментируемой биомассы свежей питательной средой создать такой способ получения L-лизина, который повышал бы сбалансированность процессов как роста биомассы, так и наработки целевого продукта в культуральной жидкости в течение всего процесса ферментации и, тем самым, обеспечивал бы совместное повышение как суммарной продуктивности биосинтеза, так и повышение удельного выхода L-лизина (в расчете на единицу питательного субстрата). Поставленная задача решена тем, что в способе получения L-лизина, предусматривающем приготовление и подачу в ферментер периодического действия порции комплексной по содержанию питательных веществ стерильной питательной среды, посев избранного штаммапродуцента L-лизина и ферментацию, включающую подпитку ферментируемой биомассы питательными веществами по результатам определения интенсивности дыхания, аэрацию и перемешивание культуральной жидкости, поддержание заданных значений температуры и pH среды, согласно изобретению, подпитку после посева подают непрерывно в течение всего цикла ферментации, при этом ростовые вещества и источники углерода (угле воды) подают раздельно с разными расходами, учитывающи х соотношение скоростей прироста биомассы и синтеза L-лизина. Раздельная и осуществляемая с разными (обусловленными указанным соотношением) скоростями подпитка ростовыми веществами и источниками углерода позволяет существенно сузить интервал фактических колебаний их концентраций в культуральной жидкости. Тем самым удается поддерживать физиологическую активность микроорганизмов на уровне, близком к максимально возможному для используемого штамма, и, соответственно, оптимизировать биосинтез L-лизина. Первое дополнительное отличие состоит в том, что для высеваемого в комплексную питательную среду штамма-продуцента предварительно определяют минимально допустимую для его развития концентрацию углеводов и подпитку, содержащую углеводы, подают с расходом, обеспечивающим в культуральной жидкости их концентрацию в интервале 1,2 - 2,8 от упомянутого минимума, интенсивность дыхания биомассы непрерывно оценивают по парциальному давлению (или, что то же самое, по напряжению) кислорода в культуральной жидкости и подачей подпитки, содержащей ростовые вещества, поддерживают упомянутое напряжение на уровне не менее 12мм рт.ст. При соблюдении указанных условий скорость биосинтеза L-лизина и его удельный выход приближаются к максимально возможным для избранного штамма-продуцента. Второе дополнительное отличие состоит в том, что в процессе ферментации в пробах культуральной жидкости периодически определяют отношение массы L-лизина к сухой биомассе штамма-продуцента и изменением расхода подпитки, содержащей ростовые вещества , поддерживают упомянутое отношение в интервале 2,4 - 2,9г/г. Далее сущность изобретения поясняется: описанием предложенного способа в общем виде, включая описание методов измерения и контроля, со ссылками на прилагаемый чертеж, на котором приведены характерные для процессов периодической ферментации зависимости: парциального давления (напряжения) кислорода в культуральной жидкости от времени культивирования (кривая 1); - концентрации сахара (т.е. источника углерода) в культуральной жидкости от времени культивирования (кривая 2); конкретными примерами: определения минимально допустимых концентраций углеводов в культуральной жидкости и биосинтеза L-лизина предложенным способом; результатами испытаний. Предложенный способ в общем виде предусматривает: предварительное определение критической, то есть минимально допустимой для развития избранного штамма-продуцента L-лизина концентрации углеводов в культуральной жидкости, для чего: - готовят основную питательную среду, отличающуюся от ферментационной среды, предусмотренной для избранного штаммапродукцента, L-лизина тем, что концентрация источника углерода (т.е. углеводов) снижена в два раза, - готовят дополнительную питательную среду, отличающуюся от основной тем, что в ней отсутствует источник углерода, - лабораторный ферментер, снабженный датчиком парциального давления кислорода, заполняют основной питательной средой на 35% от его объема, устанавливают значения температуры, pH, аэрации и перемешивания, соответствующие режиму ферментации, вносят посевной материал в количестве 10% от объема питательной среды и далее непрерывно регистрируют показания датчика парциального давления кислорода и периодически определяют концентрацию источника углерода а культуральной жидкости, - в культуральной жидкости непрерывно контролируют напряжение кислорода и строят (записывают) кривую 1, - периодически, например, через каждый час, считая от момента посева штамма, в пробирки с антисептиком (например: хлороформом или формалином) отбирают пробы культуральной жидкости и определяют в них остаточную концентрацию углеводов и строят кривую 2, - через два часа после наступления фазы стационарного роста культуры, которому соответствует участок PB на кривой 1, приступают к разбавлению культуральной жидкости в лабораторном ферментере вышеуказанной дополнительной питательной средой со скоростью 0,3 объема на объем культуральной жидкости в час (началу разбавления соответствует точка C на кривой 2), что приводит к прогрессирующему снижению концентрации углеводов в культуральной жидкости на фоне стабильности концентраций прочих питательных ве ществ, - в момент резкого повышения напряжения кислорода в культуральной жидкости (обозначенный стрелкой вблизи точки B на кривой 1) в пробирку с антисептиком отбирают пробу (10 15мл) культуральной жидкости и определенную в этой пробе остаточную концентрацию углеводов фиксируют как "минимально допустимую" для развития избранного штамма-продуцента Lлизина; приготовление стерильной питательной среды определенного состава и ее внесение в ферментер; посев избранного штамма-продуцента Lлизина; ферментацию, включающую: - раздельную подпитку ферментируемой биомассы свежей питательной средой, содержащей (отдельно) ростовые вещества и (отдельно) источники углерода (углеводы), проводимую с соблюдением следующи х условий: - во всех случаях биосинтеза L-лизина контролируют скорость прироста биомассы и скорость синтеза L-лизина и расходы указанных подпиток устанавливают с учетом соотношения указанных скоростей, - предпочтительно подпитку, содержащую углеводы, подают с расходом, обеспечивающим их концентрацию в культуральной жидкости в интервале 1,2 - 2,8 от упомянутого минимума, а подпитку, содержащую ростовые вещества, подают с учетом результатов контроля напряжения кислорода в культуральной жидкости с таким расходом, чтобы упомянутое напряжение было не менее 12мм рт.ст., а еще более предпочтительно в процессе ферментации в пробах культуральной жидкости периодически определяют отношение массы L-лизина к сухой биомассе штамма-продуцента и расход подпитки, содержащей ростовые вещества, регулир уют таким образам, что упомянутое отношение поддерживают в интервале 2,4 - 2,9г/г; - аэрацию и перемешивание культуральной жидкости, поддержание заданных значений температуры и pH среды; прекращение ферментации; удаление культуральной жидкости из ферментера и повторение процесса. Примеры определения минимально допустимых концентраций углеводов в культуральной жидкости. Пример 1мк. Определение минимально допустимой концентрации углеводов в культуральной жидкости для штамма Brevibacterium sp. ВНИИгенетика-90. В качестве источника углеводов использовали свекловичную мелассу с содержанием сахаров 46%. Были приготовлены: а) основная питательная среда следующего состава, г/л: б) дополнительная следующего состава, г/л: питательная среда В лабораторный ферментер емкость 1л внесли 350мл стерильной основной питательной среды. Стерильным концентрированным раствором аммиака установили pH в пределах 7,0 - 7,2. Температура питательной среды 30°C, расход воздуха на аэрацию 0,5л/мин., избыточной давление воздуха 0,02 МПа, число оборотов мешалки 600 в мин. После достижения указанных параметров в питательную среду внесли 30мл посевного материала. Культивирование продолжали до начала фазы стационарного роста, что соответствует в данном примере 14 - му часу (точка P на кривой 1 прилагаемого чертежа). Еще 2 часа продолжали ферментацию в том же режиме. На 16 - м часу роста начали вводить в ферментер стерильную дополнительную питательную среду со скоростью 120мл/час, Через 1,5 часа напряжение кислорода в культуральной жидкости резко возросло и за 8 минут увеличилось на 10мм рт.ст. (стрелка вблизи точка B на кривой 1). В этот момент в пробирку с 3 каплями хлороформа отобрали пробу культуральной жидкости объемом 15мл. Анализ пробы показал остаточную концентрацию сахаров в культуральной жидкости 4г/л как минимально допустимую (критическую) для данного продуцента лизина при использовании мелассы. Пример 2мк. Определение минимально допустимой концентрации углеводов в культуральной жидкости для штамма Brevibacterium lactofermentum НИТИА-88. Определение проводили, как в примере 1. Анализ пробы показал, что для данного штаммапродуцента лизина критическая концентрация сахаров мелассы в культуральной жидкости равна 5,5г/л. Пример 3мк. Определение минимально допустимой концентрации углеводов в культуральной жидкости для штамма Brevibacterium flavum E-531. Определение проводили, как в примере 1. Анализ пробы показал, что для данного штаммапродуцента лизина критическая концентрация сахаров мелассы в культуральной жидкости составляет 6,2г/л. Примеры биосинтеза L-лизина. Пример 16с. Биосинтез L-лизина с использованием штамма Brevibacterium sp. ВНИИгенетика-90 (1). Для получения посевного материала использовали стерильную питательную среду следующего состава, г/л: По 50мл указанной питательной среды внесли в колбы Эрленмейера емкостью 750мл и выращивали посевной материал в течение 24 часов при температуре 30°C на качалке при 250об/мин. Эксперименты по биосинтезу L-лизина предложенным способом проводили в четырех (А, Б, В и Г) лабораторных ферментерах емкостью 1л, оборудованных регулируемыми нагревателями со средствами контроля температуры, приспособлениями для аэрации с регулируемым расходом стерильного воздуха, мешалками с регулируемым числом оборотов, насосамидозаторами для раздельной подачи подпитки (в виде дополнительных питательных сред) и датчиками напряжения кислорода в культуральной жидкости, с использованием следующи х стерильных сред: а) основной питательной среды следующего состава, г/л: б) первой дополнительной питательной среды (как подпитки-источника ростовых веществ) следующего состава г/л: в) второй дополнительной питательной среды (как подпитки-источника углеводов) следующе го состава, г/л: г) 25% - го водного раствора аммиака (как средства коррекции pH культуральной жидкости и дополнительного источника азота). В каждый из ферментеров внесли по 200мл основной питательной среды, включили аэрацию с подачей одного объема воздуха на 1 объем жидкости в минуту и мешалку на 600об/мин, довели pH указанным водным раствором аммиака до 7,0 - 7,2, установили температур у на уровне 30 - 31град. C, внесли по 20мл посевного материала, содержащего указанный штамм-продуцент, и насосами-дозаторами начали подавать первую (с начальным расходом 4мл/ч) и вторую (с начальным расходом 0,5мл/ч) дополнительные (подпиточные) питательные среды. Затем с учетом показаний датчика напряжения (парциального давления) кислорода в культуральной жидкости подачу второй дополнительной питательной среды регулировали таким образом, чтобы указанное давление в период пуска поддерживалось около (но не ниже) 12мм рт.ст. во всех четырех ферментерах, а далее - со следующими вариациями: в ферментере А - с условием, чтобы концентрация сахаров в культуральной жидкости находилась в пределах от 1,2 до 2,8 от минимально допустимой; в ферментере Б - в пределах от 0,8 до 1,2; в ферментере В - в пределах от 2,8 до 3,5; в ферментере Г - в пределах от 3,5 до 4,5. Процессы прекращали после заполнения ферментеров культуральной жидкостью до уровня 700мл и фиксировали время, за которое этот уровень был достигнут. Для контроля в аналогичном ферментере Д, оборудованном лишь одним насосом-дозатором, с использованием того же штамма-продуцента проводили биосинтез L-лизина по способупрототипу. В этом контроле применяли две питательные среды: а) основную, содержащую, в г/л: б) дополнительную содержащую, г/л: (подпиточную), В ферментер Д внесли 400мл основной питательной среды, включили аэрацию с подачей одного объема воздуха на 1 объем жидкости в минуту и мешалку на 600об/мин, довели pH указанным водным раствором аммиака до 7,0 - 7,2, установили температуру на уровне 30 - 31град. C и избыточное давление 0,02 - 0,03МПа и внесли 40мл посевного материала, содержащего указанный штамм-продуцент. После запуска процесса в культуральной жидкости периодически (не реже одного раза за 4 часа) контролировали концентрацию сахаров и при ее падении до 1,0 - 1,5%, что соответствовало снижению интенсивности дыхания биомассы до 35 - 65% от максимального значения, периодически же (через каждый час) подавали указанную подпиточную среду с расходом 8 - 2мл за каждый впрыск, продолжавшийся 1 - 2 минуты, с таким расчетом, чтобы указанная концентрация возрастала до 1,5 - 2,0%. После достижения объема культуральной жидкости 700мл подпитку прекращали и, контролируя концентрацию сахаров и фиксируя длительность процесса, продолжали ферментацию до момента, когда указанная концентрация снижалась до 0,6%. В культуральных жидкостях во всех ферментерах общеизвестным методом определили концентрацию L-лизина в г/л и тривиальными вычислениями установили выход Lлизина (в %) в расчете на единицу массы потребленных при ферментации углеводов (сахаров). Сравнительные результаты приведены в таблице. Как видно из таблицы, предложенный способ при соблюдении условий раздельной подпитки и балансировки расходов подпиточных сред с учетом скоростей прироста биомассы и синтеза целевого продукта (ферментер А) обеспечивает наилучшие результаты биосинтеза L-лизина, а при раздельной подпитке (ферментеры В и Г) обеспечивает повышение концентрации L-лизина в культуральной жидкости и повышение производительности биосинтеза. Пример 2бс. Биосинтез L-лизина с использованием штамма Brevibacterium sp. ВНИИгенетика-90 (2). Посевной материал нарабатывали и биосинтез целевого продукта проводили, как описано в (1бс) для ферментера А, с теми отличиями, что: - на 20 - м часу ферментирования и далее через каждые 4 часа определяли соотношение массы лизина и сухой биомассы штаммапродуцента в культуральной жидкости и, - регулир уя расход второй дополнительной питательной среды, удерживали это соотношение в пределах 2,4 - 2,9г/г. Длительность ферментации до наработки 700мл культуральной жидкости составила 50ч, концентрация L-лизина в культуральной жидкости - 75г/л, а выход L-лизина от массы потребленных углеводов составил 50%. Пример 3бс. Биосинтез L-лизина с использованием штамма Brevibacterium lactofermentum НИТИА-88. Биосинтез целевого продукта проводили, как описано в (2бс), учитывая, что минимально допустимая концентрация углеводов в культуральной жидкости для указанного штамма равна 5,5г/л. Длительность ферментации до наработки 700мл культуральной жидкости составила 56ч, концентрация L-лизина в культуральной жидкости 72г/л, а выход L-лизина от массы потребленных углеводов составил 45%. Пример 4бс. Биосинтез L-лизина с использованием штамма Brevibacterium flavum E531. Биосинтез целевого продукта проводили, как описано в (2бс), учитывая, что минимально допустимая концентрация углеводов в культуральной жидкости для указанного штамма равна 6,2г/л. Длительность ферментации до наработки 700мл культуральной жидкости составила 54ч, концентрация L-лизина в культуральной жидкости 60г/л, а выход L-лизина от массы потребленных углеводов составил 45%. Приведенные примеры биосинтеза L-лизина с использованием разных штаммов-продуцентов подтверждают промышленную применимость предложенного способа.