Фофоліпідні похідні та композиція, яка має антиоксидантну та інгібуючу активність щодо пероксидів ліпідів

Изобретение относится к новому производному фосфолипида и фармацевтической композиции. Известно соединение, состоящее из аскорбиновой кислоты и альфатокоферрола, соединенных вместе остатком фосфорной кислоты, но до сих пор неизвестно соединение, включающее фосфолипид и аскорбиновую кислоту. Полагают, что активный кислород и пероксиды липидов являются факторами старения, старческих и други х заболеваний, вследствие этого они вредны для живых субъектов и должны быть удалены из живого организма. Для ингибирования или разрушения этих опасных веществ предложено использовать антиоксиданты изначально присутствующие в живом организме, например, витамин Е, аскорбиновую кислоту, уби хинон и мочевую кислоту. Однако ни один из них не отвечает полностью требованиям. Проведены исследования производных аскорбиновой кислоты. В результате добились успеха в синтезе некоторых производных аскорбиновой кислоты фосфолипидного типа, образующихся за счет простых и сложных эфирных связей глицерина с аскорбиновой кислотой через остаток фосфорной кислоты, и обнаружили, что указанные производные обладают антиокислительной активностью и ингибирующей активностью в отношении пероксидов липидов. Изобретение выполнено на основе этого и други х открытий. С одной стороны, изобретение обеспечивает производные фосфолипида формулы (I) или (II) в которых R1 и R2 могут быть одинаковы или различны и каждый радикал представляет алкильную или ацильную гр уппы. Метод получения производных фосфолипида формул I и II, приведенных выше, включает взаимодействие галофосфатного производного глицерина формулы (III) или (IV) в которых значения R1 и R2 те же. что и представлены выше, X представляет атом галогена и ни одна из формул не представляет какую-то специфическую конфигурацию или конформацию, с аскорбиновой кислотой, защищенной в положениях 5 и 6 и последующее снятие защиты с положений 5 и 6. Галофосфатные производные глицерина, упомянутые выше, могут быть получены при взаимодействии простого диэфира глицерина, сложного диэфира глицерина или простого моноэфира сложного моноэфира глицериновой формулы в которых R1 и R2 определены выше и ни одна из формул не представляет какую-то специфическую конфигурацию, а именно соединения, полученного из глицерина путем замещения двух из трех гидроксильных групп глицерина на R1 и R2, с галофосфорилирующим средством, например галоидангидридом фосфорной кислоты, таким как хлорангидрид фосфорной кислоты или бромангибрид фосфорной кислоты, в присутствии средства, вызывающего связывание кислоты. В качестве средства, вызывающего связывания кислоты, предпочтительны такие органические амины, как триэтиламин или пиридин. Защитная группа для защиты положений 5 и 6 аскорбиновой кислоты должна легко элиминироваться после завершения реакции, и предпочтителен, вариант, когда защитной группой является изопропилиденовая или ей подобная группа, хотя можно использовать в качестве защитной и ацильную группу, такую например, как ацетильная группа. Взаимодействие защищенной аскорбиновой кислоты с галофосфатним эфиром глицерина может протекать в мягких условиях, например при температуре от 0°С до комнатной температуры, в неполярном растворителе, таком как тетрагидрофуран (ТГФ), в присутствии вещества, связующего кислоту, такого как пиридин или триэтиламин. Снятие защитных групп может проводиться в мягких условиях. Так, например, защитная группа легко отщепляется при подкислении реакционной смеси неорганической кислотой, такой как соляная кислота, фосфорная кислота, серная кислота или органической кислотой такой как уксусная кислота или лимонная кислота. Кроме этого, изобретение обеспечивает антиоксидантный состав, включающий производное фосфолипида приведенных формул I или II. Исследование, проведенное создателями данного изобретения, показало, что оба соединения I и II обладают антиоксидантной активностью (см. примеры испытаний). Проведенные исследования показали, что соединения I и II могут быть использованы для различных целей в форме свободной кислоты или в виде нетоксичной соли, например, соли щелочного металла (например, соли натрия или соли калия) или соли щелочно-земельного металла (например, соли кальция, соли магния). Соединения по изобретению используются в качестве биологически активных антиоксидантов для предотвращения или лечения расстройств ишемического органа. Их назначают в форме, удобной для орального и неорального применения. Ожидают также, что они будут эффективны также в отношении катаракты, кожных заболеваний (например, аллергического дерматита) крапивницы, воспаления, вызванного ультрафиолетом) и т.д. Формы выпуска включают препараты для наружного применения - мази, растворы для офтальмологии, назальные препараты, кремы, растворы для инъекций, препараты для внутреннего применения и так далее. Эти препараты могут содержать обычно используемые ингредиенты, такие как например, наполнители, лекарственные среды, связующие, увлажняющие средства, дезинтегранты, лабриканты, диспергирующие средства, буферные растворы, поверхностно-активные вещества, изотонирующие средства, стабилизаторы и вещества , регулирующие рН. Кроме того, эти соединения могут быть использованы в косметике. Назначаемая доза может варьироваться в зависимости от соединения, формы выпуска, симптома, который необходимо лечить или который нужно предотвратить, и други х факторов. В основном, однако, составы, упомянутые выше, могут предпочтительно содержать от примерно 0,01 до 5%, более предпочтительно, от 0,1 до 3% соединения I или II. В случае растворов для инъекций, например, ежедневная доза может составлять 0,1-20 мг и вводиться она может одноразово; в случае препаратов для внутреннего применения, доза в количестве 1-100 мг может вводиться несколько раз в день; препараты для наружного применения могут, например выпускаться в виде 0,1-3% мазей. Соединения согласно изобретению могут быть добавлены в качестве антиоксидантов в пищевые продукты, такие как масло, маргарин, соевое масло и другие масла и в процесс приготовления рыбных и мясных продуктов, для предотвращения их распада. Количество добавок зависит от пищевого продукта и/или от специфичности соединения. В основном однако, рекомендуемое количество лежит в границах 0,01-5%, предпочтительно от примерно 0,02-3%. Антиоксидантный состав согласно изобретению может далее содержать другой или другие антиоксиданты и/или один или более фармакологически активных ингредиентов. Антиоксидантная активность. Антиоксидантная активность нескольких типичных представителей соединения изобретения было проверено согласно методу Стокса. Самцы крыс Wistan (примерно в 10-недельном возрасте) были использованы для проведения опытов. После проведения перфузии для удаления крови из мозга, мозговая ткань вырезалась и гомогенизировалась в 4-х кратном по массе 0,1 Μ фосфатном буферном растворе (рН 7,4) при охлаждении водой. Гомогенат центрифугировали при 1,000 x г в течение 10 мин и затем использовали надосадочную жидкость. Надосадочная жидкость мозгового гомогената разбавили 10 объемами фосфатного буферного раствора и 500 мл разбавленного раствора инкубировали при 37°С в течение 60 мин. Реакция была остановлена путем погружения тестируемой трубки в лед. После дальнейшего добавления 490 мл 0,1 Μ буферного фосфатного раствора провели анализ по методу ТВА. Количество липидных пероксидов определяли в единицах количества малондиальдегида (МДА) на мг протеина. Для анализа протеина использовали метод Лоури. Тестируемые соединения: (1) 1,2-0-дистеароил-3-глицерофосфорил-аскорбиновая кислота (2) 1,2-0-дипальмитоил-3-глицерофосфорил-аскорбиновая кислота (3) 1,2-0-дигексадецил-3-глицерофосфорил-аскорбиновая кислота (4) 1,2-0-дилауроил-3-глицерофосфорил-аскорбиновой кислоты соль калия (5) 1,3-0-дилауороил-2-глицерофосфорил-аскорбиновой кислоты соль калия. Результаты тестирования: Как видно из приведенных результатов испытаний, соединения изобретения сравнимы или превосходят по антиоксидантной активности витамин Е, в то время как аскорбиновая кислота в какой-то степени даже промотирует окисление. Лучшие способы исполнения изобретения. Синтез 1 исходных материалов. 3-0-Бензйлглицерин. 50 мл 50% (мас./об.) раствора гидроксида натрия добавили к 33 г (0,25 моля) бензил-хлорида, 1,38 г (4 миллимоля) бензилхлорида и 1,38 г (4 миллимоля) бензил-три-н-бути-ламмония. Смесь перемешивали при 100°С в течение 5 ч, затем охладили до комнатной температуры, разбавили 50 мл воды и проэкстрагировали эфиром. Экстракт промыли водой, после чего растворитель отгоняли при пониженном давлении. К остатку добавили 70 мл 15% (мас./об.) серной кислоты, и смесь перемешивали при 100°С в течение 2,5 ч. После охлаждения непрореагировавший материал проэкстрагировали петролейным эфиром, водный слой нейтрализовывали и затем проэкстрагировали этил-ацетатом и экстракт промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом натрия. Затем отогнали растворитель при пониженном давлении, получив при этом 21 г масла желтого цвета. Синтез 2 исходного материала. 1,2-0-Дистеароил-3-0-бензилглицерид. 3-0-Бензилглицерид(18,2 г 0,1 моля)и 17 мл сухого пиридина растворили в 50 мл сухого бензола. К раствору по каплям добавляли раствор 60 г (0,2 моля) стеароилхлорида в 100 мл сухого бензола при охлаждении и перемешивании. После завершения прикапывания смесь перемешивали при 60-70°С в течение 24 ч, Затем смесь проэкстрагировали водой последовательно, 0,2 г серной кислотой, насыщенным раствором гидрокарбоната натрия и водой и высушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отогнали при пониженном давлении, к остатку добавили этанол, и смесь оставили охлаждаться. Кристаллы выпавшего осадка отфильтровывали и перекристаллизовали из этанола, при этом получили 32 г кристаллов белого цвета. Точка плавления 52-54°С: ИК-спектр (КВr): 2900, 2840,1720,1180, 720 см -1. Синтез 3 исходного материала. 1,2-0-Дипальмитоил-3-0-бензилглицерид. 3-0-Бензилглицерид (18,2 г) запускают в реакцию с 55 г пальмитоилхлорида так же, как и в синтезе 2 исходного материала. В результате перекристаллизации сырых кристаллов из этанола получают 52 г кристаллов белого цвета. Точка плавления 40-42°С. Синтез 4 исходного материала. 1,2-0-Дилауроил-3-бензилглицерид. 3-0-Бензилглицерид (7 г) запускают в реакцию с 18,5 г глауроилхлорида также, как и в синтезе 2 исходного материала. В результате перекристаллизации сырых кристаллов из этанола получают 16 г кристаллов белого цвета. Точка плавления: 30-31°С. Синтез 5 исходного материала. 1,2-0-Дистеароилглицерид. 1,2-0-Дистеароил-3-0-бензилглицерид (22 г, 0,33 моля) растворяют в 300 мл н-гексана, добавляют 3 г 10% палладия, нанесенного на углеродную подложку и проводят каталитическое восстановление при комнатной температуре. После прекращения поглощения водорода, катализатор отфильтровывают и отгоняют растворитель при пониженном давлении. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из уксусного ангидрида, при этом получают 13 г кристаллов белого цвета. Точка плавления: 66-67°С; ИК-спектр (КВr): 3500, 2900, 2850, 1730, 1460, 1180,720 см -1. Синтез 6 исходного материала. 1,2-0-Дипальмитоил-3-бензилглицерид, 1,2-Дипальмитоил-3-0-бензилглицерид (20 г) обрабатывают так же, как и в синтезе 5 исходного материала. В результате перекристаллизации сырых кристаллов из н-гексан-этанольной смеси получают 16 г кристаллов белого цвета. Точка плавления: 62-63°С; ИК-спектр (KBr): 3500, 2900, 2840, 1740, 1465, 1180,720 см -1. Синтез 7 исходного материала. 1,2-дилауроилглицерид. 1,2-0-Дилауроил-3-0-бензилглицерид (16 г) обрабатывают так же. как в синтезе 5 исходного материала, и неочищенные кристаллы перекристаллизовывают из этанола, при этом получают 12 г кристаллов белого цвета. Точка плавления: 64-66°С; ИК-спектр (KBr): 3500, 2920, 2850, 1725, 1710, 1215, 1195,720 см -1. Синтез 8 исходного материала. 1.2-Дигексадецил-3-0-бензилглицерид. 3-0-Бензилглицерид (9,0 г, 0,05 моля) и 25 г(0,05 моля) 1-бромгексадекане растворяют в 50 мл сухого бензола, 8,8 г (0,16 моля) гидроксида калия добавляют к раствору и смесь нагревают с обратным холодильником в течение 16 ч при перемешивании. Реакционную смесь нейтрализуют, добавляя соляную кислоту, затем экстрагируют 50 мл этилацетата. Экстракт последовательно промывают 2,5% раствора гидрокарбоната калия и водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, при этом получают 35 г маслянистого остатка. Синтез 9 исходного материала. 1,2-0-Дигексадацилглицерид, 1,2-Дигексадецил-3-0-бензилглицерид (35 г) обрабатывают так же, как и в синтезе 5 исходного материала, неочищенные кристаллы перекристаллизовывают из этанола, при этом получают 7,2 г кристаллов белого цвета. Точка плавления: 49-50°С; ИК-спектр (KBr): 3480, 2920, 2850,1470,1120, 1080 см-1. Пример 1. 1,2-0-Дистеаролил-3-глицерофосфорил-аскорбиновая кислота. Сухой бензол (40 мл) добавляют к 3,15 г (5 миллимолей) 1,2-0-дистеароилглицерида и 2 мл сухого пиридина. К полученному раствору по каплям добавляют раствор 1,6 г хлорангидрида фосфорной кислоты в 20 мл сухого бензола при охлаждении льдом в течение 30 мин и затем при комнатной температуре в течение 6 ч. Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении. Для растворения остатка добавляют бензол (20 мл). Отдельно готовят раствор 3,3 г (15 миллимолей) изопропилиденаскорбиновой кислоты и 3 мл сухого пиридина в 50 мл сухого тетрагидрофурана. К этому раствору по каплям добавляют вышеуказанный бензольный раствор. Полученную смесь перемешивают при охлаждении льдом в течение 30 мин и затем при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении. К полученному таким образом маслянистому остатку (около 10 г) добавляют 100 мл этанола и 60 мл 1 н. соляной кислоты. Смесь перемешивают при 60°С в течение 30 мин для удаления диметилкетонной группы, затем охлаждают и экстрагируют зтилацетатом. Экстракт промывают насыщенным раствором хлорида натрия и сушат над безводным сульфатом натрия, и растворитель отгоняют при пониженном давлении. К остатку добавляют ацетон, смесь оставляют охлаждаться, и выпавший кристаллический осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из этанол-ацетонной смеси, получают при этом 1,5 г кристаллов белого цвета. Точка плавления: 98-100°С. Элементный анализ: Вычислено, %: С 62,62; Η 9,69; С45Н83О 13Р; Найдено, %: С 62,53; Η 9,61 Тонкослойная хроматография на силикагеле (проявляющий растворитель: хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода=30:10:2:1):Rf = 0,58. ИК-спектр (KBr): 3900 (широкая полоса), 2910, 2840, 1740, 1470, 1105 см-1. Пример 2. 1,2-0-Дипальмитол-3-глицерофосфориласкорбиновая кислота. 1,2-0-Дипальмитоилглицерид (2,9 г) обрабатывают так же, как в примере 1. После перекристаллизации из этанол-ацетонной смеси получают 1,8 г кристаллов белого цвета. Точка плавления: 95-97°С. Тонкослойная хроматография на силикагеле (проявляющий растворитель: хлороформ-метанол-уксуная кислота-вода 30:20:2:1):Rf = 0,55. ИК-спектр (KBr): 3400 (широкая полоса), 2920, 2850, 1740,1060 см -1. Пример 3. 1,2-0-Дигексадецил-3-глицерофосфориласкорбиновая кислота. 1,2-0-Дигексадецилглицерид (2,7 г) обрабатывают так же, как в примере 1. После перекристаллизации из этанол-ацетатной смеси получают 1,7 г кристаллов белого цвета. Точка плавления 61-63°С; тонкослойная хроматография на силикагеле (проявляющий растворитель: хлороформ-этанол-уксусная кислота-вода = 30:20:2:1):Rf = 0,53; ИК-спектр (KBr): 3400 (широкая полоса), 2925,2850, 1470, 1130 см -1. Пример 4. Калиевая соль 1,2-0-дилауроил-3-глицерофосфориласкорбиновой кислоты. 1,2-0-Дилаурилглицерид (4,6 г) обрабатывают так же, как в примере 1. Нужный продукт, полученный в виде масла, растворили в 100 мл этанола. К раствору по каплям добавляли постепенно этанольный раствор гидроксида калия до тех пор, пока рН раствора не стало нейтральным, при этом вырастает кристаллический осадок белого цвета. Кристаллы отфильтровывают и перекристаллизовывают из циклогексан-ацетонной смеси, при этом получают 3,5 г кристаллов белого цвета. Точка плавления: 100-102°С; тонкослойная хроматография на силикагеле (проявляющий растворитель: хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода = 30:20:2:1):Rf =0,71. ИК-спектр (KBr): 3400 (широкая полоса), 2920, t850, 1730, 1600, 1240, 1095 см-1. Пример 5. Калиевая соль 1,3-0-дилауроил-2-глицерофосфориласкорбиновой кислоты. 1,3-0-Дилауроилглицерид (4,5 г) обрабатывают так же, как в примере 4. После перекристаллизации из гликогексан-ацетоновой смеси получают 3,5 г кристаллов белого цвета. Точка плавления: 102-104°С; тонкослойная хроматография на силикагеле (проявляющий растворитель: хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода = 30:10:2:1): Rf = 0,73. ИК-спектр (KBr): 3400 (широкая полоса), 2930, 1650, 1730, 1600, 1240, 1095 см -1. Пример 6. 1,3-0-Диэтил-2-глицерофосфориласкорбиновая кислота. 1,3-0-Диэтилглицерид обрабатывают так же, как в примере 1, получают при этом масло. Это масло очищают хроматографически на колонке из силикагеля (Merck Аг-9385, 200 г; проявляющий растворитель: хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода =30:10:2:1). В результате получают примерно 3 г нужного продукта в виде масла. Тонкослойная хроматография на силикагеле (проявляющий растворитель: хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода =30:10:2:1):Rf = 0,59; ИК-спектр (чистый): 3450 (широкая полоса), 2960, 1765, 1690, 1390, 1220, 1070 см -1. Следующие примеры формы выпуска далее иллюстрируют данное изобретение. Форма выпуска для примера 1. Таблетки для внутреннего применения. Таблетки, каждая массой 160 мг, получают стандартным образом, используя вышеприведенные ингредиенты. Если необходимо, они могут быть покрыты сахарной оболочкой. Форма выпуска для примера 2. . Инъекционный раствор получают традиционным способом, используя вышеперечисленные ингредиенты. Раствор стерилизуют методом бактериальной фильтрации и разливают по 2 мл в стеклянные ампулы, которые затем запаивают. Форма выпуска для примера 3. Офтальмологический раствор получают традиционным способом, используя вышеперечисленные ингредиенты. Форма выпуска для примера 4. Мазь получают традиционным способом, используя приведенные ингредиенты. Формы выпуска для примера 5. Крем получают традиционным способом, используя вышеприведенные ингредиенты. Промышленное применение. Производные фосфолипида согласно изобретению обладают антиоксидантной активностью, вследствие этого, применимы как биологически активные антиоксиданты для предотвращения или лечения заболеваний ишемического органа. Они могут быть также эффективно использованы при лечении катаракты, кожных заболеваний (например, аллергического дерматита, крапивницы, воспалений, вызванных ультрафиолетовым облучением) и т.д. Кроме того, они с успехом могут быть использованы в качестве антиоксидантов для предотвращения порчи пищевых продуктов.