Бромід 1-(b-фенілетил)-4-(п-диметиламінобензиліденаміно) -1,2,4-триазолію, що має антиоксидантну, протиішемічну, b-адреноблокувальну, утеротонічну та знижуючу внутрішньоочний тиск дію

Бромид 1-(b-фенилэтил)-4-(п-диметиламинобензилиденамино)-1,2,4-триазолия формулы Настоящее изобретение относится к медицине и фармации, в частности к новым биологически активным соединениям, являющимися основой для создания лекарственных препаратов с широким спектром биологической активности. Известны лекарственные препараты обладающие антиоксидантной активностью: дибунол, a-токоферол (М.Д. Машковский "Лекарственные средства", Москва, "Медицина", 1994, т. 2, с. 213215; 34-36). Указанные препараты не обладают противоишемическим, b-адреноблокаторным, утеротоническим и снижающим внутриглазное давление действиями. Кроме того у них недостаточно высока антиоксидантная активность. Известен лекарственный препарат пирацетам, обладающий противоишемической активностью (М.Д. Машковский "Лекарственные средства", Москва, "Медицина", 1994, т. 1, с. 132-135). Недостатком этого препарата является узкоограниченность биологической активности и недостаточно высокая противоишемическая активность. Известно применение b-адреноблокаторного средства - анаприлин (Методические рекомендации по экспериментальному доклиническому изучению b-адреноблокирующих соединений, Москва, 1984 г., с. 16). Недостатком является узкоограниченность применения и малая эффективность. Известен лекарственный препарат обзидан, который обладает b-блокирующим действием, снижает внутриглазное давление, но не оказывает антиоксидантного действия (М.Д. Машковский "Лекарственные средства", Москва, "Медицина", 1994, т. 1, с. 330-332). Известны близкие по строению биологически активные вещества производные 1,2,4-триазола по А.С. СССР № 1637253, № 1638993, № 1681498, они же по патентам Украины № 2446, № 2444, № 2439, кл. С07D249/08, А61К31/41. Указанные аналоги обладают антикоагулянтной, фибринолитической и антиишемической активностью, но ни один из них не обладает антиоксидантным, b-адреноблокаторным, утеротоническим и снижающим внутриглазное давление действиями. Ближайшим структурным аналогом предлагаемого соединения является бромид 1-(1-карбоксиэтил)-4-(п-диметиламинобензилиденамино)1,2,4-триазолия, обладающий антиоксидантной активностью (A.C. № 1637254 от 22 ноября 1990 г.). Недостатком этого аналога является узкоограниченный спектр биологической активности. (19) UA (11) 28494 (13) A обладающий антиоксидантним, противоишемическим, b-адреноблокирующим, утеротоническим и снижающим внутриглазное давление действием. 28494 В основу изобретения поставлена задача создания нового биологически активного вещества с максимально расширенным спектром фармакологической активности, превосходящей по эффективнсти известные лекарственные препараты. Решение этой задачи обеспечивает получение бромида 1-(b-фенилэтил)-4-(п-диметиламинобензилиденамино)-1,2,4-триазолия (АЕ-401), который проявляет антиишемическую и антиоксидантную, b-адреноблокирующую, утеротоническую активность и снижает внутриглазное давление. Антиоксидантную и противоишемическую активность предлагаемого соединения изучали на модели ишемии головного мозга, вызванную односторонней перевязкой общей сонной артерии у белых крыс линии Вистар, массой 280-300 г, обоего пола. Соединение и эталоны сравнения вводились один раз в сутки, в течение 4 суток, параллельно формированию ишемии, следующим образом: АЕ-401, в дозе 1,65 мг/кг, внутрибрюшинно; дибунол – 50 мг/кг, внутрибрюшнно; a-токоферол 50мг/кг, подкожно; пирацетам - 100 мг/кг, внутрибрюшинно. На 4 сутки, после последнего введения препаратов, животных декапитировали. Для исследования брали кусочки ишемизированного полушария головного мозга. Об антиоксидантной активности исследуемого соединения судили по снижению накопления в тканях головного мозга продуктов свободнорадикального окисления - диеновых коньюгатов (ДК) (Коган B.C., Орлов О.Н., Прилипко Л.Л. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов. - М.: Медицина, 1986 – 260 с.), триенкетонов (ТК) (Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. - М.: Медицина, 1989. – 368 с.), малонового диальдегида (МДА) (Андреева Л.Н., Кожемякин Л.А,, Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело. - 1988. - № 11. - С. 41-44), а также по снижению торможения активности антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы (СОД) (Чевари С., Чабай, Секей И. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод ее определения в биологических материалах // Лаб. дело. - 1986. - № 11. - С. 678-681), каталазы (Королюк М.А. Способ определения каталазы // Лаб. дело. - 1988. - № 1. - С. 16-18), глутатионпероксидазы (ГПР) (Гаврилова А.Р., Хмара Н.Ф. Определение активности глутатионпероксидазы эритроцитов при насыщающих концентрациях субстрата // Лаб. дело. - 1986. - № 12. - С. 721-723), а также по сохранению запасов эндогенного aтокоферола (Беленичев И.Ф., Тишкин В.С. Способ определения a-токоферола в биологическом материале // Тез. докл. 4 науч. съезда специалистов по клинической лабораторной диагностике республики Беларусь, 17-18 сентября 1992 г., г. Гродно. - Гродно: Б.И., 1992. - С. 72). О противоишемической активности предлагаемого соединения судили по нормализации некоторых показателей углеводного обмена - лактата, пирувата и малата (Современные методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / Под ред. М.И. Прохоровой. - Л.: Издво Ленинградского университета. – 1982. – 272 с.), а также по снижению гиперферментемии церебрального изоэнзима креатинфосфокиназы (ВВКФК) (Яровая Г.А., Доценко В.Л., Заболоцкий Н.Н. Распределение изоферментов методом ионнообменной хроматографии на микроколонках // Методы разделения и анализа в биохимии. - М. РИОЦИОЛУВ, 1982. - С. 37-40). Как видно из данных, представленных в табл. 1 и 2, предлагаемое соединение снижает образование продуктов свободно-радикального окисления: ДК - на 49,3%, ТК - на 55,7%, МДА - на 55,9% (а известные антиоксиданті a-токоферол и Предлагаемое соединение отличается от структурного аналога наличием в 1-м положении b-фенилэтильного радикала вместо 1-карбоксиэтильного. Для иллюстрации данного изобретения приводим пример постадийного получения предлагаемого соединения. Пример 1. Стадия 1. Бромид 1-(b-фенилэтил)4-амино-1,2,4-триазолия. Смесь, состоящую из 5,04 г (0,06 м) 4-амино-1,2,4-триазола и 11,1 (0,06 м) b-бромэтилбензола в 30 мл нитрометана кипятят в течение 8 часов. После этого растворитель отгоняют и выделяют целевой продукт. Полученное соединение перекристаллизовано из 15 мл бутанола. Выход: 15,7 г(92%). Желтоватое вещество, растворимое в низших спиртах, диметилформамиде, диоксане, нерастворимо в гексане и эфире. Тпл. 93-97°С Найдено, %: С 44,4; Н 4,9; Вr 29,8; N 20,7 С10Н13ВrN4. Вычислено, %: С 44,6; Н 4,86; Вr 29,7; N 20,8. ИК-спектр: 1610 см-1(nС=Н ); 3000 см-1 (gCH ар.); 3250 см-1 (NH2). Пример 2. Стадия 2. Бромид 1-(b-фенилэтил)4-амино-1,2,4-триазолия растворяют в 20 мл этанола. К полученному раствору прибавляют 2,98 г (0,02 м) п-диметиламинобензальдегида и 2-3 капли концентрированной хлористоводородной кислоты. Реакционную смесь оставляют на сутки, выделенный продукт перекристаллизовывают из смеси вода-этанол 6:1 либо из смеси ацетонэтанол 5:1. Выход: 6,8 г(85%). Желтое (морковно-желтое) кристаллическое вещество, трудно растворимо в воде, растворимо в низших спиртах, диметилформамиде, нерастворимо в гексане и эфире. Тпл. 168-171°С Найдено, %: С 56,8; Н 5,2; Вr 20,2; N 17,5 C19H22BrN5. Вычислено, %: С 57,0; Н 5,5: Вr 19,95; N 17,5. ИК-спектр: 1610см-1 (nС=Н); 3000 см-1 (gCH ар.). Предлагаемое соединение обладает антиоксидантной, b-адреноблокирующей, противоишемической, утеротонической активностью и снижает внутриглазное давление. ЛД50 соединения АЕ-401 составляет 165(140190) мг/кг при внутрибрншинном введении крысам. 2 28494 где Е - эффективность контрактильной способности матки, выраженная в деловых единицах; S знак суммы; А - амплитуда единичного сокращения; К - коэффициент (определяется калибровкой); t - время регистрации гистерограмм; r – длительность схватки. На основании полученных данных строили кривую доза-эффект, по которой находили основные характеристики лекарственного вещества: ЕД50 (средняя эффективная доза), ЕД70 (верхняя точка линейного участка кривой), ЕД100 (субмаксимальная доза, которая приведена в таблице 5). Характеристики кривой доза-эффект свидетельствуют, что для соединения АЕ-401 присуще более крутое нарастание фармакологического эффекта и его субмаксимальная доза (доза, вызывающая полное восстановление сократительной функции матки) ниже, чем у обзидана. Таким образом, соединение АЕ-401 обладает выраженным утеротоническим действием и по силе своего эффекта превышает известный bадреноблокатор обзидан. Фармакологическую активность соединения АЕ-401 по снижению внутриглазного давления изучали на модели простагландиновой гипертензии у кроликов породы "Белый великан". В работе исследовали действие препаратов на трех группах животных с модельной патологией: 1 группа – применение 0,25% АЕ-401; 2 группа - 0,1% обзидан; 3 группа - контрольная. Изучаемый препарат инстиллировали в правый глаз кролика, а через 60 минут в оба глаза субконъюнктивально вводили 0,1 мл (0,5 мл) простагландина F (Бунин А.Я., Яковлев А.А., Кошлев Н.А. // Вест. офтальмол. – 1976. - № 2. - С. 20-25). Внутриглазное давление (ВДГ) измеряли через каждый час, на протяжении 5 часов. Сравнивали показатели экспериментального правого и контрольного левого глаза, в который закапывали физиологический раствор. Офта-льмотонус определяли тонометром Маклакова (Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению b-адреноблокирующих соединений, предлагаемых для клинических испытаний в качестве антиангинальных, антиаритмических, антигипертензивных и антиглаукомных средств. - М., 1984. – 16 с.). Изучали истинное ВГД (Р0), продукцию водянистой влаги (F). Динамика гидродинамических показателей под влиянием инстилляций 0,25% АЕ-401 и 0,1% обзидана при простагландиновой гипертензии представлена в табл. 6. Как видно из представленной таблицы, через 1 час после введения простагландина отмечается подьем истиного ВГД при инстилляции АЕ-401 на 30%, обзидана на 22%, а в контрольных глазах на 42%. Через 2 часа после введения простагландина истинное ВГД при инстилляции АЕ-401 остается повышенным на 10%, на фоне обзидана - возвращается к исходному уровню, а в контрольных глазах остается повышенным на 30%. При дальнейшем наблюдении отмечается уменьшение истинного ВГД ниже исходного значения при инстиляции обоих препаратов, в то время как в контрольных глазах отмечалось повышение истинного ВГД на 4,7%. Соединение АЕ-401 уменьшает продукцию водянистой влаги в первые 3 часа в среднем в 1,3 раза а на четвертом часу в 2,2 раза по сравне дибунол на 4,2% и 18,7%, на 19,3% и 27,4%, на 23,7% и 29,2% соответственно), каталазы на 74,4%, ГПР на 223,0%, защищает запасы aтокоферола на 280,4% (a-токоферол и дибунол практически не влияют на активность антиоксидантних ферментов, защищают запасы aтокоферола на 57,2% и 29,4% соответственно. Из данных, представленных в табл. 3, видно, что предлагаемое соединение снижает уровень лактата на 28,9%, и повышает уровень пирувата на 90,9%, малата на 70%, тем самым нормализуя отдельные звенья углеводного обмена (противоишемическое средство пирацетам снижает лактат на 14,9%, повышает уровень пирувата и малата на 72,7% и 85% соответственно); снижает гиперферментемию ВВ-КФК на 50% (пирацетам на 21,5%). Таким образом, новое соединение бромид 1(b-фенилэтил)-4-(п-диметиламинобензилиденамино)-1,2,4-триазолия превышает по выраженности антиоксидантного эффекта дибунол и a-токоферол, а по выраженности противоишемического действия - пирацетам. b-адреноблокирунщая активность изучалась по снижению тахикардии, вызванной изадрином (метод. рекомендации по экспериментальному доклиническому изучению b-адреноблокирующих соединений, предлагаемых для клинических испытаний в качестве антиангинальных, антиаритмических, антигипертензивных и антиглаукомных средств. - М., 1984. – 16 с.). Исследуемое соединение вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мкг/кг, анаприллин в дозе 2,5 мкг/кг после введения изадрина. Как видно из данных, представленных в табл. 4, соединение АЕ-401 снижает тахикардию, вызванную изадрином на 27,8%, а эталонный bадреноблокатор анаприллин - на 12,1%. Таким образом, по выраженности b-адреноблокирующей активности, соединение АЕ-401 превосходит эталонный b-адреноблокатор. Сравнительная оценка утеротонического влияния нового соединения АЕ-401 и b-адреноблокатора обзидана проведена на модели изолированного рога матки крысы. Опыты выполнены на самках крыс линии Вистар массой 220-240 г. За 24 часа до опыта животным внутримышечно вводили диэтилстильбестрол в дозе 0,1 мг/кг. После обескровливания под эфирным наркозом препарированный рог матки помещали в ванночку с раствором Локка при температуре 37°С. Исходная нагрузка составляла 750 мг. Регистрацию сокращений рога матки осуществляли с помощью механотрона бмх1С и самописца Н 388-1, Установившиеся спонтанные сокращения подавляли добавлением в раствор адреналина в концентрации 1´10-7 г/мл. Наблюдали дозозависимую способность восстанавливать сократительную деятельность матки при различных концентрациях обзидана и соединения АЕ-401. Для оценки результатов использовали интегральный показатель – эффективность сократительной деятельности, рассчитываемый по формуле: KSA r E= , t 3 28494 нию с контролем. Введение обзидана уменьшало продукцию влаги в 1,8-1,9 раза в течение первых двух часов. Таким образом, соединение АЕ-401 обладает антиглаукомным действием, превышая эталонный препарат как по силе, так и по длительности эффекта. Таким образом, предлагаемое соединение АЕ401 обладает антиоксидантним, противоишемическим, b-адреноблокирующим, утеротоническим, снижающим внутриглазное давление действием и по силе эффекта превосходящим известные фармакологические эталоны. Таблица 1 Влияние соединения АЕ-401 на содержание продуктов свободно-радикального окисления в тканях головного мозга Группы животных Интактная группа Односторонняя перевязка общей сонной артерии (контроль) АЕ-401 a-токоферол Дибунол Контроль ДК мкм/г ткани 3,15+0,26 % изм. 5,09+0,38 2,58+0,23* 4,77+0,19 4,05+0,15* 4,96+0,12 ТК мкм/г ткани 0,61+0,013 % изм. 1,31+0,024 -49,3 -4,2 -18,7 0,58+0,034* 1,00+0,034 0,90+0,054* 1,24+0,062 МДА мкм/г ткани 0,53+0,025 % изм. 1,16+0,025 -55,7 -19,3 -27,4 0,51+0,022* 1,51+0,05* 1,39+0,07* 1,97+0,04 -55,9 -23,7 -29,2 * - р£0,05. Таблица 2 Интактная группа Односторонняя перевязка общей сонной артерии (контроль) АЕ-401 a-токоферол Дибунол Контроль % изм. -токоферол мкм/г/ткани % изм. ГПР мкм/мг/белка мин. % изм. Каталаза мкм/мг/белка мин. Группы животных СОД у.е./мг/белка мин. Влияние соединения АЕ-401 на состояние антиоксидантной системы в тканях головного мозга 238,4+ +26,8 6,70+ +0,25 95,2+ +0,89 4,16+ +0,18 113,0+ +13,0 4,86+ +0,31 36,4+ +0,47 % изм. 2,76+ +0,27 280,8+ +22,6* 110,7+ +2,4 111,1+ +4,1 105,0+ +2,7 +147,7 +5,3 +5,8 8,43+ +0,24* 5,25+ +1,0 5,69+ +2,4 4,85+ +0,07 +74,4 +15,3 +17,3 * - p£0,05. 4 117,6+ +0,89* 36,6+ +2,3 36,8+ +2,7 34,9+ +2,4 +223,0 +4,8 +4,9 10,5+ +0,32* 5,66+ +0,27* 4,66+ +0,27* +280,4 +57,2 +29,4 28494 Таблица 3 Интактная группа Односторонняя перевязка общей сонной артерии (контроль) % изм. ВВ-КФК ммоль/л/час % изм. Малат мкм/г/ткани Группы животных Пируват мкм/г/ткани Лактат мкм/г/ткани мин. Влияние соединения АЕ-401 на содержание продуктов углеводного обмена в тканях мозга и активность церебрального изоэнзима креатин-фосфокиназы в сыворотке крови % изм. 4,69+ +0,18 0,26+ +0,03 0,33+ +0,02 0,055+ +0,005 8,75+ +0,49 0,11+ +0,01 0,20+ +0,01 0,12+ +0,02 6,22+ +0,32* 7,44+ +0,62* АЕ-401 Пирацетам % изм. -28,9 -14,9 0,21+ +0,02* 0,19+ +0,02* +90,9 +72,7 Контроль 0,34+ +0,02* 0,37+ +0,01* +70,0 +85,0 0,06+ +0,005* 0,08+ +0,03* 0,102+ +0,06 -50,0 -21,5 * - р£0,05. Таблица 4 Влияние соединения АЕ-401 на число сердечных сокращений (ЧСС) Группы животных Интакт Изадрин Анаприллин АЕ-401 ЧСС уд/мин 302,4+15,9 429,0+11,2 377,5+18,2* 310,0+24,0* % изм. -12,1 -27,8 Таблица 5 Характеристики кривой доза-зффект утеротонического действия соединения АЕ-401 на фоне угнетения сократительной функции адреналином Характеристики кривой дозаэффект ЕД50 (г/мл) ЕД70 (г/мл) ЕД100 (г/мл) Обзидан -7 2,2×10 7,0×10-7 4,6×10-7 Соединение АЕ-401 7,8×10-7 8,1×10-7* 1,1×10-7* n=14; * - р£0,05. Таблица 6 Динамика гидродинамических показателей под влиянием соединения АЕ-401 при простагландиновой гипертензии Показатели F Группы До введения AE-401 обзидан контроль АЕ-401 обзидан контроль 12,5+0,41 12,5+0,41 12,7+0,42 0,80+0,12 0,85+0,13 10,81+0,11 1 16,3+0,53* 15,2+0,43* 18,0+0,52 1,5+0,13 0,99+0,10* 1,8+0,12 * - р£0,05 по сравнению с контролем. 5 Время после введения ПГF/час 2 3 4 13,8+0,32* 12,1+0,40 11,9+0,42 12,5+0,71* 11,8+0,38 12,2+0,34 16,6+0,62 12,9+0,81 13,3+0,4 1,0+0,10* 0,62+0,03 0,40+0,19* 0,77+0,12* 0,62+0,11 0,70+0,13 1,5+0,11 0,81+0,07 0,94+0,16 28494 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 6