Спосіб визначення алергену у хворих на лікарську хворобу

Способ определения аллергена у больных лекарственной болезнью путем исследования крови, отличающийся тем, что эритроциты исследуют с 28518 методов выявления сенсибилизации организма к лекарственным препаратам весьма перспективен. Принцип постановки всех известных иммунологических специфических тестов основан на взаимодействии комплекса антиген (лекарственный аллерген) - антитело с иммунокомпентентными клетками преимущественно белой крови (лимфоциты, сегментоядерные лейкоциты), по степени изменения которой (агломерации, альтерации, трансформации и т.д.) судят о развитии сенсибилизации. В последние годы появились данные о том, что при аллергии участие принимают не только клеточные элементы белой крови, но и эритроциты (Г.М. Столяр, В.И. Никифоров "Об участии эритроцитов в реакции аллергизации". Труды Горьковского медицинского института, 1975, вып. 65, с. 235-240). Особенности строения, способность изменять и восстанавливать свой объем и форму позволяют эритроциту иметь доступ в самые отдаленные участки микроциркуляторного русла, куда, он переносит с собой кислород и углекислый газ. Поскольку эритроцит обладает чрезвычайно активной в биологическом смысле мембраной с мощным рецепторным аппаратом, то это дает ему возможность принимать участие в процессах поддержания тканевого и иммунного гомеостаза (Кирдей Е.Г., Нечаев В.И., Федосеев А.П. и др. Влияние разрушенных эритроцитов и гранулоцитов на формирование клеточного иммунного ответа. Иммунология, 1985, 3, с. 75-76; Ольшанский А.Я., Одинакова В.А., Квитко Н.Н. Эритроцит в тканевом и иммунном гомеостазе. Сов. медицина, 1984, 11, с. 43-48). Известно, что, помимо того, что эритроцит несет на своей поверхности такие структуры, как рецепторы для С3 компонента комплемента и Fс фрагмента иммуноглобулина G, имеющие важное значение для иммунных реакций, он может еще пассивно адсорбировать на себе большое количество антигенов (Гургенидзе Г.В., Долидзе Е.И., Чиковани М.А. Функциональная характеристика системы эритрона при аллергических заболеваниях. Актуальные вопросы аллергологии, вып. 3, Ташкент, 1974, с. 43-47; Одинокова В.А., Палеев Н.Р., Квитко Н.Н., Ольшанский А.Я. Роль эритроцитов в развитии иммунного ответа при инфекционно-аллергическом миокардите. Сов. медицина, 1982, 4, с. 54-57; Одинокова В.А., Каликштейн Д.Б., Мороз Л.А. и др. Эритроциты при некоторых аллергических заболеваниях. Лаб. дело, 1985, № 6, с. 344-347). При этом поступление в ткани адсорбированного на эритроцитарной поверхности антигена служит разрешающим фактором в иммунном процессе (Кирдей Е.Г., Нечаев В.И., Федосеев А.П. и др. О механизме деструкции эритроцитов при иммунизации. Гематология и трансфузиология, 1984, 12, с. 21-24). В имеющихся немногочисленных работах, посвященных исследованию роли эритроцитов в иммунном ответе, подчеркивается, что эритроциты являются не только переносчиком антигена, но и одной из главных мишеней атаки иммунной системы против него (Ольшанский А.Я., Одинокова В.А., Квитко Н.Н. Эритроцит в тканевом и иммунном гомеостазе. Сов. медицина, 1984, 11, с, 43-48). С учетом всего вышесказанного, следует отметить, что известны лишь единичные работы, посвященные важной роли эритроцитов при аллергии к химическим средствам и при лекарственной болезни. В частности, имеется сообщение об изучении кислотной резистентности эритроцитов по методу эритрограмм (Терсков И.А., Гительзон И.И. Метод химических (кислотных) эритрограмм. Биофизика. - 1957. - 2(2), - С. 259-266) у подростков, которые работали при сборке и монтаже радиодеталей и имели контакт с аэрозолем свинца, ксилола, толуола (Каганович Д.И., Анисичкина З.Ф. Эритрограммы как метод выявления влияния малых концентраций химических веществ на организм подростков. Гигиена и прозаболевания. - М. 1972. - С. 131-134). Известна публикация по использованию метода кислотных эритрограмм с лекарственными аллергенами для этиологической диагностики лекарственной болезни (Солошенко Э.Н., Мацкивский В.И., Пипа Е.А. и др. Использование метода кислотных эритрограмм с лекарственными аллергенами для специфической диагностики лекарственной болезни. Дерматология и венерология. - Киев: Здоров'я, 1885. - Вып. 20. С. 33-36), который принят нами за прототип. Сущность метода заключается в фотоэлектрическом измерении кинетики гемолиза эритроцитов под действием гемолитического вещества по падению оптической плотности с предварительной инкубацией эритроцитов с лекарственным аллергеном. Оценка результатов осуществляется в условных единицах по разнице времени гемолиза в контрольных и опытных образцах крови. Однако этот метод кислотных эритрограмм громоздкий, не автоматизирован и потому, как и другие известные иммунологические методики, имеет существенный недостаток - длительность выполнения и обработки полученных результатов, что затрудняет его применение для экспресс-диагностики. Задача, положенная в основу изобретения, решается тем, что в известном способе определения лекарственного аллергена у больных лекарственной болезнью, включающей исследование крови, согласно изобретения, эритроциты исследуют с помощью ультразвука, для чего перед центрифугированием в один из образцов цитратной крови обследуемого больного дополнительно вводят физиологический раствор (контрольный образец), а в другой - лекарственный аллерген в концентрации 250 мкг/мл (опытный образец), после чего их инкубируют при 37°С в течение 10 минут, центрифугируют 10 минут при 6000 об/ мин, и измеряют величину поглощения ультразвука эритроцитами, при этом лекарственный аллерген определяют как специфический при разнице уровня поглощения ультразвука в контрольной и опытных пробах, равной 1 в усл. ед. и более или 20% и более. Благодаря таким отличиям достигается сокращение сроков диагностики лекарственной болезни, повышение чувствительности и точности определения лекарственного аллергена у больных лекарственной болезнью, что и является техническим результатом. Предлагаемый способ определения аллергена у больных лекарственной болезнью реализуется с помощью ультразвуковой установки, схема которой изображена на рисунке (фиг.). Установка 2 28518 состоит из ультразвукового эхоофтальмоскопа ЭОС-22 (1) с экраном (2), где отображается характеристика отраженных ультразвуковых сигналов, а также приставки, представляющей собой стандартный микроскоп (3) с вертикально перемещающимся тубусом (4), в котором фиксируется закрепленный в него ультразвуковой зонд эхоофтальмоскопа (5), соединенный с ультразвуковым эхоофтальмоскопом соединительным кабелем (6). На рабочем столе (7) микроскопа (3) имеется рабочая площадка (8), изготовленная из оргстекла на трех опорах, что обеспечивает регулировку ее перпендикулярности по отношению к оси движения ультразвукового зонда (5). На рабочей площадке (8) микроскопа (3) имеются две параллельные выемки (пазы), в которые плотно вставляется кювета (9), выполненная также из оргстекла и разделенная на восемь ячеек, в каждую из которых заносятся пробы (контрольный и опытные образцы), подлежащие исследованию. Кювета и все ее перегородки изготовлены из одного листа материала, что обеспечивает плоскопараллельность верхней и нижней стенки, стабильность толщины склейки, плотность акустического затухания и переходных характеристик, в результате чего достигается высокая повторяемость параметров ультразвуковых измерений. Поглощающая способность эритроцитов определяется при помощи ультразвукового эхоофтальмоскопа (1). В качестве источника ультразвуковых колебаний используется ультразвуковой зонд (5) с частотой излучения 10 МГц мощностью 50 Ватт. Ультразвуковой зонд (5) работает в импульсном режиме и воспринимает амплитуду отраженного сигнала. Величина амплитуды отраженной волны и положение ультразвукового зонда (5) относительно дна камеры регистрируется на экране (2) эхоофтальмоскопа (1). Пики амплитуд отраженного сигнала от эритроцитов больных в контрольной пробе (без аллергена) сравниваются с амплитудами отраженного сигнала в опытной пробе (в присутствии аллергена) и находится разница, которую выражают в условных единицах или в процентах. При разнице амплитуд контрольной и опытной проб обследуемого, равной 1 (в усл.ед.) и более (или 20% и более), исследуемый лекарственный аллерген определяется как специфический и диагностируется лекарственная болезнь. Для контроля точности полученных результатов поглощающая способность эритроцитов исследуемых больных измеряется относительно дистиллированной воды, которая всегда постоянна. Кроме того, пики амплитуд отраженных сигналов для эритроцитов исследуемых больных сравниваются с амплитудами отраженных сигналов, полученных при исследовании здоровых лиц. Способ осуществляют следующим способом. Исследуемую кровь забирают утром натощак из локтевой вены. Для предотвращения коагуляции в пробирку для взятия крови предварительно наливают 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 1:6. Затем по 1,5 мл цитратной крови обследуемого помещают в специальные кюветы из органического стекла с плоским полированным дном. В кювету с контрольным образцом добавляют 0,2 мл физиологического раствора (1 капилляр Панченкова), а в кювету с опытным образцом крови - 0,2 мл раствора лекарственного аллергена в концентрации 250 мкг/мл. Содержимое каждого из обоих исследуемых образцов осторожно перемешивают стеклянной палочкой и термостатируют 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия, после чего в этих же кюветах кровь центрифугируют 10 минут при 6000 об/мин. Плазму удаляют под визуальным контролем при помощи микродозатора, а оставшимися эритроцитами из контрольного и опытных образцов заполняют восьмиячеестую кювету (9). Кювету (9) плотно устанавливают в две параллельные выемки рабочей площадки микроскопа (8), соответствующие размеру восьмиячеестой кюветы (9). После этого на поверхность этой кюветы (9) опускают тубус микроскопа (4), в котором фиксирован ультразвуковой зонд (5) ультразвукового эхоофтальмоскопа (1), причем так, чтобы он при опускании своей рабочей поверхностью попал на середину одной из ячейки восьмиячеестой кюветы (9) с исследуемой пробой (например, контрольной). На экране (2) эхоофтальмоскопа (1) при этом отражается ультразвуковой сигнал, представленный четырьмя вертикальными импульсами (см. рис.), где: I(а) – импульс-сигнал, отраженный от наружной стенки верхней пластины кюветы; II(б) - импульс-сигнал, отраженный от внутренней стенки верхней пластины кюветы (или от границы раздела оргстеклокровь); III(в) - импульс-сигнал, отраженный от внутренней стенки нижней пластины кюветы (или от границы раздела кровь-оргстекло); IV(г) - импульссигнал, отраженный от наружной стенки нижней пластины кюветы (или от границы раздела сред оргстекло-воздух). Ручкой эхоофтальмоскопа "УСИЛЕНИЕ" (10) устанавливают амплитуду второго импульса (И б) до максимальной величины, но так, чтобы он не переходил в верхней точке и ограничение (чтобы не было плоского участка). Измеряют эту величину в клетках шкалы эхоофтальмоскопа (или принимают эту величину за 100%). Затем измеряют величину третьего импульса (И в). Разница амплитуд третьего (И в) и второго (И б) импульсов -DИ (в относительных единицах) характеризует затухание ультразвука в исследуемых эритроцитах. Контроль изменения скорости ультразвука производят по аналогичной методике с той лишь разницей, что в исследуемом образце с помощью двух маркеров (12) на экране эхоофтальмоскопа измеряют длительность промежутка (t) между вторым (б) и третьим (в) импульсами. Длительность промежутка (t) по отношению каждого исследуемого опытного образца к контрольному свидетельствует о реакции крови на вводимый аллерген. Как правило, вначале измеряют акустические параметры эритроцитов в контрольном образце эритроцитов, а затем - в опытных образцах. С этой целью после измерения ультразвуковых параметров в контрольном образце поднимают тубус (4) микроскопа (3) вместе с вмонтированным в него ультразвуковым зондом (5), передвигают кювету (9) и опускают ультразвуковой зонд (5) на первый опытный образец. Производят измерения, как это было описано выше (для контрольного образца), получают разницу амплитуд третьего (в) и второго (б) импульсов для первого опытного образца эритроцитов ИDо1. Проводят сравнение ИDк 3 28518 ный от внутренней стенки нижней пластины кюветы (или от границы раздела кровь-оргстекло); г импульс-сигнал, отраженный от наружной стенки нижней пластины кюветы (или от границы раздела сред оргстекло-воздух). Ручкой "УСИЛЕНИЕ" эхоофтальмоскопа устанавливают амплитуду второго импульса до максимальной величины, но так, чтобы он не переходил в верхней точке в ограничение (чтобы не было плоского участка). Измеряют эту величину в клетках шкалы эхоофтальмоскопа (или принимают эту величину за 100%). Затем измеряют величину третьего импульса. Разница амплитуд третьего и второго импульсов DИк (в относительных единицах) характеризует затухание ультразвука в контрольном растворе. После измерения акустических параметров крови в контрольном образце производят исследования в опытных образцах. С этой целью поднимают тубус приставки вместе с вмонтированным в него ультразвуковым зондом, передвигают кювету с ячейки, в которой находится контрольный образец, и опускают ультразвуковой зонд на ячейку с первым опытным образцом. Производят измерения, как это описано выше, получают разницу амплитуд третьего и второго импульсов для первого опытного образца крови И о 1. Проводят сравнение DИк и DИ о1, что соответствует изменению акустической плотности пробы в первом опытном образце по отношению к контрольному образцу. Таким же образом проводят измерения во всех остальных опытных образцах, количество которых определяют в каждом конкретном случае данными аллергологического анамнеза. Анализ результатов ультразвукового теста показал, что у обследуемого больного имеется сенсибилизация в витамину В6, так как разница поглощения ультразвука эритроцитами между контрольным образцом и опытным образцом с витамином В6 равнялась 1,4 усл.ед. или 40% (контрольный образец 3,5 усл.ед., витамин В6 4,9 усл.ед., преднизолон - 3,7 усл.ед., новокаин 3,3 усл.ед., лидокаин - 3,9 усл.ед.), что совпадало с данными реакции агломерации лейкоцитов. Однако постановка последней занимает по времени выполнения весь рабочий день - 6 часов, в то время как постановка предлагаемого ультразвукового теста длится всего 30 минут. Пример 2. Больная Ш.О.И., и.б. 42, направлена на консультацию в УНИИДиВ по поводу острой крапивницы. Больна 2 недели. Кожный процесс развился у больной впервые на фоне лечения пневмонии, по поводу которой получала пенициллин, камфору, глюконат кальция и витамины. В анамнезе у больной частые простудные заболевания (хронический бронхит, тонзиллит), лекарственные препараты и пищевые продукты в прошлом переносила хорошо. При осмотре больной кожный процесс носит распространенный характер, захватывая кожу туловища и конечностей, где имеется множество высыпаний волдырного характера, субъективно - сильный зуд. В межпальцевых складках стоп - шелушение, мокнутие. Ногтевые пластинки 4 и 5 пальцев правой стопы деформированы, желтого цвета, крошатся, при бактериоскопичеком исследовании соскоба чешуек с межпальцевых складок обеих стоп и ногтевых пластинок 4 и 5 пальцев правой стопы обнаружены нити и ИDо1, что соответствует изменению акустической плотности эритроцитов в первом опытном образце по отношению к контрольному образцу. Таким же образом проводят измерения во всех остальных опытных образцах, количество которых определяют в каждом конкретном случае данными аллергологического анамнеза. Примеры конкретного выполнения Пример 1. Больной Р.А.Д., и.б. 24, получал лечение в отделе дерматологии Украинского НИИ дерматологии и венерологии по поводу псориаза, которым страдает в течение 20 лет. На фоне лечения преднизолонон, витамином В6 у больного появились уртикарные высыпания, зуд. В анамнезе у него с 1986 года аллергические реакции на сернокислую магензию, витамин В12. На основании данных аллергологического анамнеза и клиники больному был поставлен предварительный диагноз - лекарственная болезнь, протекающая по типу крапивницы на фоне течения псориаза. Для подтверждения клинического диагноза и выявления этиологического фактора больной дополнительно обследован с помощью традиционного специфического иммунологического теста, в частности, реакции агломерации лейкоцитов (РАЛ), а также предлагаемым ультразвуковым методом. Анализ результатов исследования РАЛ свидетельствовал о наличии у больного повышенной чувствительности к витамину В6 (контрольный образец - 3 усл.ед., витамин В6 - 15 усл.ед., преднизолон - 5 усл.ед., пенициллин - 4 усл.ед., лидокаин - 5 усл.ед., новокаин - 2 усл.ед.). С целью обследования больного ультразвуковым методом кровь забирают из локтевой вены натощак. Для предотвращения коагуляции крови в пробирку предварительно наливают 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 1:6. Затем по 1,5 мл цитратной крови помещают в кюветы с плоским полированным дном из оргстекла. В кювету с контрольным образцом крови добавляют 0,2 мл физиологического раствора (1 капилляр Панченкова), а в опытные образцы - 0,2 мл раствора соответствующего лекарственного препарата в концентрации 250 мкг/мл (1 капилляр Панченкова). Содержимое контрольного и опытных образцов осторожно перемешивают стеклянной палочкой и термостатируют 10 минут при температуре 37°С, после чего в этих же кюветах кровь центрифугируют в течение 10 минут при 6000 об/мин. Плазму удаляют под визуальный контролем при помощи микродозатора, а оставшимися эритроцитами из контрольного и опытных образцов заполняют восьмиячеестую кювету, выполненную из оргстекла. Кювету устанавливают в два параллельных паза на рабочей площадке микроскопа. После этого на поверхность кюветы опускают тубус микроскопа, в котором фиксирован ультразвуковой зонд ультразвукового эхоофтальмоскопа, причем так, чтобы он при опускании рабочей частью попал на средину ячейки с исследуемой пробой (например, контрольной). Контролируют на экране эхоофтальмоскопа сигнал из четырех вертикальных импульсов (см. рис.), где: а - импульс-сигнал, отраженный от наружной стенки верхней пластины кюветы; б импульс-сигнал, отраженный от внутренней стенки верхней пластины кюветы (или от границы раздела оргстекло-кровь); в - импульс-сигнал, отражен 4 28518 гриба эпидермофитон интердигитале. На основании жалоб больной, анамнеза и клиники поставлен диагноз - острая крапивница, эпидермофития и онихомикоз стоп. Дополнительно больная обследована на лекарственную аллергию. У больной взята кровь, с которой поставлены реакция агломерации лейкоцитов (РАЛ) и предлагаемый ультразвуковой тест с набором лекарственных препаратов, получаемых больной накануне развития кожных высыпаний. Анализ результатов РАЛ свидетельствовал о наличии у больной сенсибилизации к пенициллину (контрольный образец - 5 усл.ед., пенициллин - 25 усл.ед., новокаин - 4 усл.ед., камфора - 6 усл.ед., глюконат кальция - 5 усл.ед.). Повышенная чувствительность к пенициллину (разница поглощения ультразвука эритроцитами между контрольным образцом и опытным образцом с пенициллином равна 2,0 усл.ед. или 66%) была выявлена у больной и с помощью ультразвукового метода (контрольный образец - 3,0 усл.ед.; опытные образцы: новокаин - 3,4 усл.ед., камфора 3,5 усл.ед., глюконат кальция - 3,5 усл.ед., пенициллин - 5,0 усл.ед.). Результаты дополнительного обследования явились основанием для изменения диагноза у обследуемой больной. В заключение на основании жалоб больной, ее истории болезни, данных аллергологического анализа, клиники, а также результатов микологического обследования и специфических иммунологических тестов пациентке был установлен диагноз - лекарственная болезнь (к пенициллину), протекающая по типу крапивницы, которая развилась на фоне лечения пневмонии. Сопутствующий диагноз эпидермофития и онихомикоз стоп (которые, вероятнее всего, и способствовали развитию сенсибилизации у больной к пенициллину из-за наличия общих антигенных детерминант у пенициллина и возбудителя грибкового заболевания – эпидермофитона интердигитале). В соответствии с изменением диагноза больной было рекомендовано не принимать в дальнейшем пенициллин и его аналоги, а также назначено лечение, направленное на снижение сенсибилизации к лекарственным препаратам, в том числе на сопутствующую патологию. Использование предлагаемого способа определения лекарственного аллергена у больных лекарственной болезнью позволит повысить его точность и чувствительность, а также значительно сократить сроки выявления лекарственного аллергена, а, следовательно, ускорить этиологическую диагностику лекарственной болезни. Фиг. 5 28518 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 34 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 6