Спосіб пригнічення репродукції вірусу імунодефіциту людини

Спосіб пригнічення репродукції вірусу імунодефіциту людини шляхом застосування препарата полірибонуклеотидної природи, який відрізняється тим, що як діюча речовина використовують молекулярний комплекс дріжджової РНК з 2,7біс[2-(диетиламіно-етоксі)-флуорен]-9-он дігідрохлоридом (тилороном) при співвідношенні тилорон / РНК(фосфат) 1/10 (М/М) та в концентраціях від 10 до 200 мкг/мл. (19) (21) 97062684 (22) 06.06.1997 (24) 16.10.2000 (33) UA (46) 16.10.2000, Бюл. № 5, 2000 р. (72) Карпов Олександр Вікторович, Співак Микола Якович, Антоненко Свєтлана Василівна, Барбашева Олена Віталіївна (73) Карпов Олександр Вікторович, Співак Микола Якович, Антоненко Свєтлана Василівна, Барбашева Олена Віталіївна 28523 середовище в концентрації 0,5´106 кл./мл з одночасним додаванням досліджуваних препаратів. Для моделювання хронічної ВІЛ-інфекції використовували хронічно інфіковану культуру клітин Н-9/ІІІВ. Препарати вносили в культуральне середовище одночасно з виконанням чергового пасажу культури. Подальше культивування ВІЛ-інфікованих клітинних культур проводили на протязі 10-20 діб зі зміною поживного середовища і одночасним обліком стану культур по 4-денному циклу. Анти-ВІЛ активність препаратів оцінювали за такими критеріями, як показники життєздатності клітин, активність сінцитієутворення та рівень вмісту антигену р24 ВІЛ-І в культуральному середовищі. Ступінь захисту клітин від цитодеструктивної дії ВІЛ-1 визначали за формулою [4]: А-В % захисту = ´ 100, К -В де А - кількість життєздатних клітин в дослідній культурі; В - те ж в інфікованій культурі (контроль вірусу); К - те ж в контрольній неінфікованій культурі. Інгібуючий вплив препаратів на рівень сінцитієутворення оцінювали відповідно кількості сінцитіїв на 1000 клітин. Рівень вмісту антигену р24 ВІЛ-І в культуральних рідинах визначали методом ІФА на тестсистемах фірми "Abbott" (США) згідно рекомендації фірми-виробника. Вивчення токсичності препаратів. Досліджували вплив препаратів на проліферативну активність та життєздатність клітин МТ-4 в тесті з трипановим синім. Для цього в лунки 24-лункових культуральних пластикових планшетів вносили по 1,8 мл клітинної суспензії зі щільністю 0,7´106 кл./мл, після чого в відповідні лунки вносили по 0,2 мл розведень препаратів або поживне середовище. Облік результатів проводили через 24, 48 та 72 години культивування клітин в присутності препаратів. Підрахунок живих і мертвих клітин в попередньо забарвлених суправітальним барвником (0,1% розчин трипанового синього) зразках культур здійснювали в камері Горяєва під світловим мікроскопом. Токсичний ефект оцінювали згідно процентному вмісту загиблих клітин, проліферативну активність - згідно підвищенню щільності клітинної популяції. Вирішення поставленої задачі пояснюється слідуючими прикладами. Приклад 1. Пряме порівняння захисної дії МК проводили на моделях гострої і хронічної ВІЛінфекції як по відношенню до компонентів комплексу, що брались окремо, так і до відомих індукторів ІФН полірибонуклеїнової природи, для яких відома анти-ВІЛ дія. Результати наведені в табл. 1 та 2. В умовах множинності інфікування клітин МТ4, яку ми використовували (0,05-0,1 Іg ТЦД50/кл), в контрольних культурах вже на 4 добу спостереження реєструвалась загибель до 50% клітин. В той же час, при одночасному з зараженням внесенні в поживне середовище як МК, так і його компонентів, що бралися окремо, спостерігався помітний захист клітин від цитодеструктивної дії вірусу (табл. 1). Як видно, МК справляв найбільшу захисну дію в концентрації 50 мкг/мл (до 50%) і дещо меншу в більш високих концентраціях (до 40%). Характерно, що як дріжджова РНК, так і тилорон, які брали поодинці, викликали деякий, хоча і менш виражений захисний ефект в дозах, які дорівнювали їх вмісту в експериментальних дозах МК. При цьому спостерігалася помітна тенденція до адитивності захисної дії складових МК . На 8 добу культивування клітин МТ-4, інфікованих штамом ВІЛ-1/BRU, захисний ефект ще трохи підвищувався як під дією МК в дослідних дозах, так і під впливом самих по собі компонентів МК в відповідних концентраціях. До того ж в усі х випадках відмічалась пряма залежність анти-ВІЛ ефекту від величини дози препарату (за винятком дози 200 мкг/мл). При використанні моделі хронічної інфекції (Н9/ІІІВ) картина захисної дії МК та його складових практично повторювала отриману для MT-4/BRU, дещо відрізняючись за величинами абсолютних значень (табл. 2). Важливо відмітити, що у випадках використання обох моделей інфекції показники захисної дії МК практично співпадали згідно порядків величин з такими для відомих індукторів ІФН полірибонуклеїнової природи, анти-ВІЛ дія яких в умовах in vitro встановлена - рідостіну та ларифану. Загальне підвищення кількості життєздатних клітин в інфікованих культурах під дією МК на 8 добу культивування пов'язане, як здається, з раннім пригніченням реплікації вірусу і, як наслідок, з проліферацією не інфікованої популяції клітин в заражених культурах. Приклад 2. Окрім підвищення життєздатності клітин одним з найбільш важливих загальноприйнятих показників вірусінгібуючої дії анти-ВІЛ агентів є пригнічення вірусіндукованого утворення сінцитіїв. Дані щодо здатності МК пригнічува ти сінцитієутворення представлені на фіг. 1. Як видно, МК в концентраціях 10 та 100 мкг/мл помітно пригнічує вірусіндуковане утворення сінцитіїв. До того ж строк появи сінцитіїв в цій культурі пролонгується, що свідчить про збільшення латентного періоду протікання інфекційного процесу під дією цого препарату. Приклад 3. Суттєвим показником ВІЛ-інгібуючої дії препаратів є також зменшення рівня синтезу антигену р24 (результати дослідження приведені на фіг. 2 та 3). Як видно, додання МК в дозі 10 мкг/мл знижує синтез даного антигену більш ефективно, ніж доза 100 мкг/мл як при гострій, так і хронічній інфекції. Слід також відмітити, що інгібуючий вплив МК на даний параметр активності реплікації вірусу більш виражений в випадку моделі ВІЛ-1/ІІІВ (хронічна інфекція). Приклад 4. Аналізували токсичність препаратів МК відносно культур клітин, що використовували в дослідах (табл. 3). Виявилося, що МК в дозах 10 та 100 мкг/мл не виказує токсичного впливу на фізіологічний стан клітини. В випадку дії дози препарату 1000 мкг/мл цитопатичний ефект спостерігався, що відобразилося на 3 день спостереження як на щільності клітинної суспензії, так і на життєздатності клітин (зниження показників на 68% та 32% відповідно). Отримані нами дані відносно токсичності препаратів МК in vitro співпадають по порядкам вели 2 28523 чин з результатами оцінки в таких умовах токсичності відомих індукторів полірибонуклеотидної природи - рідостину та ларифану [2], а також амплігену та poly(A)-poly(U) [3, 4], які, як показано, проявляють анти-ВІЛ дію, аналогічно дії азидотимідину (АЗТ), при значно меншій токсичності. Таким чином, в результаті проведених досліджень запропоновано спосіб пригнічення репродукції вірусу імунодефіциту людини препаратом полірибонуклеотидної природи, який відрізняється тим, що як діюча речовина використовується молекулярний комплекс дріжджової РНК з 2,7-біс[2(диетиламіно-етоксі)-флуорен]-9-он дігідрохлоридом (тилороном) при співвідношенні тилорон / РНК(фосфат) 1/10 (М/М) та в концентраціях від 10 до 200 мкг/мл. Джерела інформації 1. Poli G., Orensten J.M., Kinter A. et al. Interferon-a, but not AZT suppresses HIV e xpression in chronically infected cell lines // Science - 1989 Vol. 244, № 4904 - p. 575-577. 2. Носик Н.Н., Носик Д.Н., Кузнецова И.В. Ингибирующее действие индукторов интерферона на размножение вируса иммунодефицита человека // Вопр. вирусол. – 1992. - № 2. - С. 92-94. 3. Montefiori D.C., Mitchell W.M. Anti viral activity of mismatched double-stranded RNA against human immunodeficiency virus in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1987 - Vol. 84, № 9 - p. 47-56. 4. Crust В., Callebaut C., Hovanessian A.G. Inhibition of entry of HIV into cells by poly(A)-poly(U) // AIDS-Res. Hum. Retrovirus - 1992 - Vol. 9, № 11 p. 1087-1090. 5. Ma yer G.D., Krueger R.F. Tilorine hydrochloride and related molecules. In: "Interferon and interferon inducers", Ed. Stringfellow D.A.; Dekker, New York, - 1980 - p. 187-221. 6. Карпов А.В., Жолобак Н.М. Продукция интерферонов I типа в организме под действием молекулярных комплексов дрожжевая РНК - тилорон // Вопр. вирусол. – 1996. - № 1. - С. 13-16. 7. Карпов А.В., Жолобак Н.М. Изучение интерфероногенных свойств комплексов дрожжевая РНК - тилорон в культуре клеток // Антибиотики и химиотерапия. – 1995. - Т. 40, № 5. - С. 20-23. 8. Методы исследования нуклеиновых кислот / Под ред. А.Н.Белозерского. - М.: Мир, 1970. – 277 с. Таблиця 1 Захисна дія МК та його компонентів, а також стандартних індукторів полірибонуклеїнової природи в культурі клітин МТ-4, інфікованій ВІЛ-I/BRU* Препарат, концентрація (мкг/мл) Ступінь захисту (%) 4 доба 8 доба 11,8±4,2 14,3±3,3 51,1±7,7 49,0±2,2 40,9±6,4 11,1±2,7 15,2±3,4 63,2±6,4 57,5±7,5 50,1±3,3 1,8±0,4 5,5±1,5 9,7±1,3 10,8±3,2 10,6±4,2 1,3±0,2 4,8±1,2 8,6±3,4 9,3±2,7 10,2±1,8 8,1±1,3 9,2±1,4 20,6±3,2 34,5±3,5 39,1±5,4 8,9±2,1 9,7±1,7 28,1±3,3 41,5±6,5 46,8±7,2 47,8±2,4 36,3±1,7 15,0±1,6 66,1±6,5 63,8±2,4 71,5±11,5 43,6±1,8 21,0±5,1 18,2±1,3 50,6±6,8 48,1±5,4 13,3±1,3 МК 5 10 50 100 200 Дріжджова РНК 4,5 9 45 90 180 Тилорон 0,5 1 5 10 20 Рідостин 50 100 200 Ларіфан 50 100 200 * Концентрація РНК і тилорону відповідала іх вмісту в експериментальних дозах МК. 3 28523 Таблиця 2 Захисна дія МК та його компонентів, а також стандартних індукторів полірибонуклеїнової природи в культурі клітин Н-9, інфікованій ВІЛ-І/ІІІ В* Ступінь захисту (%) Препарат, концентрація (мкг/мл) 4 доба 8 доба 8,2±0,1 11,8±1,8 30,1±2,7 25,3±4,3 24,9±7,7 7,3±0,3 13,2±1,2 66,9±9,1 67,1±6,0 59,5±8,5 1,2±0,1 2,9±0,8 11,3±1,9 9,0±2,2 8,6±2,8 0,8±0,1 1,7±0,4 14,0±9,5 17,7±2,2 16,2±4,0 4,7±0,8 4,2±1,3 15,1±3,9 17,5±3,0 17,6±2,8 3,5±0,5 3,1±0,7 28,1±3,3 31,5±6,5 32,1±2,4 24,7±3,0 23,7±2,0 13,9±1,9 43,0±8,6 38,7±2,7 21,8±3,0 22,1±3,3 31,1±4,0 22,2±6,2 52,0±12,8 50,7±10,2 23,2±9,2 МК 5 10 50 100 200 Дріжджова РНК 4,5 9 45 90 180 Тилорон 0,5 1 5 10 20 Рідостин 50 100 200 Ларіфан 50 100 200 * Концентрація РНК і тилорону відповідала іх вмісту в експериментальних дозах МК. Таблиця 3 Вплив різних доз МК на характеристики життєздатності клітин МТ-4 Концентрація препарату, (мкг/мл) 0 10 100 1000 1 доба 1,03±0,11 1,04±0,26 1,01±0,17 0,81±0,13 0 10 100 1000 96,3±1,6 95,2±4,2 92,2±2,0 84,3±3,7 Характеристика культури клітин Щільність клітинної суспензії, (млн кл./мл) 2 доба 1,51±0,17 1,44±0,32 1,41±0,27 0,68±0,22 Життєздатність клітинної суспензії, (%) 95,1±1,1 94,2±3,6 90,2±4,2 73,6±2,3 4 3 доба 2,02±0,12 2,01±0,27 1,82±0,22 0,77±0,19 96,2±1,4 92,5±2,5 93,1±3,7 65,1±1,9 28523 Вплив МК на сінцитієутворення, яке індукує ВІЛ-I/BRU в культурі клітин МТ-4 1 - контроль; 2 - МК (10 мкг/мл); 3 - МК (100 мкг/мл) Фіг. 1 Вплив МК на вміст р24 антигену ВІЛ-1/BRU в культуральному середовищі клітин МТ-4 (5 доба спостереження) Фіг. 2 5 28523 Вплив МК на вміст р24 антигену ВІЛ-1/ІІІВ в к ультуральному середовищі клітин Н-9 (20 доба спостереження) Фіг. 3 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 6