Спосіб отримання трансформованих e.coli штаму dha5f’ носіїв генів mhp366 та mhp377, продукуючих рекомбінантний протеїн збудника ензоотичної пневмонії свиней

Спосіб отримання трансформованих Е.cоlі штаму DHa5 F' носіїв генів mhp366 та mhp377, продукуючих рекомбінантний протеїн збудника ензоотичної пневмонії свиней, що включає отримання гена в полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР), вбудування до вектора, трансформацію та очищення, який відрізняється тим, що клонують ділянки цих генів в ПЛР з розрахованими праймерами з сайтами для рестрикції Smal, BsmBl, NotI: oMhp366A(CCGCCCCGGGGCTGTACTTATAAAATT GAATCTAGC), oMhp366B(ATCTGCGGCCGCGCGTCTCGACTTTC CAAAATGGGCCACCGTTATG), oMhp366C(AGGACGTCTCAAAGTAATGAATACCAA AATTA), oMhp366D(GGCCGTCTCGCCATTTTATTTCCCAAA GACGAAAAAGAATCCG), oMhp366E(GGCCGTCTCAATGGCTCAAAGATAAT U 2 32904 1 3 Технології отримання рекомбінантних імуногенних білків для виготовлення вакцин базуються на принципах виявлення імунопротеїнів за допомогою серологічних методів, виділення окремих генів збудника, які кодують ці імунопротеїни, клонування генів у складі векторних систем та експресії антигенів у трансформованих культурах та очищення рекомбінантних продуктів. З метою діагностики мікоплазмозів широко рекомендовані серологічні та бактеріологічні тести. Недоліком перших є недостатньо висока чутливість та специфічність, а других - значні затрати часу, що ускладнюють встановлення діагнозу (WHO, 2005-2007 [www.who.int], ОІЕ, 20002004[www.oie.int]). Існуючі препарати для профілактики мікоплазмозів являють собою інактивовані (бактерини та суб’єдиничні), або живі вакцини [Jones С, RappGabrier V., Thacker E, Intradermal vaccination for M.hyopn. // J. Swine Health&Prod. - 2005. - Vol.13, N1, pp.19-27]. Недоліком цих вакцин є можливість поширення збудника серед свиней, висока реактогенність препаратів та низька специфічність імунної відповіді внаслідок вмісту баластних речовин. Існує спосіб отримання антигену (адгезин р97 M.hyopneumoniae) для виготовлення асоційованої вакцини [Vaccine efficacy of the attenuated Erysipelothrix rhusiopathiae YS-19 expressing a recombinant protein of Mycoplasma hyopneumoniae P97 adhesin against mycoplasmal pneumonia of swine. Shimoji Y, Oishi E, Muneta Y, Nosaka H, Mori Y.], який ґрунтується на отриманні гена в ПЛР, його вбудовуванні до вектору, трансформації Е.соlі та очищення за допомогою високоефективної рідкісної хроматографії в двох фазах. Це рішення може бути прототипом. Недоліками прототипу є низька імуногенність адгезину р97 та вища вартість очищення продукту за рахунок великої концентрації дефектних молекул антигену. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб отримання трансформованих Е.соlі штаму DHa5 F’ носіїв генів mhp366 та mhp317, продукуючих рекомбінантний протеїн збудника ензоотичної пневмонії свиней, що включає отримання гена в ПЛР, вбудування до вектору трансформацію та очищення шляхом клонування ділянок цих генів в ПЛР з розрахованими праймерами з сайтами для рестрикції Smal, BsmBl, Notl: oMhp366A(CCGCCCCGGGGCTGTACTTATAAA ATTGAATCTAGC), oMhp366B (ATCTGCGGCCGCGCGTCTCGACTTTCCAAAATG GGCCACCGTTATG), oMhp366C (AGGACGTCTCAAAGTAATGAATACCAAAATTA), oMhp366D(GGCCGTCTCGCCATTTTATTTCCC AAAGACGAAAAAGAATCCG), oMhp366E(GGCCGTCTCAATGGCTCAAAGATA ATGGCAAAGAACTTTTCCCGG), oMhp366F(CCTTCGTCTCTGGTTTTAATTTTGA AATTTTTTCCCAATATTTTTTAAATTCATTAAAATTT G), Mhp366G (GGAACGTCTCAAACCAACTAAAATTTCTGAACAA 32904 4 AGTTGGGATGATCAAGACTTTGATTATACAACAAA A), oMhp366H(TTCTGCGGCCGCGTTCCTTTTTTA AATAAACTTTATTGATTTG), oMHP377C(GTGGGATCCCCGTCTCATGGAAC GAAAAACCCGAGGTAA), oMhp377D(CGATGCGGCCGCCGTCTCTTTCC AGGGACCAGCTAGTTT), oMhp377E(GATCCGTCTCTGGAAAAAATCTTA TGCCAGCGA), oMhp377F(GATCCGTCTCTCCAAATTTTTGATT TTGATCCAACTGG), oMhp377G(GATCCGTCTCTTTGGAAACTAGTA GATCAAGAAAATC), oMhp377H(GATCCGTCTCAAAGCCATTTTCAA AATCAGGATCTG), oMhp377I(GATCCGTCTCGGCTTTAGAAAAAAA ACAGACAAGT), oMhp377K(GATCCGTCTCACCATTTAACAAAA TTAAGTGTGGCAAC), oMhp377L(GATCCGTCTCAATGGTTTATTTCCC AAAAAGAGGAA), oMhp377M(CGATGCGGCCGCTTAATTTTTAAC TGTTTTATTTTCCG), включення отриманих ділянок до векторних систем, трансформацією Е.соlі штаму DHa5 F’, експресією та очищенням отриманого протеїну в вертикальній колонці glutation Sepharose 4B, щоб забезпечити ефективність способу. Спосіб виконується наступним чином: Як матеріал для накопичення мікоплазмених генів застосовують ДНК референтного штаму M.hyopneumoniae 232, яку екстрагують за фенолхлороформним методом 500мл культури, попередньо осадженою центрифугуванням. За допомогою ПЛР накопичують ділянки генів з відповідними сайтами для рестрикції. Параметри ампліфікації є такими: початкова денатурація ДНК 94°С - 4хв.; 30 циклів: денатурація ДНК 96°С - 1хв.; гібридизація праймерів (відпал) 55°С - 1хв.; елонгація 72°С - 2хв.; заключна елонгація 72°С - 10хв. Реакційна суміш для ПЛР використовується в об’ємі 25мкл (LongEnzyme-Mix, Fermentas), яка містить: 0,5mг хромосомальної ДНК, 5пкмол кожного з праймерів та 1од. Taq-полімерази фірми Invitrogen (Карлсруе, Німеччина). Специфічність ампліфікації ДНК визначають шляхом електрофорезу фрагментів ДНК в 1,5% агарозному гелі. Довжина утворених фрагментів має відповідати попереднім розрахункам. Специфічні за маркером смуги вирізують під ультрафіолетовим світлом. З них екстрагують ДНК за допомогою системи екстракції GelExtraction Kit (Fermentas). Після очищення в агарозному гелі обробляють рестриктазами. Наступним кроком повторюють очищення в агарозному гелі та здійснюють лігування усіх ділянок, з послідуючим побудуванням відповідних експресійних векторів pGex5x2 або pGex5x3 фірми Amersham Bioscience (Фрайбург, Німеччина) та їх трансформацією в Е.соlі. Екстраговані ділянки ДНК обробляють 5ОД BsmBI при температурі 55°С протягом 2-х годин. 5 Плазміди, та кінцеві частини напрацьованих фрагментів генів M.hyopneumoniae обробляють 5ОД Smal та NotI при температурі 37°С протягом 2-х годин. Після лігіювання та трансформування клітин Е.соlі, які здійснюють за допомогою Rapid DNA ligation and Transformation Kit (Fermentas), висівають на ЛБ-агар з ампіціліном (0,1мг/мл). Після 12годинного інкубування при 37°С відбирають одиничні колонії та вносять до 3мл рідкого середовища ЛБ з ампіціліном (0,1мг/мл), після чого інкубують на шейкері при температурі 37°С впродовж 12 години. Для виявлення правильно трансформованих клітин відбирають 100мкл від інкубованної культури та центрифугують при 13000об/хв. 5хв., до осаду додають 100мкл ТЕ буферу та денатурують за температурою 100°С 5хв. Проводять контроль ефективності трансформування за допомогою ПЛР з праймерами oGex5’(GGGCTGGCAAGCCACGTTTG) та oGex3’(CCGGGAGCTGCATGTGTCAG) за таких параметрів ампліфікації: початкова денатурація ДНК 94°С - 4хв.; 30 циклів: денатурація ДНК 96°С - 1хв.; гібридизація праймерів (відпал) 52°С - 1хв.; елонгація 72° С - 2хв.; заключна елонгація 72°С - 10хв. Реакційна суміш для ПЛР використовується в об’ємі 25мкл (LongEnzyme-Mix, Fermentas), яка містить: 5мкл проби, 5пкмол кожного з праймерів та 1од. Taq-полімерази фірми Invitrogen (Карлсруе, Німеччина). Додатковий контроль правильності конструювання плазмид відбувається за допомогою ДНК секвенування. Експресія гібридного GST протеїну та його очищення здійснюється за такою схемою: відбирають 2мл трансформованої культури та центрифугують при 6000об/хв. при температурі 25°С. Отриманий осад ресуспендують в 50мл рідкого середовища ЛБ з ампіціліном (0,1мг/мл), та інкубують на шейкері при температурі 37°С протягом 10год. Після інкубації культуру центрифугують протягом 10хв. при 6500об./хв. та осад ресуспендують у 100мл свіжого рідкого середовища ЛБ з ампіциліном (0,1мг/мл) та ІПТГ (1мМ) для індукції в трансформованих клітинах гібридних GST протеїнів, після чого інкубують на шейкері протягом 3 годин при температурі 37°С. Шляхом центрифугування здійснюють збирання клітин культури після чого одноразово відмивають у фосфатносольовому буфері (ФСБ). Накопичення цих протеї 32904 6 нів в цитоплазмі контролюють за допомогою поліакриламідного гель-електрофорезу. За допомогою афіної хроматографії здійснюють очищення рекомбінантного протеїну. Для цього осад після центрифугування ресуспендують в ФСБ з додаванням лізоциму (1мг/мл) та після інкубування у льоді протягом 20хв. обробляють ультразвуком. Залишки клітин осаджують центрифугуванням, а чистий лізат пропускають через вертикальну колонку glutation Sepharose 4В фірми Amersham Bioscience (Фрайбург, Німеччина). Зв’язування протеїну здійснюється за допомогою введення до колонки елюенту, який складається з 50мМ Трис-НСl (рН 8.0) та 10мМ відновленого глутатіону. Перелік фігур креслення: На Фіг.1 наведена схематична карта плазмідного вектору рМНР366-501 На Фіг.2 показано схематичне зображення плазмідного вектору рМНР377-501. На Фіг.3 наведено результат Вестерн Блотінгу з кролячою сироваткою a-GST (у розведенні 1:2000); А - лізату клітин трансформованої культури Е.соlі з плазмідою pMhp366-501: 1 - Індуковано ІПТГ(1mМ), 2 - з додаванням глюкози; Б - лізату клітин трансформованої культури Е.соlі з плазмідою pMhp377-501: 1 - з додаванням глюкози, 2 Індуковано ІПТГ(1mМ). На Фіг.4 показано графік змінення оптичної щільності під час проведення ELISA з гіперімунною свинячою сироваткою та сироваткою реконвалесцентів, де в якості твердофазного антигену використовують отриманий рекомбінантний протеїн GST-366 (з концентрацією 1мг/мл). Б - рекомбінантний протеїн GST-377. На Фіг.5 наведено графік змінення оптичної щільності під час проведення ELISA з гіперімунною свинячою сироваткою та сироваткою реконвалесцентів, де в якості твердофазного антигену використовували отриманий рекомбінантний протеїн GST-377 (з концентрацією 1мг/мл). Ефективність способу розкривається в прикладах. Приклад 1 Для оцінки ефективності способу була проведена візуалізація та синтез плазмід pMhp366-501, pMhp377-501 (Фіг.1, Фіг.2). Схематичні карти плазмідних векторів, а також їх секвенування, що вказало на специфічне лігування плазмід. Послідовність фрагмента побудованого вектора рМhр366501 7 32904 Послідовність фрагмента побудованого вектора pMhp377-501 8 9 Приклад 2 Для оцінки ефективності способу специфічність експресованих трансформованою культурою Е.соІі протеїнів визначено за допомогою Вестерн Блотингу зі специфічною кролячою сироваткою aGST (1:2000) (Фіг.3): А - лізат клітин трансформованої культури Е.соlі з плазмідою pMhp366-501: 1 - Індуковано ІПТГ(1mМ), 2 - з додаванням глюкози; Б - лізат клітин трансформованої культури Е.соlі з плазмідою pMhp377-501: 1-3 додаванням глюкози, 2 - Індуковано ІПТГ(1mМ). Молекулярні маси отриманих рекомбінантних протеїнів відповідали теоретично розрахованим розмірам (90 та 80kDa), що вказує на правильність трансформації клітин Е.соlі, та функціональну досконалість експресованних генів. Приклад 3. Після очищення химерних протеїнів комерційною системою «GST-Glutathion-Affinitatssystem» їх концентрація була визначена за допомогою набору МісrоВС Assay (Optima Interchim, Montlucon 32904 10 Cedex, Франція). Згідно отриманих результатів протеїн GST-Mhp366 мав концентрацію 2,8мг/мл, а GST-Mhp377 3мг/мл. Для визначення імуноспеціфічності отриманих рекомбінантних протеїнів застосовували ELISA з реконвалесцентними та гіперімунними свинячими сироватками в розведенні 1:100. Результат отримували за допомогою фотометра з довжиною хвилі 405нМ (Фіг.4, Фіг.5). Отримані дані свідчать про те, що отримані рекомбінантні протеши GST-Mhp366 та GSTMhp377 є високоактивними в антигенному відношенні. Розроблений спосіб отримання трансформованих культур Е.соlі носіїв генів М.hyopneumoniae, придатний до використання як в дослідній діяльності, так і з метою отримання компонентів рекомбінантних вакцин проти ензоотичної пневмонії свиней в умовах біологічної промисловості, та чутливих діагностикумів на основі ELISA в лабораторіях та клініках ветеринарного напрямку. 11 Комп’ютерна верстка О. Рябко 32904 Підписне 12 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601