Спосіб отримання клонів е. coli-носіїв генів вірусу хвороби марека gb та pp38 як компонентів днк-вакцини
Формула / Реферат
Спосіб отримання клонів Е. соlі - носіїв генів вірусу хвороби Марека gB та рр38 як компонентів ДНК-вакцини, що включає екстракцію ДНК вірусу, її ампліфікацію за long-ПЛР, вирізування липких кінців та лігування їх до плазмід з наступною трансфекцією клітин Е. соlі, який відрізняється тим, що накопичують гени gB та рр38 з використанням праймерів gBExFor (gB-low)* 5'-ATACgaattcTTACACAGCATCATCTTCTG-3', gBExRev (gB-up)1 5'-GATAgaattcATGCACTATTTTAGGCGG-3', Pp38 CP For 5'gaattcATGAGATTTTGTTTCTCCAGATT3', Pp38 CP Rew 5'gaattcGAAGCAGAACACGAAGG3', які містять промоторні ділянки та липкі кінці, за температури відпалу 52 та 48 °С і синтезу фрагментів довжиною 1450 та 980 п.н, обробляють EcoRI, вбудовують в плазміди Ch_pUC18 та Ch_pBR322, трансформують клітини JM-103 та проводять скринінг ефективності трансформації за утворенням резистентних до ампіциліну колоній.
Текст
УКРАЇНА (19) UA (11) 29318 (13) U (51) МПК (2006) C12N 7/00 C12Q 1/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС видається під відповідальність власника патенту ДО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ КЛОНІВ Е. COLI-НОСІЇВ ГЕНІВ ВІРУСУ ХВОРОБИ МАРЕКА GB ТА PP38 ЯК КОМПОНЕНТІВ ДНК-ВАКЦИНИ 1 2 (13) 29318 (11) Відомий спосіб конструювання компонентів ДНК-вакцини з генів gM, gD та EcoRI-фрагменту ДНК ВХМ І. Цей спосіб ґрунтується на екстракції ДНК вірусу ХМ, ампліфікації за long-ПЛР генів gM, gD та EcoRI-фрагменту, вирізуванні липких кінців та лігуванні їх до плазмід ТОРО з наступною трансфекціїю клітин Е. соlі штаму НВ-101. Це рішення може бути прототипом. Недоліком прототипу є низька специфічність імунної відповіді, обумовленої застосуванням EcoRI-фрагменту, слабка імуногенність продуктів генів gM та gD, а також дорога собівартість клонування генів у клітинах Е. соlі штаму НВ-101, що потребує XGalсубстрату. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб отримання клонів Е.соlі-носіїв генів вірусу хвороби Марека gB та рр38, як компонентів ДНК-вакцини проти хвороби Марека, що включає екстракцію ДНК вірусу, її ампліфікацію за long-ПЛР, вирізування липких кінців та лігування їх до плазмід з наступною трансфекцією клітин Е. соlі, шляхом накопичення генів gB та рр38 з використанням праймерів gBExFor (gB-low)* 5'ATACgaattcTTACACAGCATCATCTTCTG-3', gBExRev (gB-up)1 5'GATAgaattcATGCACTATTTTAGGCGG-3’ Pp38 CP For 5'gaattcATGAGATTTTGTTTCTCCAGATT3’ UA Корисна модель відноситься до ветеринарної вірусології, зокрема до розробки молекулярнобіотехнологічних способів конструювання ДНКвакцин проти герпесвірусних захворювань, а саме проти хвороби Марека сільськогосподарської птиці. Хвороба Марека являє собою широко розповсюджене, необластичне герпесвірусне захворювання сільськогосподарської та дикої птиці, що супроводжується високою летальністю серед інфікованого поголів'я. Існує широкий спектр вірусвакцин, які вміщують живий гетерологіний герпесвірус індичок, або атенуйовані варіанти польового вірусу [вакцина із штаму ВГІ FC-12, Witter R. Protective effect of different vaccines against Marek's disease// Dis. of Poultry. -1999. Vol.2, N 6. -P.214-221]. Недоліком вакцин є те, що вони містять живий епізоотично небезпечний вірус, який може проявити ревірсно патогенні властивості. Технології конструювання молекул діючої речовини для ДНК-вакцин базуються на принципах виділення окремих генів збудників, виділенні цілих ділянок геному (рестрикти) або на селективному клонуванні делеційних або інсерційних мутантів [DNA-vaccines for veterinary use (review). -Humana Press. -NY. -1997. -P.241]. U використанням праймерів gBExFor (gB-low)* 5'ATACgaattcTTACACAGCATCATCTTCTG-3', gBExRev (gB-up)1 5'GATAgaattcATGCACTATTTTAGGCGG-3', Pp38 CP For 5'gaattcATGAGATTTTGTTTCTCCAGATT3', Pp38 CP Rew 5'gaattcGAAGCAGAACACGAAGG3', які містять промоторні ділянки та липкі кінці, за температури відпалу 52 та 48 °С і синтезу фрагментів довжиною 1450 та 980 п.н, обробляють EcoRI, вбудовують в плазміди Ch_pUC18 та Ch_pBR322, трансформують клітини JM-103 та проводять скринінг ефективності трансформації за утворенням резистентних до ампіциліну колоній. (19) (21) u200710072 (22) 10.09.2007 (24) 10.01.2008 (72) ГЕРІЛОВИЧ АНТОН ПАВЛОВИЧ, UA (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ" УААН, UA (56) (57) Спосіб отримання клонів Е. соlі - носіїв генів вірусу хвороби Марека gB та рр38 як компонентів ДНК-вакцини, що включає екстракцію ДНК вірусу, її ампліфікацію за long-ПЛР, вирізування липких кінців та лігування їх до плазмід з наступною трансфекцією клітин Е. соlі, який відрізняється тим, що накопичують гени gB та рр38 з 3 Pp38 CP Rew 5'gaattcGAAGCAGAACACGAAGG3', які містять промоторні ділянки та липкі кінці, за температури віджигу 52 та 48°С і синтезу фрагментів довжиною 1450 та 980п.н, обробки EcoRI, встроювання в плазміни Ch_pUC18 та Ch_pBR322, трансформації клітин JM-103 та скринінгу ефективності трансформації за утворенням резистентних до ампіциліну колоній, щоб забезпечити ефективність способу. Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок про те, що запропонований спосіб базується на застосуванні ДНК-вакцин, які на відміну від вірусвакцин не містять живого вірусу, що зменшує епізоотичний ризик від їх застосування та значно здешевлює витрати на транспортування та зберігання цих засобів, що відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується наступним чином: Як матеріал для накопичення вірусних генів застосовують ДНК вірусу хвороби Марека штаму JM-UA з титром 10000ФУО/мл, яку виділяють за сорбентним методом. Екстраговану ДНК ампліфікують з системами праймерів gBExFor (gB-low) 5'ATACgaattcTTACACAGCATCATCTTCTG-3', gBExRev (gB-up) 5'GATAgaattcATGCACTATTTTAGGCGG-3', Pp38 CP For 5'gaattcATGAGATTTTGTTTCTCCAGATT3’ Pp38 CP Rew 5'gaattcGAAGCAGAACACGAAGG3', при температурах 52 та 48°С, відповідно. Протокол ампліфікації наведено в таблиці. Реакційна суміш для long-ПЛР використовується в об'ємі 50мкл (LongEnzyme-Mix, Fermentas). Специфічність ампліфікації ДНК визначають шляхом електрофорезу фрагментів ДНК в 0,75% агарозному гелі. Довжина утворених фрагментів має відповідати 1450 та 980п.н. Специфічні за маркером смуги вирізують під ультрафіолетовим світлом. З них екстрагують ДНК за допомогою системи екстракції GelExtraction Kit (Fermentas). Екстраговану ДНК обробляють 5 ОД EcoRl при 37°С 30 хвилин. Таким же чином роблять з плазмідами Ch_pUC18TM Ch_pBR322TM. Лігіювання та трансформацію клітин Е.соlі здійснюють за допомогою Rapid DNA ligation and Transformation Kit (Fermentas). Після 4-годинного підрощування трансформованих клітин репродукуючі клони виділяють за методом ампіцилінової селекції (150мкг/мл ампіциліну, інкубація 12 годин). Перед використанням клонів для отримання плазмідної ДНК до виробничого об'єму до добової розплодки додають 20мкг/мл хлорамфеніколу та інкубують 12 годин, після чого суспензію центрифгують при 8000об./хв. 15 хвилин. Клони готові до виділення плазмідної рекомбінантної ДНК. Ефективність способу розкривається в прикладах. Приклад 1. Для оцінки ефективності способу була проведена збірка плазмід gB_CH_PUC18™, pp38_CH_PUC18™, gB_Ch_PBR322™ та pp38_Ch_PBR322™ (Фіг.1, 2 - схематичні карти плазмідних векторів). При перевірці 29318 4 електрофоретичної рухливості плазмідного матеріалу визначено, що вектори gB_CH_PUC18TM, pp38_CH_PUC18™, gB_Ch_PBR322™ та pp38_Ch_PBR322™ мають довжину приблизно 6200, 5700, 7000 та 6500п.н., відповідно, що вказує на специфічне лініювання плазмід. Приклад 2. Для оцінки ефективності способу була проведена трансформація клітин Е.соlі плазмідами gB_Ch_pUC18, pp38_Ch_pUC18, gB_Ch_pBR322 та pp38_Ch_pBR322. Встановлено, що репродукція плазмід в Е.соlі проходить не з однаковою швидкістю. Зокрема, найбільш вигідним носієм рр38 гену виявилась плазміда Ch_pBR322. Специфічний продукт в ній накопичувався впродовж 7 пасажів, причому поріг резистентності клону складав 220,05±15,24мкг/мл. Найбільш вигідним з точки зору накопичення гену gB виявився вектор gB_Ch_pUC18, що забезпечив отримання стабільного клону, що репродукував специфічний продукт впродовж 9 пасажів, поріг резистентності клону сягав 213,22±14,66мкг/мл.. Розроблений спосіб отримання клонів Е. соlі носіїв генів вірусу хвороби Марека gB та рр38, як компонентів ДНК вакцини проти хвороби Марека, може успішно використовуватись у біотехнологічній практиці для створення ДНКвакцин проти хвороби Марека.
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethod for production of е. coli clones-hosts of pp38 viral genes of marek's disease as dna-vaccine components
Автори англійськоюHerilovych Anton Pavlovych
Назва патенту російськоюСпособ получения клонов е. coli-носителей генов вируса болезни марека pp38 в качестве компонентов днк-вакцины
Автори російськоюГерилович Антон Павлович
МПК / Мітки
Мітки: марека, хвороби, клонів, генів, вірусу, спосіб, coli-носіїв, отримання, компонентів, днк-вакцини
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/2-29318-sposib-otrimannya-kloniv-e-coli-nosiv-geniv-virusu-khvorobi-mareka-gb-ta-pp38-yak-komponentiv-dnk-vakcini.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб отримання клонів е. coli-носіїв генів вірусу хвороби марека gb та pp38 як компонентів днк-вакцини</a>
Попередній патент: Спосіб виявлення днк вірусу хвороби ауєскі
Наступний патент: Спосіб контролю експресії генів gb та pp38 вірусу хвороби марека в трансформованих штамах e.coli при виготовленні днк-вакцин
Випадковий патент: Стабільна кристалічна форма біфепруноксмезилату (7-[4-([1,1'-біфеніл]-3-ілметил)-1-піперазиніл]-2(3н)-бензоксазолон монометансульфонату)