Спосіб контролю експресії генів gb та pp38 вірусу хвороби марека в трансформованих штамах e.coli при виготовленні днк-вакцин

Спосіб контролю експресії генів gB та рр38 вірусу хвороби Марека в трансформованих штамах Е.соlі при виготовленні ДНК-вакцини, який включає ідентифікацію вбудованого фрагмента за 3 29319 4 допомогою ПЛР, визначення кількості специфічної Пробірки переносять в ампліфікатор і ДНК, гомогенності ДНК продукту та ефективності проводять ампліфікацію за наступною програмою інсерції специфічних ділянок за резистентністю (табл.): Е.соlі до ампіциліну та визначення специфічної Після закінчення реакції пробірки передають у експресуючої активності в чутливи х тест-системах, кімнату для аналізу продуктів ПЛР, який проводять шляхом використання систем специфічних поділом фрагментів ДНК в агарозному гелі. праймерів MDV gB F\R MD V та рр38 F\R, які Облік результатів. фланкують вн утрішні ділянки генів gB та рр38 У негативному контрольному зразку (К-) ВХМ, дисків з антибіотиками, а також відсутні. У позитивних контрольних зразках (К+) використання РНІСЕ для виявлення специфічних виявляється одна смужка жовтогарячого кольору. антигенів вірусу хвороби Марека з При проведенні аналізу на наявність ділянки гену поліклональними антитілами до ВХМ в культурах gB смужка повинна бути розміром 645 клітин лімфоцитів добових курчат, щоб нуклеотидний залишок, а при проведенні аналізу забезпечити ефективність способу. на наявність ділянки гену рр38 - 400 нуклеотидних Спосіб виконується таким чином: залишків. У дослідних зразках смужки повинні 1. Визначення інсерції специфічних ділянок за відповідати позитивному контролю, а у випадку їх резистентністю Е.соlі до ампіциліну. відсутності, пасаж вважається непридатним для У чашки Петрі на живильні середовища МП А подальшого використання в процесі виготовлення газонним способом висівають рекомбінантні ДНК-вакцини проти ВХМ. штами Е.соlі, та в як контроль використовують 3. Ефективність експресії специфічних материнський штам Е.соlі. До чашок Петрі через антигенів вірусу хвороби Марека за РНІФ з 30 хвилин на поверхні середовища викладають поліклональними антитілами до ВХМ в культурах диски, що вміщують апміцилін в концентрації клітин лімфоцитів курей. 50мкг/диск, потім чашки Петрі розміщують в Для контролю ефективності експресії інкубатор з температурним режимом 37°С, та специфічних антигенів ВХМ з штаму що культивують впродовж 24 годин. досліджується екстрагують загальну ДНК за Облік результатів. допомогою набору для екстракції загальної ДНК Через 24 години під бінокулярною лупою або DNA Sorb-A (Амплисенс, Москва, Росія), або на лічильнику колоній визначають діаметр аналогічного. затримки зони росту. Як що затримка росту у Готують живильне середовище із наступного рекомбінантних клонів навколо ампіцилінових розрахунку: дисків перевищує 12мм, то цей пасаж вважається 20% - сироватка ВРХ непридатним для подальшого використання в 40% - живильне середовище 199 біотехнологічному процесі виготовлення ДНК40% - середовище ігла вакцини. 100 ОД КоnА/мл 2. ПЛР-скриніг екстрактів ДНК з системами Отриману суміш розливають по 2мл в специфічних праймерів MDV gB F/R MD V та рр38 стерильні пеніцилінові флакони, що містять F/R на наявність ділянок генів gB та рр38 ВХМ. покривні стекла. Для контролю одного штаму Як матеріал для дослідження використовують необхідно 12 флаконів. До флаконів вносять рекомбінантні клони Е.соlі, як негативний контроль культур у клітин, після чого 6 флаконів закривають, - материнський штам Е.соlі, як позитивний (негативний контроль), а в решту флаконів контроль - культуральний штам ВХМ JM U A. додають по 10мкл екстракту ДНК та закривають Екстракція сумарної ДНК проводиться за гумовими пробками. Далі флакони поміщують до допомогою набору для екстракції загальної ДНК інкубатора з температурним режимом 37°С. DNA Sorb-A (Амплисенс, Москва, Росія), або Облік результатів. аналогічного. Процедура складається із лізису Результат облічується двічі, через 24 та 48 стінок клітин бактерій та їх детриту, сорбції годин. Для обліку обережно виймається покривне плазмідної ДНК на сорбенті, дворазового скло, фіксується метанолом, промивається відмивання сорбованої ДНК та екстракції ДНК із дистильованою водою, обробляється сорбенту за допомогою ТЕ-буфер у. поліклональними кролячим імуноглобуліном до Готують загальну (для усієї кількості проб) ВХМ, промивається дистильованою водою, суміш реагентів для ампліфікації з розрахунку (на кон'югується з антикролячим імуноглобуліном 1 пробу): курчати, міченим флуоресцеїну ізотіоцианатом, 7,5мкл деіонізованої води; промивається дистильованою водою. 10,0мкл 5-х ПЛР-буфер у; Стекла аналізують за допомогою 2,0мкл суміші dNTP; флуоресцентної мікроскопії. 3мкл праймерів (gB F/R MDV для контролю на Субкультура лімфоцитів, оброблена ДНК наявність ділянки гена gB та рр38 F/R для екстрактом дослідних рекомбінантних штамів контролю на наявність ділянки гена рр38); повинна давати чітку флуоресценцію не менш як у 1 мкл Taq-полімерази. 30% клітин. Приблизний підрахунок проводять у 10 Додають в усі пробірки по 1 краплі (20мкл) полях зору. Якщо результат не задовільний, пасаж мінерального масла. Вносять 20мкл розчину вважають непридатним для подальшого загальної ДНК проби у відповідну пробірку з використання в процесі виготовлення ДНК-вакцини реакційною сумішшю під шар масла для проти ХМ. проведення ампліфікації. Ефективність способу розкривається в прикладах. 5 29319 Приклад 1. Для аналізу брали рекомбінантний штам pBR322_pp38, а в якості контролю, материнський штам Е. coli JM103. Газонним способом штами були посіяни на МПА. Через 30 хвилин в чашки були розміщені ампіцилінові диски, і чашки були перенесені в термостат з температурою 37°С. Через 24 години колонії штамів розглядали під бінокулярною лупою. У висіві розплодку рекомбінантного штаму і затримка росту не відмічали, тоді як в чашках де висівали Е. coli штаму JM103 затримка росту була від 38 до 49мм. Приклад 2. Для проведення ПЛР-скринінгу був відібраний рекомбінантний штам pUC18_gB, що несе ділянки гену gB. Як позитивний контроль був використаний штам вірусу хвороби Марека JM UA, як негативний контроль був використана дейонізована дистильована вода. Для постановки ампліфікації була використана система праймерів gB F\R MDV. При аналізі результатів в пробі штаму pUC18_gB та в позитивном контролі були зареєстровані смужки розміром 645 нуклеотидних залишков. Приклад 3. Екстракт ДНК штаму pUC18_gB додавали до культури клітин лімфоцитів курей. Через 48 годин культуру обробили кролячою сивороткою що містить антитіла до хвороби Марека та пофарбували міченим флуоресцеїну ізотіоцианатом. При флуоресцентній мікроскопії була відмічена флуоресценція приблизно 65 відсотків клітин. Цей спосіб вперше розроблений в Україні і може успішно використовуватись в умовах біотехнологічного виробництва рекомбінантних вакцин. 6 Таблиця Спосіб індикації ДНК генів вірусу хвороби Марека першого серотипу № циклу 1 2 3 4 5 Для гену рр38 Час Температура (хвилин ) 94° С 2 94° С 0,4 55° С 0,4 72° С 0,4 72° С 5 Для гену gB Кількість циклів № циклу Температура Час Кількість циклів 1 40 40 40 1 1 2 3 4 5 94°С 94°С 60°С 72°С 72°С 2 0,4 0,4 0,4 5 1 40 40 40 1