Штам бактерій аснrомовастеr аlвuм вндісгм в-322 д для виготовлення препарату, який підвищує цукристість і урожай цукрового буряка

Изобретение относится к почвенной микробиологии в частности к получению препарата улучшающего фосфорное питание растений сахарной свеклы за счет использования труднорастворимых кальций фосфатов почвы, что способствует повышению всхожести семян, увеличению урожая и сахаристости корнеплодов этой культуры. Известно, что в почве содержится очень большое количество водонерастворимых форм соединений фосфора. Мобилизация из них фосфора микроорганизмами является резервом для улучшения фосфорного питания сельскохозяйственных культур. Известно предложение использовать для улучшения фосфорного питания растений эндомикоризный везикулярно-арбускулярный гриб Clomus (а.с. СССР №1145503, 1983). Однако применение его в полеводстве экономически неприемлемо, так как инокулянт накапливают на вегетирующи х растениях, доза препарата (инфицированных корней) очень большая - до 3т/га. Известно бактериальное удобрение фосфоробактерин, которое приготавливалось на основе микроорганизма, разлагающего органофосфаты - Bacillus megaterium, var. phosphaticum (Труды института микробиологии. В XI, 1961). Однако оно снято с производства в 1968 году как недостаточно эффективное. Известен также штамм Bacillus megaterium АР1 (А.с. СССР №6633897), растворяющий железофосфаты. Рекомендуется, в связи с последним, для применения лишь на почвах, богатых фосфатами железа (дерновоподзолистые и торфоболотные) под овощные культуры. Предлагаемый нами штамм активно развивается в лесостепных и степных почвах, где основной формой фосфатов являются соединения с кальцием, которые он растворяет. Штамм приживается в ризосфере сахарной свеклы. Известны также попытки использовать под сахарную свеклу флавобактерин, который получают путем размножения азотфиксирующи х бактерий. Однако предлагаемый нами штамм фосформобилизующих бактерий более эффективен. В основу изобретения поставлена задача получения препарата на основе штамма бактерий Achromobacter album для инокуляции семян сахарной свеклы, обладающего способностью активно растворять почвы, улучшать фосфорное питание растений сахарной свеклы и за счет этого увеличивать урожай и сахаристость корнеплодов этой культуры. Поставленная задача решается тем, что штамм Achromobacter album ВНИИСХМ В-322 Д, на основе которого изготовляется препарат, обладает способностью активно растворять труднодоступные растениям фосфорные соединения улучшать питание сахарной свеклы фосфором на нейтральных и слабокислых почвах, повышать всхожесть семян, уменьшать заболеваемость проростков "корнеедом", увеличивать урожай и сахаристость корнеплодов этой культуры. Новый штамм выделен из чернозема выщелоченного на глюкозо-аспарагиновой среде (среда Муромцева). Идентифицирован в соответствии с "Определителем бактерий и актиномицетоз" Н.А. Красильникова и "Кратким определителем Берги". Штамм Achromobacter album хранится в коллекции Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г.С.Петербург) под регистрационным номером ВНИИСХМ В-332 Д в группе фосформобилизующих микроорганизмов, а также в лаборатории почвенной микробиологии института сельскохозяйственной микробиологии УААН (г.Чернигов), Депонирован как активный фосфа трастворяющий и ростстимулирующий микроорганизм. Штамм имеет следующую характеристику: Морфологические и культуральные признаки. Клетки: палочки (в мясопептонном бульоне на 2 - 6 сутки), подвижные, одиночные, спор не образуют, грамотрицательные, жгутикование, перитрихальные. Мясо-пептовный агар (МПА). Колонии на питательных средах: Колонии на МПА округлые, беловатые, блестящие с ровным краем, пастообразные, на вторые сутки роста 3 - 4мм в диаметре, затем увеличиваются. Глюкозо-аспарагиновый агар. Состав среды, г/л: глюкоза 10; аспарагин 1,0; агар-агар - 20. Вода водопроводная - до 1л. В расплавленную среду перед посевом вносят Колонии штамма на 3 - е сутки мелкие (около 1мм в диаметре), беловатые, блестящие, пастообразные. Глюкозо-пептонный агар. Состав среды, г/л: глюкоза - 10; пептон - 10; - 2; агар - 20; вода водопроводная до 1л. Колонии на 2 - 3 - е сутки 3 - 4мм в диаметре, округлые, беловатые, выпуклые, блестящие, пастообразные. Физиологические и биохимические признаки. Аэроб, усваивает глюкозу и са харозу с подкислением среды до pH 4,4. Желатин не разжижает, крахмал не усваивает, молоко подкисляет. Усваивает только органические формы азота. Сероводород и индол не образует, образует уреазу и каталазу, не образует оксидазы. Нитраты восстанавливает. Растет при температуре 28, 37 и 42°C. Маркерных признаков штамм не имеет. Признаки штамма устойчивы. Санитарно-гигиенические свойства: Украинским научно-исследовательским институтом экогигиены и токсикологии химических веществ проведено изучение патогенных свойств штамма Achromobacter album ВНИИСХМ В-322 Д. Установлено, что бактерии штамма В-322 Д авирулентны для теплокровных животных, не обладают способностью к транслокации через естественные барьеры желудочно-кишечного тракта, не диссеминируют во вн утренние органы, не размножаются в них и не оказывают дисбиотического действия при пероральном поступлении в организм теплокровных. животных. Таким образом, полученные данные дают основание считать, что штамм Achromobacter album ВНИИСХМ В-322 Д как непатогенный для теплокровных организмов может быть использован в микробиологической промышленности для изготовления бактериального препарата. Способы размножения и условия хранения. Выращивают и поддерживают жизнеспособность на МПА, а также на глюкозоаспарагинозой среде (среда Муромцева) при температуре 28°C. Хранится при комнатной температуре с периодическим пересевом (6 раз в год). Для хранения в сублимационно-высушенном состоянии выращивают на МПА, биомасса смывается обезжиренным молоком, которое используется в качестве защитной среды. Суспензию замораживают при температуре - 25 26°C, высушивают при температуре 45 - 50°C и закрывают в пенициллиповые флаконы. Флаконы хранятся как в холодильнике, так и при комнатной температуре. Культура не диссоцирует. Положительные свойства штамма: Пример 1. Активность растворения изучали с использованием глюкозо-аспарагиновой жидкой среды Муромцева (глюкоза - 10г, аспарагин - 1г, калия сульфат - 0,2г, магния сульфат - 0,2г, трикальцийфосфат - 5,0г, водопроводная вода - 1000мл). Содержание подвижного определяли фотоколориметрически по методу Эрдеи на десятые сутки после инокуляции. При культивировании штамма сравнения (стандартного) Bacillus megaterium, AP-I вместо добавляли, согласно прописи автора, высокодисперсный фосфат железа. Полученные данные представлены в табл.1. Из табл.1 видно, что штамм Achromobacter album ВНИИСХМВ-322Д накапливает подвижного фосфора в культуральной среде в 6 раз больше, чем штамм Bacillus megaterium AP-I. Пример 2. Продуцирование стимуляторов роста растений. Изучали в жидкой среде Муромцева (состав выше). Среду разливали в колбы Эрленмейера на 250мл. Культуру выращивали в термостате при температуре 28°C. Для изучения активности синтеза стимулятора роста растений b-индолилуксусной кислоты (ИУК) в среду добавляли триптофан (исходный продукт для синтеза стимулятора роста из расчета 0,05мас.%). Количество (b-индолилуксусной кислоты определяли с помощью реактива Сальковского. На десятые сутки в культуральной среде содержалось 68,3мкг/мл b-индолилуксусной кислоты (табл.2). По способности синтезировать ИУК штамм Achromobacter album ВНИИСХМ В-322 Д не уступает известному ростактивирующему консорциуму штаммов Azotobacter chroococcum u Azotobacter vinelandi (А.с. СССР №1476831, 1986). Последний накапливает на среде Федорова (среда для азотобактера) до 67мкг/мл ИУК. Пример 3. Сохранность клеток бактерий на сухи х семенах после бактеризации. Свойство сохранять жизнеспособность клеток бактерий в воздушно-сухих условиях, а также устойчивость их против действия фунгицидов и инсектицидов позволяет проводить бактеризацию семян заблаговременно, что имеет важное значение для производства. Обработка семян сахарной свеклы (шт. Achromobacter album ВНИИСХМ В-322Д) проведена заблаговременно на Винницком семенном заводе одновременно с обработкой семян фунгицидом ТМТД, инсектицидом адифуром и прилипателем СМАН20. Бактеризованные семена сохранялись в кладовой при температуре, которая не опускалась ниже 0°C. Наблюдали за сохранностью клеток (их численностью) на семенах через определенные промежутки времени. Полученные данные представлены в табл.3. Результаты свидетельствуют о достаточной устойчивости штамма против действия воздушносухой среды, действия ТМТД и ади фура. Пример 4. Эффективность бактеризации семян сахарной свеклы. Исследование проведено в полевом опыте на черноземе выщелоченном. Почва высокоплодородная. Площадь опытной делянки 50м 2, учетной - 25м 2, повторность четырехкратная. Урожай учитывался полной уборкой учетной площади, сахаристость корнеплодов определялась заводской лабораторией Носовского сахарного завода. Бактеризация семян сахарной свеклы сорта Белоцерковская, 45 проведена в лаборатории заблаговременно до посева -13.02.90, посев осуществлен 12.04.90. В день посева на одном семени находилось около 400тыс. клеток бактерий. Обработка семян штаммом Вас. megaterium, var. phosphaticum а также препаратом флавобактерин проведена в день посева (согласно инструкции). Полученные данные представлены в табл.4. Из таблицы видно, что инокуляция семян сахарной свеклы штаммом Achromobacter album ВНИИСХМ В-322 Д, обеспечила резкое уменьшение заболеваемости проростков "корнеедом", повышение урожая на 15% и сахаристости корнеплодов на 0,9%. Стандартные штаммы немного уступали по влиянию на урожай и практически не повлияли на сахаристость. Пример 5. Эффективность бактеризации семян сахарной свеклы, проведенной на семенном заводе совместно с обработкой их ТМТД, адифуром и прилипателем СМАН-20. Испытание проведено в полевом опыте на черноземе выщелоченном, высокоплодородном. Площадь опытной делянки - 50м 2, учетной - 25м 2, повторность четырехкратная. Урожай учитывали полной уборкой учетной площади, сахаристость корнеплодов определялась лабораторией Носовского сахарного завода. Бактеризация семян (сорт Уладовская, 35) проведена 18.03., посев 06.05.91. В день посева на бактеризованном семени находилось около 620тыс. клеток. Результаты представлены в табл.5. Полученные данные свидетельствуют, что бактеризация семян шт. Achromobacter alb. ВНИИСХМ В-322 Д в 2,5 раза увеличила всхожесть, намного уменьшила пораженность проростков "корнеедом", увеличила на 14,4% урожай и на 0,5% сахаристость корнеплодов. В течение 1989 - 1991гг. проведено восемь аналогичных полевых опытов. Во всех случаях получены положительные результаты. Урожайность увеличивалась на 8 - 21%, сахаристость - на 0,5 - 1,0%. Пример 6. Производственное испытание. Бактеризация семян сахарной свеклы проведена на Винницком семенном заводе 28.01.91 одновременно с обработкой инсектицидом адифуром и прилипателем СМАН-20 из расчета 20мл культуральной среды (титр 2млрд. клеток в 1мл) на 1кг семян. Семена были высеяны в колхозе им. Котовского Томашпольского района Винницкой области на темно-серой лесной почве на площади 85га, контрольная площадь - 5га. Посевная норма - 7кг/га. Учет урожая проведен в ранние сроки уборки - 3 сентября, сахаристость определена в заводской лаборатории 5 сентября. Полученные данные представлены в табл.6. Результаты свидетельствуют, что заводская бактеризация семян сахарной свеклы, осуществляемая одновременно с их инкрустацией, обеспечивает повышение урожайности и сахаристости корнеплодов. Сбор сахара на 3 сентября увеличивался на 10,2ц/га. В течение 1990 - 1991гг. проведено шесть полевых испытаний эффективности бактеризации семян сахарной свеклы штаммом Achr.album ВНИИСХМ В-322 Д в колхозах Винницкой области. Урожай возрастал на 13 - 24%, сахаристость - на 0,5 1,7%. Пример 7. Получение препарата на основе штамма Achromobacter album ВНИИСХМ В-322 Д. Для получения бактериального препарата штамм В-322 Д выращивают на глюкозоаспарагиновой среде следующего состава, г: глюкоза 10,0; аспарагин 1,0; вода водопроводная - до 1л. Среду стерилизуют при 0,5атм 20мин. В стерильную среду вносят 5г/л Посевной материал вносят в стерильную среду в количестве 3 - 5% от объема. Культур у выращивают в колбах на круговой качалке при 200 - 220об/мин при температуре 37°C в течение 48 72 часа. При этом титр препарата не менее 2млрд. клеток в 1мл. Таким образом, штамм Achromobacter album ВНИИСХМ В-322 Д, обладающий способностью улучшать фосфорное питание растений, продуцирующий физиологически активные вещества , не обладающий патогенными свойствами, может быть использован в микробиологической промышленности при изготовлении препарата для повышения сахаристости и урожая сахарной свеклы.