Вакцинний штам бактерій bacillus anthracis сб проти сибірки тварин

Вакцинний штам бактерій Bacillus anthracis СБ (Депозитарій Державного наукового контрольного інституту біотехнологій і штамів мікроорганізмів (МАП) Міністерства аграрної політики України, реєстраційний номер 072), що використовують для виробництва вакцини проти сибірки тварин. (19) (21) u200811904 (22) 07.10.2008 (24) 10.03.2009 (46) 10.03.2009, Бюл.№ 5, 2009 р. (72) ДОЦЕНКО ВІКТОР ВАСИЛЬОВИЧ, UA, ЄВДОКИМЕНКО МИКОЛА ІВАНОВИЧ, U A, П АРХОМЕНКО Н АТАЛІЯ АДОЛЬФІВН А, U A, ДЗЮБА ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ, U A, БЕЗВІН ЄВГЕН ІВАНОВИЧ, U A, ІВАНОВА ЛЮДМИЛА МИХАЙЛІВНА, U A, ДЕРЯБІН ОЛЕГ МИКОЛАЙОВИЧ, U A, КУМЕДА ІВАН ПЕТРОВИЧ, UA, МІРОШНИК СВІТЛАН А ПЕТРІВН А, UA (73) ДОЦЕНКО ВІКТОР ВАСИЛЬОВИЧ, UA, ЄВДОКИМЕНКО МИКОЛА ІВАНОВИЧ, U A, П АРХО 3 39746 4 Bacillus anthracis 55 - ВНИИВВиМ ↓ Мутанти, які володіють низькою залишковою вірулентностю, яка хаВідбір за вірулентністю та імуногеннірактеризується LD50 вище 5,0´106 мікробних живих клітин та висостю кою імуногенністю ↓ Відбір за чутливістю до пеніциліну, Мутанти, які не чутливі до амфотеріцину В, інраконазолу, кетоконаамфотеріцину В, інраконазолу, кето- золу, поліміксіну, цефепіну, це фтібутен у коназолу. Для дослідження сибіркового штаму СБ використовувалися популяційні дослідження, основані на хромосомних маркерах. Геном Bacillus anthracis складається з хромосоми, розміром 5,23 Mb (мегабаз), та двох великих плазмід - рХОІ (182 kb (кілобаз)) та рХО2 (96 kb). Відсутність будь-якої плазміди призводить до атенуації для більшості тваринних моделей. Синтез токсину кодується плазмідою рХОІ, вона несе три гена екзотоксина-pag, lef і суа. Перший з них кодує синтез протективного антигена, другий - летального фактора, третій - набрякового фактора. Плазміда рХО2 несе гени, які визначають синтез капсули. Складність генетичної ідентифікації Bacillus anthracis СБ обумовлена значною гомологією геномів представників групи Bacillus cereus і наявністю 4 різних варіантів плазмідного складу штамів збудника сибірки (наявність обох плазмід, відсутність обох, відсутність однієї з двох) (таблиця 1). Таблиця 1 Штам 1 2 3 4 Вірулентний Вакцинний Авір улентний Непатогенний капсула токсин + + + + Об'єктивна і достовірна ідентифікація сибіркового мікроба і його диференціація від інших представників виду Bacillus cereus може відбуватися лише при використанні олігонуклеотидних праймерів як до плазмідних, так і до специфічних хромосомних локусів. Недавні популяційні дослідження, основані на хромосомальних маркерах, показали, що Bacillus anthracis СБ є одним з найбільш мономорфних серед відомих бактеріальних видів. Головну роль в клітинній токсичності відіграє рА (протективний антиген), бо жоден з факторів токсину - суа (набряковий) або lef (летальний) не може приєднатися до клітин доки рА не зв'яжеться з клітинною поверхнею. рА приєднується до специфічного рецептору поверхні клітин ссавців (М.м. 83кД). Після приєднання рА розрізається на два фрагменти, при цьому менший фрагмент (20кД) вивільнюється в середовище, а більший (63кД) залишається приєднаним до рецептора. Цей фрагмент потім може зв'язуватись з суа або lef, і комплекс за допомогою рецептор-зв'язаного ендоцитозу переноситься на внутрішню поверхню мембрани. Гентамер комплексу pA-lef або р А-суа утворює пору в клітинній мембрані, через яку токсичний білок проходить в клітину. Як lef, так і суа діють на внутрішньоклітинні мішені. Сигнали, пов'язані з хазяїном, які впливають на транскрипцію генів токсину та капсули, включають температуру та концентрацію СО2. Наявність плазміда рХО1 РХО2 + + + + патогенність людина тварина + + + колонії форма М R М S Характеристика штаму СБ за наявністю плазмідних та хромосомних маркерів методом полімеразної ланцюгової реакції: рХО1+ (РА+, LF+, EF+); рХО2- (Сар-). Штам СБ не несе плазміду рХО2 і, таким чином, не здатний синтезувати капсулу. Для виявлення плазміди рХО1 (гени білкових факторів сибіркового токсину) були використані олігонуклеотидні праймери з послідовністю, на повний ген РА: прямий - 5'- GTATATGAAAAAACGAAAAGTGTTAATACC-3' та зворотній - 5'- GGATCCTAC AAAC AATCTC AAAGG-3'. Для виявлення генів капсули були використані олігонуклеотидні праймери з послідовністю: прямий - 5'-CTGAGCC ATTAATCGATATG-3' та зворотній - 5'-TCCCACTTACGTAATCTGAG-3'. Для перевірки (верифікації) отриманих результатів з геном РА додатково був ампліфікований фрагмент гена РА розміром 96п.н. з праймерами: прямий - 5'-TCCTAAC ACTAACGAAGTCG-3' та зворотній - 5'-GAGGTAGAAGGATATACGGT-B' з наступним проведенням рестрикаційного аналізу ферментом Мbо 1/Розмір і кількість (три) отриманих фрагментів в СБ, 55 та 34 F співпадали. Вакцинний штам бактерій Bacillus anthracis СБ, який пропонується, характеризуються такими фізіологічними ознаками: Морфологія клітин: при мікроскопії пофарбованих за Грамом препаратів виготовлених з культур на МПА - прямі палички фіолетового кольору (5-8´0,8-1мкм), поодинокі або у ланцюжках різної 5 39746 довжини; без капсул; спори овальні, безбарвні, утворюються у центрі клітин. Рухливість: палички нерухомі. Морфологія колоній на твердих поживних середовищах: колонії R-форми, сірувато-білі, округлі, опуклі, з хвилястим краєм і зернистою масою всередині. Культуральні особливості на рідких поживних середовищах: за візуальною оцінкою добової культури штаму в МПБ (рН 7,2-7,4): на дні пробірки утворюється білуватий пухкий осад, бульйон над осадом прозорий, плівка і пристінне кільце не утворюються. На середовищі з сироваткою крові великої рогатої худоби: ріст по всьому стовпчику у вигляді хмарок; утворюється значніший осад, ніж на МПБ. Ферментативна активність: ферментує цукрозу, глюкозу з виділенням кислоти без виділення газу; не ферментує маніт, лактозу, мальтозу; знебарвлює метиленову синьку протягом 30 і більше хвилин. При висіванні на кров'яному агарі через 24 години гемоліз відсутній, згодом - наявність зон гемолізу. Чутливість до антибіотиків: найбільш чутливий до ампіциліну, еритроміцину, те трацикліну, левоміцитину, гентаміцину, цефаклору, амікацину, доксіцикліну, імпенему, менш чутливий до неоміцину, стрептоміцину, ністатину, олендоміцину. Нечутливий до амфотеріцину В, інтроконазолу, кетоконазолу, поліміксину, цефепіну, це фтібутен у. Біологічні властивості: при внутрішньочеревному введенні білим мишам масою 18-20г LD50 складає 12,4-12,6´106 живих мікробних клітин. Підшкірне введення 1см 3 кролям масою 2-2,5кг: 170млн. живих мікробних клітин не викликає їх загибелі, а у місці введення спостерігається підвищення температури протягом перших трьох діб і набряки 1´1,5см, які згодом зникають. Капсулоутворення: в органах уражених тварин і на середовищах ГКІ з 40% вмістом сироватки ГКІ відсутнє. Капсули навколо вегетативних клітин відсутні. При культивуванні штаму Bacillus anthracis СБ поверхневим методом в 4-х літрових бутля х накопичення досягає 2,0-2,4млрд. спор на бутель. Зберігання: культур у запропонованого штаму зберігають у ліофілізованому стані або у вигляді суспензії спор на гліцерині. Запропонований штам має особливі властивості: низьку вірулентність, яка характеризується значенням LD50 вище 5,0´106 мікробних живих клітин, а саме: 12,4-12,6´106 живих мікробних клітин при значній імуногенності. При цьому продуктивність штаму при поверхневому культивуванні досягає 2,4млрд. спор на бутель, при цьому масова частка спор складає 99-100%. Як показали дослідження, поряд з низьким рівнем вірулентності і, відповідно, низьким рівнем реактогенності, новий штам володіє вираженою резистентністю до антибіотиків - амфотеріцину В, інраконазолу, кетоконазолу, поліміксину, цефепіну, цефтібутен у, тобто йому не властива чутливість до цих антибіотиків. Такі властивості штаму дозволяють поліпшити якість вакцини проти сибірки, розширити спектр можливостей використання вакцини, використову 6 вати в необхідних випадках вакцинацію тварин у поєднанні з їх лікуванням антибіотиками, при цьому відкривається можливість сполучення нечутливості культури штаму до визначених антибіотиків. Приклади відтворення штаму. Приклад 1. Спорову культур у штаму Bacillus anthracis СБ отримують шляхом культивування бактерій Bacillus anthracis СБ на стерильному живильному середовищі - м'ясо-пептонному агарі в 4літровому бутлі. Бутель заповнюють живильним середовищем у кількості 150см на бутель. Таке середовище розподіляють по внутрішній поверхні бутля тонким шаром з одночасним охолоджуванням середовища. Потім живильне середовище витримують протягом 24 годин при температурі 37±1°С з метою перевірки на стерильність, після чого засівають бактеріальною суспензією Bacillus anthracis СБ і витримують дві доби при температурі 37±1°С, а потім п'ять діб при температурі 32±1°С. Спори, що утворились, змивають з поверхні агару 100мл стерильної дистильованої води і концентрують до необхідного рівня. Накопичення біомаси нового штаму складає 2,0-2,4млрд. спор на бутель, при цьому масова частка спор складає 99-100%. Для стабілізації кількості мікробних клітин суспензію спор змішують з 30-33% гліцерином. Готову вакцину зберігають при температурі 215°С. Отриману культур у штаму Bacillus anthracis СБ випробовують на типовість, однорідність, капсулоутворення, залишкову вір улентність, нешкідливість, імуногенність, чутливість до антибіотиків. Ця культура характеризується такими параметрами: типовість - типовими для штаму культуральноморфологічними властивостями; однорідність - за типом колоній, кількість дисоційованих колоній Rформ не перевищує 5%, відсутність капсул у мазках - відбитках з органів тварин, що загинули від введення підвищених доз штаму Bacillus anthracis СБ. Вірулентність отриманої культури, яка визначена на білих мишах масою 18-20г, характеризується значенням LD50 12,5´106 живих мікробних клітин. Чутливість до пеніциліну визначають методом паперових дисків з антибіотиками. Цей штам найбільш чутливий до еритроміцину, тетрацикліну, левоміцитину, менше чутливий - до неоміцину, стрептоміцину, нечутливий до амфотеріцину, інраконазолу, кетокопазолу, це фепіну, цефтібутену, поліміксину. Ім уногенність штаму визначають на морських свинках масою 380-400г, щеплених штамом Bacillus anthracis СБ, з наступним контрольним зараженням другою вакциною Ценковського М-71 в летальній дозі. Введення культури штаму Bacillus anthracis СБ у вказаних дозах забезпечує захист 90-100% тварин при 100% загибелі контрольних не щеплених тварин. Приклад 2. Спорову культур у штаму Bacillus anthracis СБ отримують шляхом культивування бактерій Bacillus anthracis СБ як у прикладі 1, але на стерильному живильному середовищі - дріжжево-пептонновому, за таким прописом: дріжжевий екстракт очищений - 2г, калій фосфорнокислий двозаміщений - 0,5г, кальцій хлористий - 0,4г, цинк сірчанокислий - 0,01г, мідь сірчанокисла - 0,01г, залізо сірчанокисле - 0,01г, амоній сірчанокислий 7 39746 2г, антивспінювач 0,2см 3, або поліпропіленгліколь - 0,1см 3, вода дистильована 1000см 3. При вирощуванні 24 години і постійній аерації - 3,6ммолей О2/л/год., рН середовища - 7,4-7,6. Культура штаму, яка одержана, характеризується такими параметрами: типовість - типовими для штаму культурально-морфологічними властивостями; однорідність - за типом колоній, кількість дисоційованих колоній R-форм не перевищує 4,8%, відсутність капсул у мазках - відбитках з органів тварин, що загинули від введення підвищених доз штаму Bacillus anthracis СБ. Вірулентність отриманої культури, яка визначена на білих мишах масою 18-20г, характеризується значенням LD50 12,6´106 живих мікробних клітин. Накопичення біомаси нового штаму складає 2,0-2,4млрд. спор на бутель, при цьому масова частка спор складає 99-100%. Культура штаму, яка одержана, найбільш чутлива до еритроміцину, тетрацикліну, левоміцитину, менш чутли ва - до неоміцину, стрептоміцину, нечутлива до амфотеріцину В, інраконазолу, кетоканазолу, полімексину, цефепіну, це фтібутен у, поліміксину. Імуногенність штаму визначають на морських свинках масою 380-400г, щеплених культурою штаму Bacillus anthracis СБ, з наступним контрольним зараженням другою вакциною Ценковського М-71 в летальній дозі. Введення культури штаму Bacillus anthracis СБ у вказаних дозах забезпечує захист 90-100% тварин при 100% загибелі контрольних не щеплених тварин. Приклад 3. Спорову культур у штаму Bacillus anthracis СБ отримують шляхом культивування бактерій Bacillus anthracis СБ як у прикладі 1, але на стерильному живильному середовищі - ферментативний гідролізат сухого білкового концентрату з побічних продуктів м'ясо-молочних виробництв 8 (ферментативний гідролізат СБК) у співвідношенні з водою, об'єм.% : ферментативний гідролізат СБК - 25, вода - останнє. Культура штаму, яка одержана, характеризується такими параметрами: типовість - типовими для штаму культурально-морфологічними властивостями; однорідність - за типом колоній, кількість дисоційованих колоній R-форм не перевищує 4,8%, відсутність капсул у мазках - відбитках з органів тварин, що загинули від введення підвищених доз штаму Bacillus anthracis СБ. Вірулентність отриманої культури, яка визначена на білих мишах масою 18-20г, характеризується значенням LD50 12,4´106 живих мікробних клітин. Накопичення біомаси нового штаму складає 2,0-2,4млрд. спор на бутель, при цьому масова частка спор складає 99-100%. Культура штаму, яка одержана, найбільш чутлива до неоміцину, стрептоміцину, нечутливий до амфотерицину, інраконазолу, кетоконазолу, цефепіну, це фтібутен у, поліміксину. Імуногенність штаму визначають на морських свинках масою 380-400г, щеплених штамом Bacillus anthracis СБ, з наступним контрольним зараженням другою вакциною Ценковського М-71 в летальній дозі. Введення культури штаму Bacillus anthracis СБ у вказаних дозах забезпечує захист 90-100% тварин при 100% загибелі контрольних не щеплених тварин. Порівняльні характеристики нового штаму, якій одержали, як показано у прикладах 1, 2, 3, і відомих штамів наведені у таблицях 2, 3, на діаграмі (Фіг.) та пояснювальній таблиці 4 до неї, при цьому дані для табл.2 отримані методами проб і регресійного аналізів. Таблиця 2 Порівняльна оцінка вірулентності запропонованого та відомих штамів Штам Кількість тварин на одну дозу СТИ (аналог) 15 55 ВНИИВВиМ (прототип) 5 СБ (запропонований) 4 Концентрація спор Мікробних кліlg тин в см 3 5 5 1´10 6 1´106 7 1´107 8 1´108 7 7 1´10 8 8 1´10 8,3 2´108 6,7 5,5´106 7,1 11,5´106 7,5 32´106 79 86´106 LD50 Загибель тваМікробних клітин, рин, % млн. 27 47 1,6 60 100 60 5,0 80 100 25 50 12,6 75 100 lg 6,2 5,0 7,1 9 39746 10 Таблиця 3 Характеристика чутливості штамів до антибіотиків Антибіотик Штам СБ (запропонований) Стерильна зона Амфотеріцин В Інтроканазол Кетоконазол Еритроміцин Тетрациклін Неоміцин Левоміцитин Стрептоміцин Поліміксін Пеніцилін Цефкпін Цефтібутен + + + + + ВНИИВВиМ 55 (прототип) Стерильна зона + + + + + + Таблиця 4 Спектр чутливості штамів до антибіотиків Найбільший діаметр зони відсутності росту штаму, мм 0 15 20 25 30 35 разом Джерела інформації: 1. ТУУ 46.15.201.97. ГОСТ 15 991-86. Вакцина СТІ жива проти сибірки тварин. 2. Патент №2173342, Российская Федерация, МПК C12N1/12, А61К39/07, заявл. 19.01.2000, опубл. 10.09.2001. Кількість антибіотиків з 54, до яких штами чутливі 55 СТІ СБ 7 6 6 7 6 5 10 21 И 12 8 16 15 12 12 3 1 4 54 54 54 3. ТУ-1009-3-87. ОСТ 10-19-002-00 Штамм 55ВНИИВВиМ сибиреязвенный вакцинный. 11 Комп’ютерна в ерстка Л.Литв иненко 39746 Підписне 12 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601