Спосіб отримання форм шавлії, стійких до осмотичного стресу in vitro

Реферат: Спосіб отримання форм шавлії, стійких до осмотичного стресу in vitro, включає виділення зародків і культивування їх на живильному середовищі, отримання проростків і адаптацію пробіркових рослин in vivo. UA 68312 U (12) UA 68312 U UA 68312 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області сільського господарства, зокрема до біотехнології, і може бути використана в селекції для отримання нових вихідних форм шавлії мускатної (Salvia sclarea L.) на основі клітинної селекції та ембріокультури, а також в дослідженнях по фізіології стійкості рослин до осмотичного стресу. Важливою умовою успішного селекційного процесу є наявність різноманітного вихідного селекційного матеріалу, стійкого до абіотичних стресових факторів навколишнього середовища і хвороб. Одним з ефективних сучасних біотехнологічних методів отримання таких резистентних генотипів є клітинна селекція, при якій найчастіше ізольовані клітини, калюсні тканини або органи культивують в асептичних умовах на селективних середовищах з додаванням речовин, які імітують стресовий фактор. Такий експериментальний підхід створення стійких генотипів оснований на виявленій в багатьох дослідженнях кореляції між реакціями клітинних культур у відповідних селективних умовах in vitro і польовою стійкістю рослин до посухи, засолення, важких металів, хвороб та інших несприятливих чинників. Відомий спосіб відбору стійких до сольового і водного стресу клітинних ліній і регенерантів тютюну, який включає отримання клітинної суспензії, її висів на селективні середовища, відбір стійких клітинних ліній, які впродовж декількох пасажів (до 7-10 пасажів) культивують в стресових умовах. Потім з калюсних тканин проводили регенерацію рослин, які укоріняли на безгормональному середовищі. Для одержання солестійких ліній в живильне середовище додавали 20 г/л Na2SO4, або 20 г/л солей морської води, а для моделювання водного стресу 0,8М маніту [див. Левенко Б.А., Сергеева Л.Е., Виноградов В.А., Ларькина Н.И., Миронов Е.К. Отбор и анализ устойчивых к солевому и водному стрессу клеточных линий табака и регенерантов из них // Экспериментальная генетика растений в ускорении селекционного процесса. Сб. науч. тр. - К.: Наук. Думка, 1989. - С. 101-110. Аналог]. Недоліком цього способу є необхідність проведення достатньо складних маніпуляцій (отримання суспензійної культури, її висів на агаризоване середовище і вирощування одиночних клонів), а також тривалих багатомісячних субкультивувань клітинних ліній, при яких у більшості видів рослин здатність до регенерації, як правило, знижується аж до її повної втрати. Відомий спосіб відбору форм пшениці, стійких до захворювання фузаріозу колоса, при якому як експланти використовували зародки, ізольовані із зрілого насіння, які культивували на живильному середовищі з селективним фактором - фільтратом культуральної рідини (отриманому при вирощуванні штамів гриба Fusarium graminearum Shwabe) в сублетальній концентрації [див. Игнатова С.Α., Бабаянц О.В. Методические основы отбора форм пшеницы мягкой, утойчивых к Fusarium graminearum Shwabe, в условиях in vitro II Наук, праці ПФ "КАТУ" НАУ.-2008. - т. 107. - С. 136-141. Аналог]. Спосіб розроблений з урахуванням видових особливостей м'якої пшениці, призначений для відбору толерантних до фузаріозу колоса експлантів і проведенню оцінки стійкості пшениці до цього захворювання на рівні ізольованих зародків; він не передбачає відбору форм, стійких до осмотичного стресу. Найбільш близьким до заявленого є спосіб отримання форм шавлії з новими ознаками in vitro, який включає вичленення зародків і культивування їх на живильному середовищі з фітогормонами, отримання проростків і адаптацію пробіркових рослин in vivo [див. Русина Л.В., Бугара A.M., Бугаенко Л.А. Использование метода культуры изолированных зародышей для получения межвидовых гибридов шалфея // Физиология и биохимия культ, растений.-1997. -Т. 29, № 2. - С. 121-128. Найближчий аналог]. У відомому способі після проведення гібридизації культурного виду шавлії Salvia sclarea L. і дикорослих видів S. scabiosifolia, S. grandiflora, S. aethiopis зародки виділяли із зав'язей і культивували на живильному середовищі Уайта з додаванням 1-2 мг/л індолілоцтової кислоти (ІОК), 4-6 мг/л гіберелової кислоти і 400-600 мг/л гідролізату казеїну. Використання ембріокультури і культивування на вказаному живильному середовищі дозволило збільшити вихід життєздатних гібридних рослин до 12,2-66,6 %, залежно від комбінації схрещування. Цей спосіб розроблений з метою отримання міжвидових і міжсортових гібридів шавлії і також як і попередній аналог, не передбачає відбору форм, стійких до осмотичного стресового фактора. Недоліком способу є також те, що зародки ізолюють на торпедоподібній стадії розвитку, що можливо тільки у певну пору року після проведення гібридизації. Проте, по сукупності загальних ознак цей аналог прийнятий нами в якості найближчого аналога. Технічною задачею і результатом корисної моделі є розробка способу отримання форм шавлії, стійких до осмотичного стресу in vitro, за рахунок використання іншого живильного середовища, селективних добавок і експланта на іншій стадії розвитку. 1 UA 68312 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Поставлена задача і технічний результат досягається тим, що спосіб отримання форм шавлії, стійких до осмотичного стресу in vitro, включає виділення зародків, їх культивування на живильному середовищі з селективним фактором, відбір розвитих проростків і адаптацію пробіркових рослин in vivo. Новим є те, що як експланти використовують зародки із зрілого насіння сортів або сортозразків культурного виду шавлії мускатної (S. sclarea), культивування зародків проводять на живильному середовищі Мурасіге і Скута (МС), доповненому як фітогормонами ІОК і для створіння селективного фону - NaCl або манітом, а відбір розвинених проростків проводять через 1,5-2 місяці культивування. Вказані ознаки необхідні і достатні для здійснення способу і досягнення технічного результату. Корисна модель характеризується також тим, що в живильне середовище МС ІОК добавляють в межах 1,9-2,1 мг/л, a NaCl або маніт - відповідно в межах 0,7-1,0 % і 4,0-8,0 %. Ці межі добавок в живильне середовище нами вибрані в результаті проведення численних дослідів для створіння оптимальних умов відбору стійких до селективних факторів зародків і отримання рослин-регенерантів. При цьому за нижніми межами добавок NaCl або маніту не було достатнього селективного навантаження на зародки і диференціації сортів, а при збільшенні концентрації добавок відбувалася їх загибель і проростки не розвивалися. Ці ознаки є факультативними, оскільки відносяться в основному до культури шавлії S. sclarea L. in vitro і при використанні інших видів можуть змінюватися в ширших межах. Причинно-наслідковий зв'язок нових ознак і технічного результату полягає в наступному: - використання як вихідних експлантів зародків із зрілого насіння (а не зародків на торпедоподібної стадії розвитку із зав'язей) для відбору форм шавлії in vitro дозволяє проводити науково-дослідні роботи впродовж всього року і прискорити отримання рослин; - культивування експлантів на живильному середовищі МС з додаванням як фітогормонів тільки ІОК (що спрощує і здешевлює живильне середовище) дозволяє отримати достатньо високу частоту проростання зародків - в контролі 81-98 % залежно від сорту; - додавання в живильне середовище іонного або неіонного осмотика (NaCl або маніту) при сублетальних концентраціях дозволяє проводити відбір форм з підвищеною стійкістю до цих стресових факторів, що набагато ефективніше за традиційну селекцію і сприяє створенню надалі посухо- і солестійких селекційних зразків. Приклад здійснення способу. У дистильованій воді розчиняють макро- і мікроелементи відповідно до пропису МС, додають вітаміни, сахарозу, фітогормон ІОК (2,0 мг/л), а також осмотики NaCl (0,7-1,0 %) або маніт (4,0-8,0 %), доводять кислотність до рН 5,6 і добавляють розчинений агар. Розчин перемішують, розливають по пробірках і автоклавують 20 хвилин при 0,8 атм. Зріле насіння шавлії мускатної поверхнево стерилізують в умовах ламінар-боксу впродовж двох хвилин в 0,1 % розчині діациду і три рази промивають в автоклавованій дистильованій воді по 10 хв. Під мікроскопом МБС-9 із насіння виділяють зрілі зародки, використовуючи очний пінцет і препарувальну голку. Зародки поміщають на живильне середовище МС з вказаними добавками і культивують при температурі +26 °C, інтенсивності освітлення 2-3 тисячі люкс, 16-годинному фотоперіоді впродовж 1,5-2 місяців. Відбір стійких проростків проводять при візуальному аналізі, при цьому відбирають найбільш розвинені проростки заввишки не менш 2-3 см, з 2-3 парами листків і розвиненою кореневою системою з довжиною основного кореня більше 4-5 см. Пробірки з відібраними проростками відкривають, наливають в них дистильовану воду так, щоб вона покрила поверхню агару і залишають відкритими на 2-4 години. Потім переносять рослини в торф'яні стаканчики з сумішшю торфу і землі вирощують при звичайних режимах адаптації in vivo з підвищеною вологістю. Через 6-8 тижнів рослини висаджують у вазони з землею та вирощують в умовах закритого ґрунту або в полі. При дослідній перевірці зазначеного способу вивчали розвиток зародків у трьох сортів шавлії, що розрізняються по ступеню польової посухостійкості. Найменший коефіцієнт посухостійкості мав сорт С-785 (27); у сортів Ай-Тодор і Тайган цей показник був відповідно - 42 і 60. Були виявлені максимальні концентрації NaCl або маніту в живильному середовищі, при яких спостерігався розвиток проростків, що підтверджується таблицями 1 і 2. 2 UA 68312 U Таблиця 1 Вплив різних концентрацій NaCl в живильному середовищі МС і сорту на частоту утворення проростків в культурі ізольованих зародків шавлії, % від контролю. Концентрація NaCl, % 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 5 С-785 42,8±3,9 24,9±2,1 0 0 0 Сорти Ай-Тодор 40,0±4,1 29,2±2,3 12,4±1,1 6,2±0,8 0 Тайган 90,9±9,4 58,4±6,1 54,6±5,0 28,7±2,9 9,7±1,0 Як видно з таблиці 1, при збільшенні концентрації NaCl в середовищі відбувалося значне зниження частоти утворення проростків із зародків - від 90,9 до 0 % від контролю (без селективного фактора). Розвиток проростків in vitro варіював залежно від посухостійкості сорту і був менш пригнічений у стійкішого сорту Тайган. У цього сорту сублетальна концентрація NaCl, при якій можна було отримати одиничні нормально розвинені проростки, була вища (1,0 %), ніж у менш стійких сортів Ай-Тодор (0,9 %) і С-785 (0,7 %). Таблиця 2 Вплив різних концентрацій маніту в живильному середовищі МС і сорту на частоту утворення проростків в культурі ізольованих зародків шавлії, %. Концентрація маніту, % 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 С-785 81,0±6,7 70,4±6,7 50,0±5,1 30,0±3,2 24,3±2,2 5,9±0,5 0,5±0,1 0 0 0 Сорти Ай-Тодор 92,5±8,5 89,4±8,2 70,0±7,1 42,8±4,3 20,6±1,8 20,0±1,9 12,5±1,1 4,5±0,5 0 0 Тайган 98,0±8,8 85,7±8,0 77,4±7,3 52,8±4,9 35,0±3,1 24,0±2,1 17,0±1,5 10,0±0,8 7,1±0,5 0 10 15 20 25 При вирощуванні зародків цих сортів на середовищі з введенням маніту були встановлені сублетальні концентрації цього осмотика, які також залежали від посухостійкості сорту, - у сорту С-785 вони були нижчі, ніж у стійкіших Ай-Тодора і Тайгана (7-8 %) (Таблиця 2). Виявлений зв'язок між посухостійкістю сортів шавлії в польових умовах і стійкістю ембріокультур до NaCl і маніту в умовах in vitro дозволяє відбирати форми з підвищеною стійкістю до осмотичного стресу. Якщо відома стійкість сорту або селекційного зразка, то відбір для більш посухостійких генотипів слід проводити при верхніх вказаних дозах NaCl або маніту. Для проведення непрямої оцінки стійкості до осмотичного стресу декілька відібраних в ембріокультурі зразків (№№ 785-24; 524; АТ-09; № 226-08) були повторно піддані осмотичному стресу при культивуванні зародків, що виділяли із зрілого насіння, на живильному середовищі з різними концентраціями маніту. Таке культивування може бути використане при необхідності і для повторного відбору. У таблиці 3 представлені дані що до розвитку проростків у відібраних зразків і вихідних сортів С-785, Ай-Тодор і Тайган (% до контролю без маніту). Встановлено, що у відібраних в ембріокультурі зразків при всіх концентраціях маніту частота формування проростків була вища в порівнянні з вихідними сортами. Це свідчить про більш високий рівень стійкості до осмотичного стресу у цих зразків, що проявляється на рівні ізольованих зародків. Коефіцієнти кореляції між частотою утворення проростків в культурі ізольованих зародків (особливо при високих дозах осмотика) і польовою посухостійкістю генотипів були на рівні 0,760,98. При польовій оцінці форм, відібраних в ембріокультурі, було показано підвищення у них 3 UA 68312 U коефіцієнта посухостійкості і деяких господарсько корисних ознак (маси суцвіть і збору ефірної олії) в порівнянні з вихідними сортами. Таблиця 3 Вплив генотипу і концентрації маніту в живильному середовищі на частоту формування проростків в культурі зародків шавлії, % до контролю (на середовищі без маніту). Генотип Сорт С-785 № 785-24 (відібраний в ембріокультурі "С785" на середовищі з 4 % маніту) № 524 (відібраний в ембріокультурі "С-785" на середовищі з 4 % маніту) Сорт Ай-Тодор АТ-09 (відібраний в ембріокультурі "АйТодор" на середовищі з 0,9 % NaCl) Сорт Тайган № 226-08 (відібраний в ембріокультурі "Тайган" на середовищі з 0,8 % NaCl) 5 4 22,3±1,9 Концентрація маніту, % 5 6 7 4,4±0,4 1,7±0,2 0 8 0 27,0±2,0 15,4±1,2 10,1±0,9 3,4±0,3 1,8±0,2 38,1±4,0 21,5±2,0 12,2±1,1 3,8±0,4 0 30,6±2,1 21,6±2,0 13,5±1,0 2,7±0,3 0 34,7±3,0 29,6±2,2 15,1±1,2 7,0±0,8 1,9±0,2 26,3±2,5 21,1±2,0 17,6±1,5 10,5±1,0 2,6±0,2 33,4±3,5 33,4±3,1 23,0±2,1 17,5±1,3 5,5±0,6 Вказаний спосіб дозволяє підвищити ефективність і прискорити проведення селекційної роботи по виведенню нових сортів шавлії мускатної за рахунок відбору і отримання стійких до осмотичного стресу форм, який можна проводити в умовах in vitro цілорічно. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 1. Спосіб отримання форм шавлії, стійких до осмотичного стресу in vitro, що включає виділення зародків і культивування їх на живильному середовищі, отримання проростків і адаптацію пробіркових рослин in vivo, який відрізняється тим, що як експланти використовують зародки із зрілого насіння сортів або сортозразків культурного виду шавлії мускатної (Salvia sclarea), культивування зародків проводять на живильному середовищі Мурасіге і Скуга (МС), доповненому як гормонами ІОК і для створення селективного фону - NaCl або манітом, а відбір розвинених проростків проводять через 1,5-2 місяці культивування. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що в живильне середовище МС ІОК додають в межах 1,9-2,1 мг/л, a NaCl або маніт - відповідно в межах 0,7-1,0 % і 4,0-8,0 %. 20 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4