Спосіб одержання нанокомпозиту високодисперсного кремнезему-кластерів срібла з протимікробними та сорбційно-детоксикаційними властивостями

Реферат: Спосіб одержання нанокомпозиту високодисперсного кремнезему-кластерів срібла з протимікробними та сорбційно-детоксикаційними властивостями характеризується тим, що механічну активацію суміші нітрату срібла і нанокремнезему проводять у керамічному кульовому млині у вологій атмосфері. Після механоактивації зразки прогрівають на повітрі. UA 69526 U (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ НАНОКОМПОЗИТУ ВИСОКОДИСПЕРСНОГО КРЕМНЕЗЕМУ-КЛАСТЕРІВ СРІБЛА З ПРОТИМІКРОБНИМИ ТА СОРБЦІЙНО-ДЕТОКСИКАЦІЙНИМИ ВЛАСТИВОСТЯМИ UA 69526 U UA 69526 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В основу корисної моделі, що заявляється, поставлено задачу розробити спосіб одержання комплексного засобу для лікування інфекційних захворювань травного каналу, шкіри та слизових оболонок, в якому за рахунок введення нових складників досягається поєднання сорбційно-детоксикаційних властивостей з високою протимікробною активністю відносно етіологічних чинників інфекційних захворювань, включаючи поліантибіотикорезистентні штами. Існує засіб для лікування гострих кишкових захворюваннях, що супроводжуються діарейним синдромом (сальмонельоз, харчові токсикоінфекції), основу якого складає діоксид кремнію, який шляхом адсорбції зв'язує і виводить з організму токсини екзогенного та ендогенного походження, харчові і бактеріальні алергени, мікробні ендотоксини, токсичні продукти, що утворюються в процесі розпаду білків, та випускається вітчизняною фармацевтичною промисловістю у вигляді порошку для приготування 0,05 % водної суспензії [1]. Вказаний засіб хоч і володіє вираженими сорбційно-детоксикаційними властивостями, але характеризується недостатнім рівнем протимікробної активності відносно представників патогенної і умовно-патогенної мікрофлори кишечнику. Саме мікробний фактор відіграє роль вирішального пускового механізму виникнення захворювання і лежить в основі хронізації патологічного процесу. Тому для підвищення ефективності лікування пацієнтів діоксид кремнію слід поєднувати з антисептичними препаратами [2]. Найближчим за суттю корисної моделі, що заявляється, є спосіб одержання силікатів перехідних металів, які мають співвідношення оксид кремнію: срібло в діапазоні від 1:1 до 1:19,57 [3]. Відсутні дані відносно спектра протимікробної активності сполуки, синтезованої вказаним вище методом, особливо проти збудників гострих кишкових захворюваннях, тому, варто припустити, що даний засіб не володіє достатньою протимікробною активністю відносно патогенних мікроорганізмів, що викликають гострі кишкові інфекції. Крім того, він не усуває токсико-алергічний компонент патогенезу захворювання, в основі якого лежить вивільнення мікробних ферментів, екзо- і ендотоксинів, а також медіаторів запалення. Суть корисної моделі полягає в способі одержання антибактеріального засобу, який є комбінацією наночастинок срібла та нанодисперсного кремнезему, який полягає в тому, що механічну активацію суміші нітрату срібла і нанокремнезему (співвідношення AgNО3: SiО2 відповідає  OH = 0,8 ммоль/г) проводили у керамічному кульовому млині у вологій атмосфері протягом 5 годин; після механоактивації зразки прогрівали 3 години на повітрі при 550 °C. Спосіб одержання засобу здійснюється наступним чином: У керамічному кульовому млині протягом 5 годин перемішують 10,9 г срібла нітрату та 80,0 г нанорозмірного кремнезему. Після механоактивації зразки прогрівали 3 години на повітрі при 550 °C [4]. Використані матеріали: - нанорозмірний кремнезем - було використано пірогенний високодисперсний кремнезем марки А-300 виробництва п/о "Орисіл" (м. Калуш, Україна) з величиною питомої поверхні 300 2 м /г. Такий кремнезем складається з сферичних частинок діаметром 9-10 нм, на поверхні яких містяться силанольні групи =Si-OH і сорбовані молекули води. Концентрація вільних силанольних груп (  OH ) - головних сорбційних центрів поверхні - для дослідженого зразка становила 0,8 ммоль/г. - срібла нітрат - реактив українського виробництва (Хімлаборре актив, Київ) відповідає ГОСТ 1277-75, та містить чистого срібла нітрат 99.85 %. Приклад 1. Дослідження нанокомпозиту високодисперсного кремнезему-кластерів срібла на кількісний вміст срібла. Умови проведення дослідження та розрахунки вказані нижче. Досліджуваний розчин. До 0,5 г (з точністю до 0,1 мг) ретельно розтертого зразка в конічній колбі додають 5 мл води і 2 г гідроксиду калію, отриману суміш залишають на ніч. 0,1 Μ розчин роданіду амонію. Близько 7,6 г роданіду амонію розчиняють в 1000,0 мл дистильованої води, встановлюють титр розчину по стандартному 0,1 Μ розчину нітрату срібла. 0,01 Μ розчин роданіду амонію. 0,1 Μ розчин роданіду амонію розводять в 10 разів дистильованою водою. Хід визначення. Досліджуваний розчин готують у трьох паралелях. Безпосередньо перед аналізом до досліджуваного розчину додають 7 мл концентрованої азотної кислоти, необхідно дочекатися повного розчинення чорного осаду. До суміші додають 3-5 крапель 140 г / л розчину амонію сульфату заліза. Потім титрують при інтенсивному перемішуванні 0,01 Μ розчином роданіду амонію до появи рожевого забарвлення. Вміст срібла (X) у відсотках знаходять за формулою: 1 UA 69526 U (%)  5 CNH 4 CNS   V NH 4 CNS   MAg  100%, m  100 де C(NH4CNS) - концентрація 0,01 Μ розчину роданіду амонію, в моль/літр; V(NH4CNS)об'єм 0,01 Μ розчину роданіду амонію, що пішов на титрування досліджуваного розчину, у мілілітрах; m - маса наважки зразка, використана для приготування випробуваного розчину, у грамах; M(Ag) - молекулярна маса срібла (дорівнює 107,87), в грамах/моль. m 0,5006 0,5079 0,5051 10 15 20 25 30 35 40 45 50 C(NH4CSN) V(NH4CSN) M(Ag) X(Ag) X(Ag) среднее 0,0099 37,1 37,4 37,5 107,87 7,91 7,86 7,93 7,90 Використовуючи метод Фольгарда, було встановлено, що в досліджуваному зразку концентрація срібла становить 7,9 %, що повністю відповідає розрахунковим даним, і вказує на точність методу синтезу, та відсутність втрат срібла при синтезі нанокомпозиту високодисперсного кремнезему-кластерів срібла. Приклад 2. Проведено визначення нових протимікробних властивостей нанокомпозиту високодисперсного кремнезему-кластерів срібла, а саме мінімальної інгібуючої концентрації та мінімальної бактерицидної концентрації по відношенню до Staphylococcus aureus УКМ В-904 (АТСС 25923), Escherichia coli УКМ В-906 (АТСС 25922), Candida albicans УКМ Y-1918 (АТСС 885-653), Pseudomonas aeruginosa УКМ В-900 (АТСС 9027). Отримання добових культур мікроорганізмів, приготування вихідних і робочих суспензій мікроорганізмів та препарату, визначення мінімальної інгібуючої концентрації (МІС) досліджуваної речовини проводили у рідкому середовищі LB (Luria-Bertani broth, Merck, Germany). Висів аліквот дослідних і контрольних суспензій для встановлення мінімальної бактерицидної/фунгіцидної концентрації (MBC/MFC) препарату проводили на щільне поживне середовище LB (Luria-Bertani medium, Merck, Germany) в чашки Петрі. Вихідний розчин нанокомпозиту високодисперсного кремнезему-кластерів срібла одержували шляхом розчинення 672,8 мг в 2 мл середовища LB. Отриману таким чином суспензію сполуки із концентрацією 336,4 мг/мл, застосовували для визначення антимікробних властивостей щодо S. aureus. Для С. albicans концентрацію композиту у вихідному розчині знижували вдвічі (168,2 мг/мл). З цією метою 1 мл вихідного розчину змішували із аналогічними об'ємом вихідного середовища. Таким же чином досягали двократного зниження концентрації вихідного розчину (84,1 мг/мл) при дослідженні активності щодо Е. coli та P. aeruginosa. В подальшому, для кожного виду мікроорганізмів готували ряд із 12 пробірок, в які вносили по 0,5 мл середовища LB. Із вихідного розчину нанокомпозиту відбирали 0,5 мл і вносили у перші пробірки кожного ряду, після чого готували подвійні серійні розведення. Добові культури мікроорганізмів отримували шляхом їх культивування у рідкому середовищі LB протягом 18-24 год. при 37 °C. Із добових культур готували вихідні бактеріальні суспензії за 8 стандартом мутності 0,5 Од по МакФарланду (титр близько 1,5 × 10 КУО/мл). Останні розводили у співвідношенні 1:5 (по об'єму) і отримували робочі суспензії мікроорганізмів. В подальшому, у пробірки із приготовленими подвійними розведеннями досліджуваного препарату вносили по 0,5 мл робочих суспензій. Таким чином, кінцевий об'єм розчину в досліджуваних пробірках сягав 1 мл. При цьому, титр S. aureus, Ε. coli і P. aeruginosa становив 7 10 КУО/мл, а С. albicans-10' КУО/мл. В дослідних зразках робочі концентрації, із яких розпочинали досліджувати вплив нанокомпозиту високодисперсного кремнезему-кластерів срібла на мікроорганізми, становили: для S. aureus-84,1 мг/мл, для С. albicans-42,05 мг/мл, а для Е. coli та P. aeruginosa-21,03 мг/мл. Кінцевими досліджуваними концентраціями нанокомпозиту високодисперсного кремнеземукластерів срібла були: для S. aureus-0,04 мг/мл, для С. albicans-0,02 мг/мл, а для Е. coli та P. aeruginosa-0,01 мг/мл. Вміст чистого срібла у новосинтезованому нанокомпозиті срібла "Аргосил" становив 7,61 %. Виходячи із цього, діапазон концентрацій чистого срібла у дослідних пробірках із вказаним препаратом для S. aureus знаходився в межах від 6400 до 3,13 мкг/мл, для С. albicans - від 3200 до 1,56 мкг/мл, а для Е. coli та P. aeruginosa - від 1600 до 0,78 мкг/мл. Одночасно із дослідними варіантами в дослідженнях були також використані контрольні зразки. Для отримання позитивних контролів росту мікроорганізмів у пробірки із 0,5 мл LB вносили аналогічні об'єми кожної із досліджуваних культур без додавання препаратів. Як 2 UA 69526 U 5 10 15 20 25 30 35 негативні контролі росту мікроорганізмів використовували пробірки із 0,5 мл LB та 0,5 мл робочих суспензій досліджуваних культур (без внесення препаратів), які витримували протягом 24 год. при 4 °C. Як негативні контролі чистоти середовища слугували пробірки із 1 мл середовища LB без додавання бактеріальних суспензій і препаратів. Як негативні контролі чистоти препаратів використовували їх подвійні серійні розведення в концентраціях, аналогічних створюваним у дослідних зразках, до яких замість бактеріальних суспензій добавляли 0,5 мл вихідного LB. Всі описані контролі готували у двох зразках. Інкубування дослідних і контрольних суспензій, за виключенням негативних контролів росту мікроорганізмів, здійснювали на качалці при 37 °C та інтенсивному перемішуванні (240 об/хв.) протягом 24 год. Перед врахуванням результатів перевіряли негативні контролі середовища і препаратів на відсутність росту мікроорганізмів, а позитивні контролі - на наявність росту. Після цього дослідні зразки порівнювали із негативними контролями росту мікроорганізмів, вносячи корективи на наявність мутності у суспензіях відповідно до негативних контролів чистоти препаратів. Для кожного ряду дослідних пробірок визначали першу концентрацію, при якій спостерігалась відсутність видимого росту мікроорганізмів. Дану концентрацію позначали як мінімальну інгібуючу (пригнічуючу, бактеріостатичну) концентрацію (МІС) відповідного препарату по відношенню до досліджуваного виду мікроорганізмів. Наступним етапом досліджень було визначення мінімальних бактерицидних концентрацій препаратів. Для цього із усіх дослідних зразків з відсутністю видимого росту, а також із усіх контрольних пробірок здійснювали висів 200 мл відповідних суспензій на чашки із щільним середовищем LB. Після рівномірного розподілення кожної із суспензій по поверхні агару і його підсихання, чашки інкубували при 37 °C протягом 24 год. в термостаті. В подальшому, на щільному середовищі підраховували утворені колонії, які вказували на кількість життєздатних мікроорганізмів у відповідних бактеріальних суспензіях. Даний показник виражали у колонієутворюючих одиницях (КУО). Мінімальну бактерицидну (фунгіцидну) концентрацію відповідного препарату по відношенню до досліджуваних видів мікроорганізмів визначали за першою концентрацією, при якій із внесених на щільне середовище аліквот бактеріальних суспензій виявлявся ріст менше 200 КУО. Вказані показники для S. aureus, Ε. coli та P. aeruginosa позначали як МВС (мінімальна бактерицидна концентрація), а для С. albicans - як MFC (мінімальна фунгіцидна концентрація). У висівах із позитивних і негативних контролів росту оцінювали наявність газонів зливного росту, а з негативних контролів середовища і чистоти препаратів (із зразків з максимальними концентраціями препарату) - відсутність росту мікроорганізмів. При дотриманні зазначених умов для контрольних зразків проведений експеримент розглядали як поставлений коректно. Описані дослідження повторювали двократно, отримані результати піддавали статистичній обробці. Результати експериментальної перевірки активності нанокомпозиту високодисперсного кремнезему-кластерів срібла по відношенню до досліджуваних мікроорганізмів Видова належність досліджуваних мікроорганізмів Staphylococcus aureus УКМ В-904 Escherichia coli УКМ В-906 Candida albicans УКМ Y-1918 Pseudomonas aeruginosa УКМ В-900 40 45 Мінімальна інгібуюча концентрація МІС (мкг/мл) Мінімальна бактерицидна/фунгіцидна концентрація MBC/MFC (мкг/мл) перерахунок на препарату чисте срібло препарату перерахунок на чисте срібло 330 25 2630 200 330 25 660 50 660 50 2630 200 2630 200 5260 400 Отримані дані про вплив нанокомпозиту високодисперсного кремнезему-кластерів срібла на тестові штамами мікроорганізмів для визначення антимікробної дії лікарських засобів (Staphylococcus aureus УКМ В-904 (АТСС 25923), Escherichia coli УКМ В-906 (АТСС 25922), Candida albicans УКМ Y-1918 (АТСС 885-653), Pseudomonas aeruginosa УКМ В-900 (АТСС 9027)), стверджувати наявність протимікробних властивостей препарату. Таким чином, можна стверджувати, що нанокомпозит високодисперсного кремнезему кластерів срібла, володіє протимікробними властивостями Джерела інформації:: 3 UA 69526 U 5 10 1. Фещенко Ю. І. Антибіотикорезистентність мікроорганізмів. Стан проблеми та шляхи її вирішення / Ю. І. Фещенко, М. І. Гуменюк, О. С. Денисов // Український хіміотерапевтичний журнал, 2010. - № 1-2 (23). - С 4-10. 2. Савченко Д.С. "Розробка матриці-носія для наночастинок срібла". Український науковиймедичний молодіжний ж-л: К., 2011. - №2. - С. 289-290. 3. Прасад Яндапалі Дурга, Раджу Канумуру Рахул. Спосіб боротьби з мікроорганізмами та спосіб зниження рівня забрудненювача з використанням силікатів перехідних металів. Патент україни № UA 91005 С2. опубл. 01.2006. 4. Носач Л.В., Савченко Д.С., Власенко О.М. "Одержання і характеризація кластерів срібла на поверхні нанодисперсного кремнезему". Український науковий-медичний молодіжний ж-л: Київ, 2011. - №4. - С. 178. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Спосіб одержання нанокомпозиту високодисперсного кремнезему-кластерів срібла з протимікробними та сорбційно-детоксикаційними властивостями, який характеризується тим, що механічну активацію суміші нітрату срібла і нанокремнезему (співвідношення AgNO3 : SiO2 відповідає  OH = 0,8 ммоль/г) проводять у керамічному кульовому млині у вологій атмосфері протягом 5 годин, після механоактивації зразки прогрівають 3 години на повітрі при 550 °С. 20 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4