Спосіб контролювання та прогнозування імуногенності вакцин проти 2-го типу цирковірусної інфекції свиней

Реферат: Спосіб контролювання та прогнозування імуногенності вакцин проти 2-го типу цирковірусної інфекції свиней включає біопробу на поросятах з використанням цирковірусу 2-го типу та парвовірусу свиней. Для підвищення експресності та інформативності біопроби використовують ізолят цирковірусу, виділений в Україні, який вводять інтраперитонеально у суміші з парвовірусом свиней 5-7-добовим поросятам з гнізд свиноматок, щеплених випробовуваною вакциною проти цирковірусу. UA 70284 U (54) СПОСІБ КОНТРОЛЮВАННЯ ТА ПРОГНОЗУВАННЯ ІМУНОГЕННОСТІ ВАКЦИН ПРОТИ 2-ГО ТИПУ ЦИРКОВІРУСНОЇ ІНФЕКЦІЇ СВИНЕЙ UA 70284 U UA 70284 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної вірусології, а саме - до способів вакцинопрофілактики вірусних хвороб свиней. Контроль 2-го типу цирковірусної інфекції свиней (ЦВС-2) здійснюється, зокрема, шляхом застосування інактивованих та живих вакцин, основною вимогою до яких є достатній рівень імуногенності - тобто здатності вакцини забезпечити захист щепленого свинопоголів'я від захворювання на ЦВС-2. Відомий спосіб перевірки імуногенності вакцин проти ЦВС-2 передбачає щеплення свиней неблагополучних щодо синдрому мультисистемного виснаження поросят (PMWS) свиногосподарств, наприклад, комерційними вакцинами Circumvent PCV (Intervet, Нідерланди), Suvaxyn PCV2 One Dose (Fort Dodge Animal Health, США) чи "Ingelvac CircoFLEX" (фірми "Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc.", Австрія), з наступним комплексним епізоотологічним спостереженням за щепленими тваринами, яке включає контролювання середньодобового приросту, показників вибракування та смертності, а також щотижневий серомоніторинг (оцінка рівня накопичення у сироватках крові будь-яких антитіл проти збудника ЦВС-2), у порівнянні з групою не щеплених тварин упродовж всього циклу вирощування товарної свині [5М Enterprises Ltd., England, 1]. Цей спосіб оцінки вакцин проти ЦВС-2 запропоновано через складність штучного відтворення PMWS за віварних умов [1]. Він, хоч і непрямо, характеризує імуногенність вакцин проти ЦВС-2, проте ці характеристики скоріше свідчать про епізоотологічну ефективність та антигенність досліджуваних вакцин, а не про стійкість щепленої тварини до прямого зараження - яка, власне, і є методичною основою оцінки імуногенності (potency assessment) будь-якої вакцини [2]. Відомий також спосіб випробування імуногенності вакцин проти ЦВС-2 шляхом вимірювання рівня накопичення у щеплених свиней віруснейтралізуючих специфічних антитіл через певний час після щеплення піддослідною вакциною (Meerts, P. et al., 2006) в модифікованій реакції нейтралізації, РН [3]. Авторами способу у 2005 році було встановлено високу корелятивну залежність між рівнем нейтралізуючих вірус антитіл у сироватках крові щеплених поросят і їх стійкістю проти захворювання на ЦВС-2 [4]. У цьому способі на 2-3-му тижнях після щеплення досліджуваною вакциною у підсисних поросят відбирають проби крові і досліджують у реакції нейтралізації з 1000 інфекційних доз вірулентного штаму вірусу в культурі клітин РК-15. Результати реакції обліковують після фарбування зараженого моношару клітин у лунках планшетів імунопероксидазним (ІПМ) або імунофлуоресцентним (МФА) методами. Але реалізація цього способу можлива лише при використанні в реакції нейтралізації тих же штамів цирковірусу, що використано при виготовленні вакцини, що унеможливлює його застосування для перевірки вакцин проти ЦВС-2,що імпортуються в Україну. Найбільш близьким до рішення, що заявляється, є спосіб випробування імуногенності вакцин проти ЦВС-2 шляхом зараження щеплених досліджуваною вакциною поросят вірулентними штамами цирко- та парвовірусу свиней [Porcine circovirus and paravovirus vaccine Allan et al. - United States Patent 6217883, publication date: 02/07/2000]. За цим способом 5-7 поросят від серонегативної щодо ЦВС-2 свиноматки, щеплених у 7-добовому віці випробовуваною вакциною, у 30-40-добовому віці інтраназально заражають сумішшю (1:1 за об'ємом) західноєвропейських або американських польових штамів збудника ЦВС-2 та 5,0 парвовірусу свиней, кожний у дозі не менше 10 TCID50. Клінічний облік результатів біопроби проводять впродовж 35-40 діб після зараження. Підсвинки, щеплені недостатньо імуногенною вакциною, починають проявляти клінічні ознаки PMWS вже через три тижні після зараження (п.з.). Спочатку вони відмовляються від корму, потім впродовж 1,5-2 тижнів вони все більше відстають у розвитку від контрольних поросят, проявляють ознаки швидкої втомлюваності, розладів дихальної (діспное, кашель тощо) та/або травної систем органів (періодичні запори та проноси, значне схуднення на тлі нормального апетиту). У пробах кровіпідсвинків у наростаючих титрах виявляються антитіла проти ЦВС-2, а також генетичний та антигенний матеріали збудника. Підсвинки, щеплені досліджуваною вакциною з достатнім рівнем імуногенності, після зараження сумішшю іноземних штамів збудників ЦВС-2 та ПВС зазначені вище ознаки не проявляють. Основними недоліками відомого способу є наступні: 1) спосіб не дає можливості оцінити імуногенності вакцини для поросних свиноматок, а отже щодо захисту поросят від внутрішньоутробного зараження та зараження у підсисний період - ключових ланок епізоотичного ланцюга ЦВС-2, як репродуктивно-неонатальної інфекції свиней; 2) у відомому способі використовуються іноземні контрольні штами збудника ЦВС-2, що не гарантує імуногенності випробовуваної вакцини для свиней в українському нозоареалі ЦВС-2 - адже в ньому циркулюють варіанти збудника з невідомими антигенними властивостями; 3) тривалість робіт з зараженими тваринами («віварні роботи») за відомим способом складає не менше 1 1 UA 70284 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 місяця, що негативно впливає на кошторис контрольних випробувань і на стан рекреаційного навантаження на довкілля. В основу корисної моделі поставлена задача розробити доступний для вітчизняної ветеринарної практики спосіб перевірки поствакцинального противірусного імунітету при ЦВС-2, який дозволяв би оцінювати здатність випробовуваних вакцин проти ЦВС-2 захищати поросят від внутрішньоутробного зараження та зараження у підсисний період. Поставлена задача вирішується тим, що у способі контролювання та прогнозування імуногенності вакцин проти 2-го типу цирковірусної інфекції свиней, який включає «до-віварну» та «віварну» фази, згідно з корисною моделлю, для підвищення експресності та інформативності біопроби використовують ізолят цирковірусу, виділений в Україні, який вводять інтраперитонеально у суміші з парвовірусом свиней 5-7-добовим поросятам з гнізд свиноматок, щеплених випробовуваною вакциною проти цирковірусу. Порівняльний аналіз заявленого рішення з найближчим аналогом дозволяє зробити висновок, що на відміну від найближчого аналога в ньому щеплюються не поросята, а свиноматки: це дає можливість, по-перше, оцінити вплив досліджуваної вакцини на репродуктивну функцію свиней, а, по-друге, дослідити її властивість формувати молозивний імунітет проти ЦВС-2, який має ключове значення для захисту поросят від перезараження у підсисний період. Адже у зараженому цирковірусною інфекцією стаді свиноматки обов'язково виробляють молозивні антитіла: проте їх рівень є недостатнім для захисту поросят від зараження вірусом, джерелом якого є та ж свиноматка чи інші поросята з гнізда, або об'єкти довкілля; з іншого боку, молозивні антитіла сильно заважають формуванню повноцінного поствакцинального імунітету у підсисних поросят, а отже не дозволяють перервати епізоотичний ланцюг ЦВС-2 засобами вакцинопрофілактики. Тому найбільше значення у вакцинопрофілактиці ЦВС-2 має щеплення батьківського стада. Приклад конкретного виконання. Приклад 1 3 Перед виконанням способу накопичують по 30 см вірусної культуральної рідини контрольних штамів «Слобідський-08» («С-08») цирковірусу та «NADL-8» парвовірусу свиней. Для цього 2-3-добову культуру клітин РК-15, вільну від цирко- та парвовірусів та вирощену у двох-чотирьох матрацах відповідної ємності (до повного виповнення моношару), заражують по 3 4,5-5,0 lgФУО50/см (фокусо-утворюючих одиниць) зазначеними штамами, кожним окремий матрац. Для зараження у інокулят додають ДЕАЕ-декстран (фірма Pharmacia, Швеція) до кінцевої концентрації 1-3 мг на 1 мл. Заражену культуру клітин інкубують при 37 °С впродовж 40-45 хвилин для контакту з вірусом і після цього моношар у кожному матраці тричі промивають стерильним фізіологічним розчином. Після промивки у кожний матрац з культурою клітин вносять поживне середовище до вихідного обсягу і інкубують матраци з цирковірусом впродовж 3 діб поспіль, а матраци з парвовірусом - до повної руйнації моношару з типовими ознаками цитопатичної дії парвовірусу (4-5 діб). Отримані вірусні розплодки перевіряють на інфекційну активність методом титрування в культурі клітин РК-15, вирощеній на скельцях чи в планшетах. Для цього моношар клітин на скельцях чи на дні планшетів інокулюють не менш ніж у 5-ти повторах досліджуваним розплодком, взятим у розведенні 1:1000 на поживному середовищі, як наведено вище. Після промивки моношару зазначену культуру інкубують при 37 °С впродовж 18-20 годин і фіксують 96 етанолом (за кімнатної температури впродовж 1 години). Зафіксовану культуру фарбують імунопероксидазним або імунофлуоресцентним методом, з використанням відповідних діагностикумів. Вірусні розплодки вважаються придатними для подальшого використання, якщо при мікроскопії зазначених вище препаратів у одному полі зору виявляється не менше двох фокусів (груп клітин) з позитивною реакцією на цирко- чи парвовірус, відповідно. З розплодків цирко- та парвовірусу роблять суміш у співвідношенні 2:1 або 1:1; її розфасовують по 5-10 мл і закладають на зберігання при мінусових температурах. Приклад 2 Для здійснення способу не менше 3 свиноматок у господарстві, стаціонарно неблагополучному щодо цирковірусних інфекцій свиней, щеплюють досліджуваною вакциною проти ЦВС-2 у дозі та за схемою, передбаченими чинною настановою з застосування вакцини. Приклад 3 Для здійснення пропонованого способу з 3-5 гнізд від свиноматок, щеплених як наведено у прикладі 2, або з гнізд свиноматок племінного чи товарного свино-господарства, де проводиться щеплення поголів'я проти ЦВС-2 досліджуваною вакциною і де планується прогнозувати епізоотичну ситуацію, відбирають по 1-2 сосуна 3-4 добового віку і переводять у режим штучного годування за умов інфекційного віварію. У 5-9-добовому віці у поросят з краніальної вени відбирають проби сироваток крові, які до закінчення біопроби зберігають у морозильнику 2 UA 70284 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 (мінус 8-20 °С), і заражують сумішшю вірусів, приготованою як вказано у прикладі 1. Зараження проводять у дозі 5,0 мл інтраперитонеально. Як контроль аналогічно інокулюють таких же поросят від не щеплених свиноматок, 3-4 голови. Піддослідних і контрольних поросят утримують окремо. Спостереження за ними проводять методом клінічного огляду з обов'язковою дворазовою (вранці та ввечері) термометрією впродовж 15 діб. На 3-5 добу після зараження у контрольних поросят з'являються перші ознаки цирковірусної інфекції субферильна гарячка мінливого типу (ректальна температура тіла щодня впродовж 2-3 діб поспіль зростає до 39,6-39,8 °С переважно ввечері, а вдень нормалізується), різке виснаження (втрата приросту, схуднення) при збереженні чи навіть посиленні апетиту. За наявності прихованого носійства контрольними поросятами збудників бактеріальних інфекцій (патогенних ентеробактерій, клостридій, стафілококів тощо), навіть у мінімальних дозах, призводить їх до загибелі на 7-10 добу після зараження (п.з.). Піддослідні поросята від щеплених свиноматок з недостатнім імунітетом проти ЦВС-2 демонструють такі ж клінічні ознаки, як і контрольні. При цьому зазначені ознаки можуть бути дещо стертими (затримка захворювання у часі, коротший період гарячки, не таке різке та швидке схуднення) у порівнянні з контролем, що свідчить про наявність слабкого імунітету у щеплених свиноматок, якого недостатньо для захисту піддослідних поросят від захворювання та зараження. Захворювання на ЦВС-2 одного і більше піддослідних поросят є підставою для висновку про непридатність досліджуваної цирковірусної вакцини чи схеми її застосування для профілактики ЦВС-2 в Україні. Якщо піддослідні поросята не захворіли впродовж 15 діб спостереження, у них відбирають проби сироваток крові і, кожну окремо, досліджують за допомоги комерційного набору для ELISA - паралельно з пробами крові, взятими у них перед зараженням - на приріст антитіл проти цирковірусу ЦВС-2. Відсутність приросту антитіл проти ЦВС-2 в ELISA свідчить про стійкість піддослідних поросят не лише до захворювання, але й до зараження. Це дає підстави для висновку про придатність вакцини та схеми її застосування для профілактики ЦВС-2 в Україні. Приріст антитіл у ELISA на рівні 10 % і більше свідчить про те, що набутий від свиноматок імунітет забезпечує стійкість піддослідних поросят лише до захворювання, а не до зараження. Останнє є підставою для висновку про неповну відповідність досліджуваної вакцини чи схеми її застосування для профілактики ЦВС-2 в Україні. В цьому, як і в першому випадку, прогноз розвитку ситуації у господарстві щодо ЦВС-2 є негативним. Таким чином, запропонований спосіб контролювання та прогнозування імуногенності вакцин проти 2-го типу цирковірусної інфекції свиней дозволяє: 1. Забезпечити ключові ланки протиепізоотичних заходів в Україні проти ЦВС-2, як репродуктивно-неонатальної інфекції свиней. 2. Забезпечити придатність способу для підбору вакцинних засобів проти ЦВС-2, які були б гарантовано ефективними для захисту свинопоголів'я саме від українських варіантів збудника. 3. Скоротити тривалість «віварних робіт»: як з економічних причин, так і з огляду біологічної безпеки та рекреаційного навантаження на довкілля. Список використаних джерел, взятих до уваги при експертизі: 1. Balasch, М., J. Segales, С. Rosell, M. Domingo, A. Mankertz, A. Urniza, and J. Plana-Duran. 1999. Experimental inoculation of conventional pigs with tissue homogenates from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome. J. Comp. Pathol. 121:139-148. 2. OIE Manual, Geneva, 2006 3. Meerts, P., Misinzo, G., Lefebvre, D., Nielsen, J., Bitner, A., Kristensen, C. S. & Nauwynck, H. J. (2006). Correlation between the presence of neutralizing antibodies against porcine circovirus 2 (PCV2) and protection against replication of the virus and development of PCV2-associated disease. BMC Vet Res 2,6 . 4. Meerts, P., Van Gucht, S., Cox, E., Vandebosch, A. & Nauwynck, H. J. (2005b). Correlation between type of adaptive immune response against porcine circovirus type 2 and level of virus replication. Viral Immunol 18, 333-341. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Спосіб контролювання та прогнозування імуногенності вакцин проти 2-го типу цирковірусної інфекції свиней, що включає біопробу на поросятах з використанням цирковірусу 2-го типу та парвовірусу свиней, який відрізняється тим, що для підвищення експресності та інформативності біопроби використовують ізолят цирковірусу, виділений в Україні, який вводять 3 UA 70284 U інтраперитонеально у суміші з парвовірусом свиней 5-7-добовим поросятам з гнізд свиноматок, щеплених випробовуваною вакциною проти цирковірусу. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4