Спосіб підготовки ядровмісних клітин пуповинної/плацентарної крові до кріоконсервування

Реферат: Спосіб підготовки ядровмісних клітин пуповинної/плацентарної крові до кріоконсервування включає фракціонування, концентрацію та експозицію з кріопротекторним розчином. У суспензію клітин для кріоконсервування вводять один із препаратів - комбінацію вітамінів В1 В6 та В12 (Nerviplex, Janssen Pharmaceutica, Бельгія) або аналог  -ліпоєвої кислоти (Діаліпон, "Фармак", Україна) у концентрації 0,8 мкл/мл суспензії клітин. Витримують 10 хвилин і проводять експозицією з кріопротектором. UA 74165 U (12) UA 74165 U UA 74165 U 5 10 Корисна модель належить до галузі консервування тканин та клітин людини і може бути використана для підготовки гемопоетичної тканини до довгострокового зберігання в умовах банку гемопоетичних клітин при ультранизькій температурі (- 196 °C). Відомі способи кріоконсевування ЯВК пуповинної/плацентарної крові [1, 2] із використанням диметилсульфоксиду у кінцевій концентрації 10 %. До їх недоліків слід віднести неврахування наступних моментів. Одним з провідних факторів пошкодження біологічних систем, у тому числі і при кріоконсервуванні, є кріобіохімічна модифікація ліпідів під впливом процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) [3]. Так, у ході заморожування-відігрівання різних біологічних об'єктів завжди відбувається руйнування частини фосфоліпідів та накопичення продуктів деградації ліпідів у мембрані (вільні жирні кислоти, лізофосфатиди і лізолецитини, дієнові кон'югати та інш.). Ці процеси відбуваються у широкому температурному діапазоні [3]. При кріоконсервуванні O 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у мембранних фракціях клітин відбувається надмірне накопичення аніон-радикалів 2 , які в присутності НАД-Н активують ці процеси. Накопичення їх продуктів - високогідрофільних з'єднань - призводить до розрихлення мембрани. Патологічний вплив вільних радикалів проявляється у змінах структурно-функціональних характеристик біологічних мембран. Перш за все, у порушенні їх транспортної та захисної функції, підвищенні мікров'язкості, зміні проникливості для іонів. Внаслідок цього порушуються процеси життєдіяльності, відбувається деструкція й загибель клітин [3, 4]. Такі процеси впливають на якісні характеристики тканини в процесі кріоконсервування. Найближчим аналогом є спосіб підготовки ядровмісних клітин пуповинної крові до кріоконсервування, що включає фракціонування з використанням розчину "Гекодез" (Юріяфарм) та концентрацію клітин пуповинної крові, що здійснюється одночасно з їх гіпотермічною адаптацією до умов заморожування під захистом кріопротектора диметилсульфоксид в 5 % концентрації [6]. Зазначений спосіб не враховує стадію антиоксидантної обробки суміші клітин перед додаванням розчину кріопротектора. Задача корисної моделі - підвищити життєздатність ядровмісних клітин пуповинної крові в умовах проведення циклу заморожування-відтаювання з кріопротектором ДМСО. Вирішення задачі полягає у включенні на стадії підготовки до заморожування ЯВК ПК етапу антиоксидантної обробки, що досягається шляхом додавання до суспензії перед експозицією з 5 % розчином кріопротектора ДМСО одного з наступних препаратів - комбінації вітамінівантиоксидантів В1 В6 та В12 (Nerviplex, Janssen Pharmaceutica, Бельгія) або аналога  -ліпоєвої кислоти з комплексною прямою та непрямою антиоксидантною дією (Діаліпон, "Фармак", Україна) у концентрації 0,8 мкл/мл суспензії клітин і витримують 10 хвилин. Заявлений спосіб здійснюється таким чином. Після видалення еритроцитів та концентрації ядровмісних клітин, що проводять у гіпотермічних умовах та з застосуванням "замкненої" системи для заготівлі крові з послідовним або паралельним з'єднанням трьох мішків, до готової суспензії ЯВК ПК додають комбінацію вітамінів-антиоксидантів В1 В6 та B12 (Nerviplex, Janssen Pharmaceutica, Бельгія) (ВАО) у концентрації 0,8 мкл/мл суспензії ЯВК ПК або аналог  -ліпоєвої кислоти з комплексною прямою та непрямою антиоксидантною дією (Діаліпон, "Фармак", Україна) у концентрації 0,8 мкл/мл суспензії ЯВК ПК, суспензію обережно ресуспендують. Здійснюють еквілібрацію клітин з зазначеними антиоксидантними препаратами протягом 10 хв., після чого додають у співвідношенні об'ємів 1:1 охолоджений до 4 °C 10 % розчин кріопротектора ДМСО, клітини ресуспендують. Концентрат ЯВК ПК після перенесення до кріоконтейнерів або кріопробірок підлягає заморожуванню. Приклад 1. Пуповинну кров за прототипом змішували з розчином "Гекодез" у співвідношенні 1 частина розчину на 1 частину стабілізованої крові. Відстоювали 40 хв. у гіпотермічних умовах при температурі 4 °C. Видаляли еритроцитарний осад. Надосадову рідину з ЯВК центрифугували протягом 10 хв. зі швидкістю 1500 об/хв. в рефрижераторній центрифузі при температурі 4 °C. Видаляли дві третини надосадової рідини, отриманий осад ЯВК ресуспендували в рідині, що залишилася. До приготовленого концентрату ЯВК додавали охолоджений до температури 4 °C 10 % розчин ДМСО у співвідношенні 1:1 за об'ємом. Через 20 хвилин експозиції з розчином кріопротектора при температурі 4 °C отриману клітинну завись розливали у кріопробірки та заморожували у відповідності до загальноприйнятої програми для ядровмісних клітин під захистом кріопротектора ДМСО. Розморожування виконували на водяній бані при температурі 39±0,5 °C протягом 35±5 сек. Оцінку способа підготовки клітин до заморожування проводили шляхом аналізу збереженості ядровмісних клітин (методами суправітального забарвлення 0,1 % розчином трипанового синього та підрахунку вмісту), а також змін активності процесів перекисного окислення фосфоліпідів (за вмістом ізольованих подвійних зв'язків (ІПЗ), кон'югатів - дієнових (ДК), триєнових (ТК), оксодієнових (ОДК) та 1 UA 74165 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 кінцевих продуктів ПОЛ типу шифових основ (ШО)) перед заморожуванням та після відтаювання. Приклад 2. Пуповинну кров за способом, що заявляється, змішували з розчином "Гекодез" у співвідношенні 1 частина розчину на 1 частину стабілізованої крові. Відстоювали 40 хв. у гіпотермічних умовах при температурі 4 °C. Видаляли еритроцитарний осад. Надосадову рідину з ЯВК центрифугували протягом 10 хв. зі швидкістю 1500 об/хв. в рефрижераторній центрифузі при температурі 4 °C. Видаляли дві третини надосадової рідини, отриманий осад ЯВК ресуспендували в рідині, що залишилася. До приготовленого концентрату ЯВК додавали комбінацію вітамінів-антиоксидантів В1 В6 та В12 (Nerviplex, Janssen Pharmaceutica, Бельгія) у концентрації 0,8 мкл/мл клітинної суспензії. Обережно змішували шляхом погойдування і витримували протягом 10 хвилин (еквілібрація). Після цього додавали до приготовленої таким чином суспензії клітин охолоджений до температури 4 °C 10 % розчин ДМСО у співвідношенні 1:1 за об'ємом. Через 20 хвилин експозиції з розчином кріопротектора при температурі 4 °C отриману клітинну завись розливали у кріопробірки та заморожували у відповідності до загальноприйнятої програми для ядровмісних клітин під захистом кріопротектора ДМСО. Розморожування виконували на водяній бані при температурі 39±0,5 °C протягом 35±5 сек. Оцінку способу підготовки клітин до заморожування проводили шляхом аналізу збереженості ядровмісних клітин (методами суправітального забарвлення 0,1 % розчином трипанового синього та підрахунку вмісту), а також змін активності процесів перекисного окислення фосфоліпідів (за вмістом ізольованих подвійних зв'язків (ІПЗ), кон'югатів - дієнових (ДК), триєнових (ТК), оксодієнових (ОДК) та кінцевих продуктів ПОЛ типу шифових основ (ШО)) перед заморожуванням та після відтаювання. Приклад 3. Пуповинну кров за способом, що заявляється, змішували з розчином "Гекодез" у співвідношенні 1 частина розчину на 1 частину стабілізованої крові. Відстоювали 40 хв. у гіпотермічних умовах при температурі 4 °C. Видаляли еритроцитарний осад. Надосадову рідину з ЯВК центрифугували протягом 10 хв. зі швидкістю 1500 об/хв. в рефрижераторній центрифузі при температурі 4 °C. Видаляли дві третини надосадової рідини, отриманий осад ЯВК ресуспендували в рідині, що залишилася. До приготовленого концентрату ЯВК додавали аналог  -ліпоєвої кислоти з комплексною прямою та непрямою антиоксидантною дією (Діаліпон, "Фармак", Україна) у концентрації 0,8 мкл/мл клітинної суспензії. Обережно змішували шляхом погойдування і витримували протягом 10 хвилин (еквілібрація). Після цього додавали до приготовленої таким чином суспензії клітин охолоджений до температури 4 °C 10 % розчин ДМСО у співвідношенні 1:1 за об'ємом. Через 20 хвилин експозиції з розчином кріопротектора при температурі 4 °C отриману клітинну завись розливали у кріопробірки та заморожували у відповідності до загальноприйнятої програми для ядровмісних клітин під захистом кріопротектора ДМСО. Розморожування виконували на водяній бані при температурі 39±0,5 °C протягом 35±5 сек. Оцінку способу підготовки клітин до заморожування проводили шляхом аналізу збереженості ядровмісних клітин (методами суправітального забарвлення 0,1 % розчином трипанового синього та підрахунку вмісту), а також змін активності процесів перекисного окислення фосфоліпідів (за вмістом ізольованих подвійних зв'язків (ІПЗ), кон'югатів -дієнових (ДК), триєнових (ТК), оксодієнових (ОДК) та кінцевих продуктів ПОЛ типу шифових основ (ШО)) перед заморожуванням та після відтаювання. Відтворення процедур за прикладами 1 і 2, а також 1 і 3 проводили паралельно. У таблицях 1 і 2 представлені отримані результати, які в табл. 1 вказують на зміни показників у суспензіях ядровмісних клітин пуповинної крові у процесі кріоконсервування за прототипом і способом, що заявляється (із застосуванням комбінації вітамінів-антиоксидантів В1 В6та B12 (Nerviplex, Janssen Pharmaceutica, Бельгія)), і в табл. 2 - із застосуванням аналога  -ліпоєвої кислоти (Діаліпон, "Фармак", Україна). 2 UA 74165 U Таблиця 1 № Приклад досліду 1 2 3 4 5 І II І II І II І II І II ∆ показників перекисного окислення фосфоліпідів: ІПЗ ДК ТК ОДК ШО -1,114 -0,338 -0,028 -0,020 -0,006 -0,228 -0,189 -0,013 -0,006 -0,001 -4,938 -1,712 -0,227 -0,178 -0,122 -0,007 -0,127 0,017 0,027 -0,021 0,531 0,259 -0,040 -0,032 0,008 4,439 1,844 0,210 0,178 0,029 -0,464 -0,084 -0,058 -0,051 -0,005 -0,042 0,001 -0,010 -0,009 -0,002 -2,688 -0,387 -0,307 -0,274 -0,008 0,084 -0,053 -0,049 -0,035 -0,006 Життєздатність ∆ ЯВК а 94 91 90 91 97 98 90 92 95 97 1,500 0 1,250 0 1,400 0,050 3,000 0,500 2,700 0 б 86 90 84 90 92 97 88 90 88 95 Таблиця 2 № досліду Приклад ду І 1 II І 2 II І 3 II І 4 II І 5 II ∆ ЯВК 1,050 0,250 2,000 0,800 2,250 0,500 2,000 0 1,250 0,750 Життєздатність а 96 98 92 94 95 97 97 99 98 99 б 86 97 86 93 86 93 88 97 89 97 ∆ показників перекисного окислення фосфоліпідів: ІПЗ ДК ТК ОДК ШО -0,274 -0,121 -0,008 -0,005 -0,011 -0,044 -0,053 -0,001 -0,003 -0,009 -0,491 -0,164 -0,211 -0,112 -0,061 -0,292 -0,011 -0,044 -0,026 -0,012 -0,231 -0,090 -0,040 -0,045 -0,011 -0,115 0,003 -0,014 -0,022 -0,001 -0,167 -0,337 -0,089 -0,080 -0,007 -0,068 -0,059 -0,019 -0,028^ -0,001 -0,306 -0,119 -0,081 -0,068 -0,007 -0,114 0,147 0,012 0,012 0,000 Примітка: І - найближчий аналог; II - спосіб, що заявляється; ∆ - різниця показників до заморожування та після розморожування; а - показники до заморожування; б - показники після розморожування; ІПЗ - ізольовані подвійні зв'язки; ДК - дієнові кон'югати; ТК - триєнові кон'югати; ОДК - оксодієнові кон'югати; ШО - кінцеві продукти ПОЛ типу шифових основ; (-) - означає підвищення показника після розморожування. 5 10 15 Представлені у таблицях результати свідчать про підвищення життєздатності при збереженості вмісту розморожених ЯВК ПК при застосуванні антиоксидантних речовин за способом, що заявляється, по відношенню до результатів кріоконсервування за прототипом. При цьому також спостерігається суттєве зниження активності процесів перекисного окислення фосфоліпідів (за показниками ІПЗ, ДК, ТК, ОДК та ШО). Таким чином, спосіб, що заявляється, підвищує ефективність кріоконсервування ядровмісних клітин пуповинної/плацентарної крові для клінічного застосування, зменшує утворення продуктів вільнорадикального окислення на етапах кріоконсервування. Використання вище зазначених готових препаратів з антиоксидантними властивостями, що дозволені до клінічного парентерального застосування, забезпечує простоту виконання підготовчих до кріоконсервування стадій. Джерела інформації: 8 1. Пат. UA № 56992 МПК A01N 1/02 А 61К 35/14 Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин пуповинної/плацентарної крові. / Перехрестенко П.М., Калиниченко Т.О., Глухенька Г.Т.; ДУ „ІГТ АМНУ" - №. и201006071, заявл. 19.05.2010; опубл. 10.02.2011, Бюл. № 3,2011р. 3 UA 74165 U 6 5 2. Пат. RU2263448 (СІ) МПК A01N 1/02 А61К 35/14 Метод криоконсервирования пуповинной крови. / Мхеидзэ Д.М., Гришина В.В. - № RU20040116209, заявл. 28.05.2004; опубл. 11.10.2005. 3. Белоус A.M. Криобиология / Белоус A.M., Грищенко В.И. - К.: Наукова думка, 1994.-431 с. 4. Baria G. Free radicals and aging / G. Baria // Trends Neurosci.-2004.-27. - P. 595-600. 5. Biopreservation - Molecular-based Mitigation of the Preservation Challenges / J.G. Baust, J.M. Baust, K. Snyder, R. VanBuskirk // Problems of Cryobiology.-2008. -Vol. 18, N2. - P. 163. 6 6. Пат. UA № 21507 МПК A01N 1/00 A61K 35/14 Спосіб підготовки ядровмісних клітин пуповинної крові до кріоконсервування. /Перехрестенко П.М., Глухенька Г.Т., Калиниченко Т.О.; ДУ „ІГТ АМНУ" - № u 200610727, заявл. 10.10.2006; опубл. 15.03.2007, Бюл. № З, 2007 р. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Спосіб підготовки ядровмісних клітин пуповинної/плацентарної крові до кріоконсервування, що включає фракціонування, концентрацію та експозицію з кріопротекторним розчином, який відрізняється тим, що у суспензію клітин для кріоконсервування вводять один із препаратів комбінацію вітамінів В1 В6 та В12 (Nerviplex, Janssen Pharmaceutica, Бельгія) або аналог  ліпоєвої кислоти (Діаліпон, "Фармак", Україна) у концентрації 0,8 мкл/мл суспензії клітин, витримують 10 хвилин і проводять експозицією з кріопротектором. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4