Спосіб стимулювання протигрипозного імунітету

Реферат: Спосіб стимулювання протигрипозного імунітету, при якому уводять таурозид Sxl безпосередньо до чи після зараження як індивідуальну речовину або таурозид Sxl уводять одночасно з грипозною вакциною, причому тритерпеновий глікозид уводять перорально або у вигляді ін'єкцій, а вакцину вводять в організм згідно з рекомендацією виробника. UA 74219 U (12) UA 74219 U UA 74219 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель стосується медицини, а саме способів профілактики і лікування грипу, і може бути використана для ослаблення клінічних проявів грипу і збільшення виживаності заражених грипом людей і тварин незалежно від того, який антигенний варіант вірусу грипу є причиною захворювання. Прототипом вибрано спосіб стимулювання протигрипозного імунітету (Патент 2127605 С1, РФ, МПК А 61 K 39/00, С 07 Н 15/256. Спосіб стимулювання гуморальної і клітинної імунної відповіді на цільовий антиген / Криворутченко Ю.Л., Гришковець В.І., Андроновська І.Б., Кривошеїн Ю.С. - опубл. 20.03.99, бюл. № 8), який полягає у введенні в організм суміші цільового антигену й ад'юванту, що являє собою один із тритерпенових глікозидів таурозидів, виділених із різних органів рослин роду Hedera L. Ознаками прототипу, спільними з ознаками пропонованого способу, є: введення в організм тритерпенового глікозиду таурозиду Sx1. Згідно з описом, поданим у прототипі, цільовий вірусний антиген, що є очищеним глікопротеїдом вірусу, вводиться в імунізований організм разом із ад'ювантом на основі сапонінів таурозидів. Ад'ювант являє собою окремий тритерпеновий глікозид, що відноситься до таурозидів, або суміш таурозидів. При цьому ад'ювант, приготовлений з одного або декількох таурозидів, змішується з конкретним очищеним антигеном у забуференому ізотонічному розчині хлориду натрію (ЗІР) без іншого ад'юванту і вводиться в організм, який імунізується, у складі вказаної суміші. Крім того, ад'ювант на основі таурозидів може вводитися будь-яким прийнятним шляхом окремо від цільового антигену, що не містить інший ад'ювант, до введення антигену, під час або після введення антигену. Причинами, які перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату (підвищення ефективності стимуляції імунітету), є: неможливість уведення цільового антигену безпосередньо перед або після зараження, а також необхідність приготування для проведення планової імунізації спеціальної вакцини на основі конкретних вірусних антигенів і таурозидів, причому перша обставина обмежує сферу застосування методу плановою профілактикою інфекційного захворювання і виключає його використання для екстреної профілактики та лікування грипу, а це пов'язано з тим, що введення в організм сумішей, що включають антиген інфікуючого агента, безпосередньо перед або відразу після зараження грипом може ослабити імунну відповідь на цей мікроорганізм. Другим обмеженням можливості використання представленого в прототипі способу є те, що для використання таурозидів при проведенні планової імунізації проти грипу необхідне приготування окремої вакцини на основі конкретних вірусних антигенів і тритерпенових глікозидів таурозидів, а це пов'язано з тим, що, виходячи з матеріалів, представлених у прототипі, не ясно, який вплив на формування імунної відповіді може вчинити використання тих чи інших таурозидів як ад'ювантів при їх уведенні разом із вакциною іншого складу, що містить суміш цільового антигену з іншим ад'ювантом (фосфатом або гідроокисом алюмінію, поліоксидонієм). В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалення способу-прототипу шляхом використання таурозиду Sx1 для екстреної профілактики і лікування грипу, а також шляхом підвищення ефективності планової профілактики цього захворювання за допомогою введення таурозиду Sx1 одночасно з грипозною вакциною, що містить у своєму складі інший ад'ювант. Поставлена задача вирішується тим, що в способі стимулювання протигрипозного імунітету, що включає введення в організм тритерпенового глікозиду таурозиду Sx1, згідно з корисною моделлю, уводять таурозид Sx1 безпосередньо до чи після зараження як індивідуальну речовину або таурозид Sx1 уводять одночасно з грипозною вакциною, причому тритерпеновий глікозид уводять перорально або у вигляді ін'єкцій, а вакцину вводять в організм згідно з рекомендацією виробника. Між сукупністю існуючих ознак запропонованого способу і очікуваним технічним результатом, виявляється наступний причинно-наслідковий зв'язок: уведення таурозиду знижує інтенсивність реплікації вірусу грипу в зараженому організмі і підсилює розвиток клітинної й гуморальної імунної відповіді на антигени вірусу, що дає можливість підвищити виживаність заражених організмів в умовах гострої грипозної інфекції і досягти посилення імунної відповіді на антигени вірусу після вакцинації. Використання таурозиду Sx1 для екстреної профілактики й лікування грипу полягає у введенні цього сапоніну в організм без цільового антигену безпосередньо перед, під час або після зараження грипом. Таке застосування таурозиду Sx1 дозволяє розширити сферу застосування таурозидів і збільшити перелік протигрипозних засобів, що створює можливість підвищення ефективності екстреної профілактики й лікування грипу за рахунок застосування речовин (таурозидів), до яких у вірусів грипу відсутня стійкість. 1 UA 74219 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Використання таурозиду Sx1 для планової профілактики грипу полягає в роздільному введенні цього сапоніну і грипозної вакцини, що містить інший ад'ювант. Такий спосіб застосування таурозиду Sx1 дозволяє підсилити імунну відповідь на антигени, що входять до складу різноманітних грипозних вакцин різних виробників. Спосіб полягає в наступному. Для проведення екстреної профілактики і лікування грипу таурозид Sx1 вводять в організм перорально або за допомогою ін'єкцій. Сапонін уводять упродовж 3-х днів до зараження двічі на день - профілактичне введення, упродовж 3-х днів після зараження двічі на день - терапевтичне введення або впродовж 2-х днів до зараження і 3-х днів після зараження двічі на день лікувально-профілактичне введення. При пероральному введенні таурозид Sx1 розчиняють у дистильованій воді до концентрації 5 міліграм/мл і вводять двічі на день із розрахунку 3-30 міліграм/кг тіла/добу. При внутрішньом'язовому або внутрішньоочеревинному ін'єкційному введенні таурозид Sx1 розчиняють у забуференому ізотонічному розчині хлориду натрію, рН 7,1 (ЗІР). Розчин сапоніну вводять із розрахунку 0,1-3 мг/кг/добу. Для підвищення ефективності планової профілактики грипу розчин таурозиду Sx1 на дистильованій воді вводять перорально впродовж 3-х днів після ін'єкційного внутрішньом'язового введення вакцини, що проводиться відповідно до рекомендацій виробника. При цьому розчин таурозиду Sx1 із концентрацією сапоніну 5 міліграм/мл уводять двічі на день в об'ємі, що забезпечує отримання добової дози тритерпенового глікозиду 3-30 мг/кг/добу. Відомостями, що підтверджують можливість здійснення корисної моделі, є нижче перераховані приклади. Приклад 1. Мишам лінії BALB/c вагою 14-16 г перорально шляхом споювання через обточену голку шприца двічі на день по 20 мкл вводять водний розчин таурозиду Sx1 із концентрацією тритерпенового глікозиду 5 міліграм/мл із розрахунку введення 10 міліграм сапоніну/кг ваги тварини/добу. Використовують три різні схеми введення таурозиду Sx1: терапевтичну тваринам розчин сапоніну вводять після зараження грипом протягом 72 годин двічі на день, перше введення здійснюють через 1 годину після зараження; профілактичну - тваринам розчин сапоніну вводять двічі на день протягом 72 годин до зараження; лікувально-профілактичну тваринам розчин сапоніну вводять двічі на день протягом 48 годин до зараження, потім за годину після зараження, а також упродовж 48 годин після зараження. Мишам із контрольних груп (контроль вірусу) за тими же схемами замість сапоніну вводять дистильовану воду. В експериментальні і контрольні групи включають по 10-12 тварин. Зараження мишей проводять інтраназальним введенням 50 мкл алантоїсної рідини курячого ембріону, інфікованого вірусом грипу A/WSN/1/33(H1N1). Використовують вірулентний для мишей варіант вірусу грипу A/WSN/1/33(H1N1), адаптований до цих тварин шляхом багатократних пасажів через легені мишей. Віруси вводять тваринам інтраназально під легким ефірним наркозом у дозі 10 LD5o. Результати оцінюють за виживаністю тварин упродовж 14 днів після зараження. Протягом цього терміну при експериментальному грипі відмічається смертність тварин. Для зіставлення результатів, отриманих у різних дослідних і відповідних контрольних групах, визначають відсоток смертності (М - відношення кількості померлих за 14 днів тварин до загального числа заражених тварин у групі) і індекс захисту. Індекс захисту (IP) розраховують як відношення різниці відсотків смертності в контрольній і експериментальній групах до відсотка смертності в контрольній групі за формулою: IP  50 55 Mc  Me  100% Mc , де Мс - смертність (%) у контрольній групі, a Me - смертність (%) в дослідній групі. В таблиці 1 наведено результати вивчення протективної активності таурозиду Sx1 при експериментальній грипозній інфекції мишей, викликаній вірусом A/WSN/1/33(H1N1), у разі перорального введення сапоніну в дозі 10 мг/кг/добу. Таким чином, уведення таурозиду Sx1 підвищує здатність до виживання мишей, заражених вірусом грипу, при використанні будь-якої з вивчених схем застосування речовини. Сапонін має помірний протективний ефект при введенні до або безпосередньо після зараження. При введенні цього глікозиду за лікувально-профілактичною схемою протективний ефект таурозиду Sx1 зростає вдвічі. Представлені дані свідчать про здатність таурозиду Sx1 стимулювати механізми природженого протигрипозного імунітету і вказують на можливість використання вказаного тритерпенового глікозиду для проведення екстреної профілактики й лікування грипу. Приклад 2. 2 UA 74219 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Мишей лінії BALB/c вагою 25-28 г імунізують шляхом внутрішньом'язового введення в стегно 0,1 мл грипозної вакцини, розведеної 1:10 на ЗІР. Використовують тривалентну субодиничну вакцину "Грипол", що містить високоочищений гемаглютинін і нейрамінідазу вірусів грипу А і В у комплексі з ад'ювантом поліоксидонієм. Виробник вакцини ФДУП НВО "Мікроген" МОЗ РФ, Росія, Москва. До складу вакцини входять гемаглютиніни вірусів штамів AIVR-116(H1N1), подібний A/New Caledonia/20/99; NYMC X-157 (A/New York/55/2004) подібний A/California/7/2004(H3N2); B/Jiangsu/10/2003, подібний B/Shanghai/361/2002. Відразу після вакцинації тваринам перорально вводять водний розчин таурозиду Sx1 із концентрацією 5 міліграм/мл по 20 мкл на введення двічі на день протягом 3 днів. Добова доза сапоніну складає 7-8 мг/кг/день. У контрольній групі тваринам за тією ж схемою перорально вводять дистильовану воду. Через 4, 14, 21 день після вакцинації у тварин беруть кров для визначення титрів антигемаглютинінових антитіл (антигемаглютинінів). Для цього використовують реакцію гальмування гемаглютинації (РГГА) зі стандартними грипозними діагностикумами і формалінізованими курячими еритроцитами. Через 4 місяці після початку експерименту проводять забір крові для виявлення залишкових титрів антитіл. Потім проводять ревакцинацію. Через 5 днів після ревакцинації в тварин беруть кров із хвостової вени і за допомогою РГГА в сироватках виявляють титри антигемаглютинінів. Оцінку результатів проводять шляхом порівняння титрів антигемаглютинінів у сироватках тварин, що належать до різних груп. Статистичну достовірність відмінностей показників титрів антитіл проводять за допомогою визначення критерію Стьюдента (t), використовуючи програмно-математичний комплекс для персонального комп'ютера MS Excel 97 і пакет програм для статистичного аналізу даних Statistica. Розраховують середнє арифметичне, стандартну помилку (т) і вірогідність відмінностей між показниками в групах (р). У таблиці 2 наведені результати впливу перорального введення таурозиду Sx1 на продукцію антигемаглютинінів при первинній імунній відповіді на внутрішньом'язове введення вакцини "Грипол". У таблиці 3 наведені результати впливу перорального введення таурозиду Sx1 на продукцію антигемаглютинінів при вторинній імунній відповіді після реімунізації вакциною "Грипол". Як показано в таблиці 2, пероральне введення таурозиду Sx1 забезпечує до 21 дня після імунізації достовірно більш виражену продукцію антитіл, специфічних до всіх типів гемаглютинінів, що входять до складу вакцини. Як показано в таблиці 3, пероральне введення таурозиду Sx1 після внутрішньом'язового введення вакцини забезпечує більш інтенсивне формування імунологічної пам'яті у відношенні гемаглютинінів НІ і НЗ вірусів грипу типу А, що входять до складу вакцини. Це виявляється в достовірно вищому (ніж у контрольних групах) зростанні титрів антигемаглютинінів, яке реєструється на 5 день після ревакцинації без додаткового введення сапоніну. При цьому посилення імунологічної пам'яті у відношенні антигенів вірусу грипу типу В не відбувається. Таким чином, введення таурозиду Sx1 інтенсифікує процеси формування придбаного імунітету проти грипу. Це виявляється в підвищенні рівнів як первинної, так і вторинної гуморальної імунної відповіді, що індукується введенням субодиничної вакцини, що включає інший ад'ювант, і стосується, головним чином, стимуляції вироблення антитіл до гемаглютинінів вірусів грипу типу А. Даний спосіб дозволяє за рахунок посилення природженої і набутої імунної відповіді до грипу підвищити стійкість організму до грипу як при екстреній профілактиці і лікуванні цього захворювання, так і при проведенні вакцинації. Основними перевагами пропонованого способу є доступність сировини і засобів для отримання використовуваної речовини, а також високі вакцинопідсилюючі та протективні властивості, що дозволяють використовувати спосіб як для профілактики, так і для лікування грипу. 50 Таблиця 1 Схема введення Група тварин Дослід (таурозид Sx1 вводили) Контроль (таурозид Sx1 не вводили) Дослід Профілактична Контроль Лікувально-профілактична Дослід Контроль *- смертність мишей на 14 день після зараження Терапевтична 3 Смертність (%)* 70 100 67 100 30 92 Індекс захисту (%) 30,0 33,0 67,4 UA 74219 U Таблиця 2 Титри антитіл по днях після вакцинації (Мm+)± Антигенний Група тварин діагностикум 4 14 853,3±213,3 120,0±25,3 А/Нова Каледонія Контроль (без таурозиду) /20/99 (Hlnl) Дослід 906,7±173,6 1280±286,2** Контроль 960,0±320,0 160,0±0,0 А/Нью-Йорк /55/04 (Н3п2) Дослід 1600,0±320,0 426,6±173,6 Контроль 40,0±0,0 626,7±220,9 В/Хабаровськ/ 14/05 Дослід 100,0±20,0** 600,0±233,5 Достовірність відмінностей між контролем і дослідом * - р.0,01; ** - р.0,05. 21 960,0±202,4 3840±572,4* 106,7±26,7 800,0±160,0** 20,0±13,6 86,7±26,2** Таблиця 3 Титри антитіл після ревакцинації (Мm±)± Група тварин до ревакцинації Контроль 832,0±192,0 Дослід 800,0±160,0 Контроль 464,0±114,3 Дослід 440,0±120,0 В/Хабаровськ/14/05 Контроль 80,0±35,7 Дослід 100,0±38,3 Достовірність відмінностей між контролем і дослідом * - р.0,01; ** - р.0,05. Антигенний діагностикум А/Нова Каледонія /20/99 (Hlnl) А/Нью-Йорк /55/04 (Н3n2) 5 днів після 480,0±92,4 1536,0±256,0* 720,0±201,3 2048,0±313,5** 8,0±8,0 16,0±16,0 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб стимулювання протигрипозного імунітету, що включає введення в організм тритерпенового глікозиду таурозиду Sxl, який відрізняється тим, що уводять таурозид Sxl безпосередньо до чи після зараження як індивідуальну речовину або таурозид Sxl уводять одночасно з грипозною вакциною, причому тритерпеновий глікозид уводять перорально або у вигляді ін'єкцій, а вакцину вводять в організм згідно з рекомендацією виробника. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4