Спосіб визначення життєздатності зооспорангіїв збудника раку картоплі synchytrium endobioticum (schilb.) perc

Реферат: Спосіб визначення життєздатності зооспорангіїв збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. включає в себе просушування ґрунту, розтирання гумовим товкачиком, просіювання крізь сита 1,0 мм, 0,5 мм, 0,25 мм та 0,03 мм, центрифугування в 48,5 % розчині натрію йодистого з питомою вагою 1,4 при 3000 об/хв., виявлення життєздатних зооспорангії. Фарбування літніх та зимових зооспорангіїв збудника хвороби проводять 0,5 % розчином Кумасі голубим, що дозволяє визначити життєздатні зооспорангії збудника хвороби. UA 74877 U (12) UA 74877 U UA 74877 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, зокрема до виявлення структурних елементів мікроорганізмів з ґрунту. Відомі способи виявлення зооспорангіїв збудника раку картоплі з ґрунту, в яких запропоновано просіювати ґрунтову наважку через сита 0,5 мм та 0,25 мм, змішувати з хлороформом або з диброметаном, або сумішшю чотирихлористого вуглецю з ефіром. При цьому зооспорангії збудника спливають на поверхню, де їх збирають і підраховують під мікроскопом [1, 2]. Відомий також спосіб відділення патогену з допомогою суміші 3 % мінеральної олії та 3 % автомобільної олії з водою [14]. Зооспорангії, що спливають, розбавляються лактофенолом і теж підраховуються. Відомий спосіб осадження зооспорангіїв збудника 1 % розчином сірчанокислого натрію, після просіювання ґрунтової проби крізь сита 0,25 мм та 0,3 мм [13]. Також відомі способи виявлення патогену з допомогою 70 % розчину сахарози та визначення його життєздатності фарбуванням флюорисцентними барвниками нітросинім тетразолієм та акридиновим оранжевим [5, 10], а також бромистим етидієм [11, 12]. Відомий спосіб виявлення зооспорангіїв збудника хвороби, який теж заснований на просіюванні ґрунту і центрифугуванні в 48,5 % розчині натрію йодистого [8]. Він є найбільш близьким технічним рішенням до способу, що заявляється, який використовується як прототип. Спосіб, що вирішується у прототипі, полягає в тому, що він включає у себе просушування ґрунту, його розтирання гумовим товкачиком, просіювання крізь сита з порами 1; 0,5; 0,25 та 0,2 мм і центрифугування в розчині натрію йодистого з питомою вагою 1,4. Спорангії, що спливають, збирають на годинникове скельце, визначають їх життєздатність одночасним фарбуванням розчином натрію йодистого, виділяють життєздатні від нежиттєздатних, які зафарбовані жовтим кольором, під мікроскопом їх підраховують. Згадані способи та спосіб-прототип мають такі недоліки. 1. Відомі способи є надто трудомісткими і їх використання пов'язане з затратою часу. 2. Складові компоненти способів досить дефіцитні. 3. Основним недоліком всіх способів є те, що для їх проведення застосовуються сполуки, які є високотоксичними і є небезпечними для оточуючого персоналу. 4. Визначення життєздатності зооспорангіїв збудника раку картоплі за способом-прототипом - можна визначити життєздатність лише літних зооспорангіїв збудника хвороби, які фарбуються жовтим кольором, а зимові зооспорангії мають свій природний колір - золотисту оболонку. В основу корисної моделі поставлена задача розробити більш досконалий, екологічно безпечний, швидкий спосіб виділення зооспорангіїв збудника раку картоплі з ґрунтових зразків, визначити їх життєздатність, який може бути використаний карантинною службою при виявленні вогнищ збудника хвороби. Поставлена задача досягається тим, що у запропонованому способі шляхом здійснення ряду прийомів у певній послідовності досягається результат, а саме: вдається виділяти зооспорангії збудника раку картоплі з ґрунту шляхом розтирання ґрунту, його просіювання крізь сита з порами 1,0 мм, 0,5 мм, 0,25 мм, 0,03 мм, промивання ефіром над останнім ситом (0,03 мм) для розчинення органічних сполук з ґрунту і центрифугування в 48,5 %-ному розчині розчину нагрію йодистого з питомою вагою 1,4; визначення життєздатності патогену шляхом фарбування його зооспорангіїв з зооспорами за допомогою 0,5 % розчину Кумасі голубого, який фарбує літні та зимові життєздатні зооспорангії збудника раку картоплі в голубий колір. Результат, що досягається внаслідок цього, перевищує результат, що досягається при здійсненні інших способів та способу-прототипу: 1. Спосіб реалізується при використанні дешевого препарату. 2. Запропонований спосіб займає набагато менше часу. 3. Застосовуються сполуки, які не шкідливі для здоров'я людини. 4. Можна одночасно визначити життєздатність як літних, так і зимових зооспорангіїв збудника раку картоплі. Отже, спосіб, що заявляється, відповідає критерію винаходу "новизна" та "суттєві відміни". Приклади здійснення способів Приклад 1 (прототип) Ґрунтовий зразок (1 г) просушують, розтирають гумовим товкачиком, просіюють крізь сита з порами 1,0 мм, 0,5 мм, 0,25 мм та 0,02 мм, центрифугують протягом 1 хвилин при 800 об./хв у 48,5 % розчині натрію йодистого (питома вага - 1,4). При цьому зооспорангії збудника раку спливають на поверхню (в центрифугат), а ґрунтові суміші випадають в осад. Зооспорангії збирають на годинникове скельце. Виявлення життєздатних зооспорангіїв проводять за допомогою цього ж розчину, який фарбує життєздатні зооспорангії в жовтий колір [6], їх 1 UA 74877 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 підраховують під мікроскопом. При цьому у с. Майдан виявлено 52 зооспорангія збудника раку; у с. Сурупи - 58; у с. Ясіня - 66; у с. Бистрець - 56, у с. Берегомет - 66; у с. Красноїльськ - 28 зооспорангіїв збудника хвороби (таблиця 1, фіг. 1 – Життєздатні зимові зооспорангій збудника раку картоплі (8 × 15)). Приклад 2 Ґрунтовий зразок (1 г) просушують, розтирають гумовим пестиком, просіюють крізь сита з порами 1,0 мм, 0,5 мм, 0,25 мм та 0,03 мм. Над останнім ситом (0,03 мм) зразок промивають ефіром для розчинення органічних речовин ґрунту і центрифугують протягом 1 хвилини при 3000 об./хв у 48,5 % розчині натрію йодистого. При цьому зооспорангії збудника раку спливають на поверхню (в центрифугат), а ґрунтові суміші випадають в осад. Зооспорангії збирають на годинникове скельце. Виявлення життєздатних зооспорангіїв проводять за допомогою їх фарбування за допомогою 0,5 % розчину Кумасі голубого. При цьому живі літні та зимові спорангії голубі, зернисті, а нежиттєздатні - порожні, деформовані - не фарбовані, їх підраховують під мікроскопом. Ідентифікують зооспорангії збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. від інших видів. У с. Майдан виділено 56 життєздатних зооспорангіїв,у с. Сурупи - 66; у с. Ясіня - 73; у с. Бистрець - 58; у с. Берегомет - 76 та в с. Красноїльськ - 32 зооспорангіїв збудника хвороби. При цьому ефективність виявлення життєздатних зооспорангіїв збільшилась від 9 до 14 % (таблиця). Таким чином, одночасно визначається кількість літних та зимових зооспорангіїв патогену, а також їх життєздатність в ґрунтових зразках (таблиця, фіг. 1, фіг. 2 - Життєздатні зимові зооспорангії збудника раку картоплі, фарбовані 0,5 % розчином Кумасі голубим (8 × 15)). Отримані результати здійснення запропонованого способу виділення зооспорангіїв збудника раку картоплі з ґрунту не поступається прототипу. Спосіб, що заявляється, має переваги перед прототипом, оскільки його ефективність вища. Позитивний ефект запропонованого способу виділення патогену підтверджує експериментальна перевірка, яка здійснювалась при виявленні зооспорангіїв хвороби з різних регіонів України. Літературні джерела: 1. Владимирская Н.Н. Пленочный метод определения зараженности супесчаных почв возбудителем рака картофеля Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. Методические указания. Л., 1952. - 23 с. 2. Голик И.В. Состав для выделения зоосппорангиев Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc из раковых наростов картофеля. Авторское свидетельство СССР. № 254944, 1970, МПК А 01п Кл. 45л, 7/04,09,03, 1970 г. 3. Сурнакова Н.Е. Способ определения жизнеспособности возбудителя рака картофеля. Авторское свидетельство СССР. № 1014880.03.01.1983 г. 4. Яковлева В.А., Карнаухов В.Н. Способ определения жизнеспособности зооспорангиев возбудителя рака картофеля. Заявка № 3900318/31-13/6061. 28.05.1986 г. 5. Шариков К.Е. Выявление картофельного рака микроанализом. Методические рекомендации. - Минск, 1954. - 24 с. 6. Патент України на винахід № 17049 від 15.09.2006 р. МПК Спосіб виявлення зооспорангіїв збудника раку картоплі з ґрунту. / Зеля А.Г., Мельник П.О. // Офіційний бюллетень. Промислова власність. - 2006. - Бюл. № 9. - с. 76. 7. Дорожкин Н.А. Определение жизнеспособности зимних зооспорангиев возбудителя рака картофеля Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc.) / Н.А. Дорожкин // Методические рекомендации. - 1978. - М. 23 с. 8. Ефременко Т.С. Методы выявления из почвы возбудителя рака картофеля / Т.С. Ефременко, В.А. Яковлева // Методы диагностики карантинных болезней. М., 1985. - с. 30-40. 9. Cakir Е. First report of potato wart disease in Turkey / E. Cakir // Plant Pathology. 2005. - Vol. 54. - № 4. - P. 584. 10. Cakir E. Potato wart disease survey in Turkey / E. Cakir // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 2005. - Vol. 35. - № 3. - P. 489-490. 13. Pratt M. The longevity of resting sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. In Soil. GPPO Bull. 1976, 6, 2: p. 107-108. 14. Marcus O. Untersuchungen zur Auszahlung von Daursporangien des Kartoffel krebserregers Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc in Bodenproben. Deutsch. Pflanzentzd, 1969, 21, 10. 2 UA 74877 U Таблиця Ефективність виявлення життєздатних зоослорангіїв збудника раку картоплі з ґрунтових зразків, що відібрані в різних регіонах України (відносно способу-прототипу). Виявлено життєздатних зооспорангіїв NaІ 48,5 % 0,5 % Кумассі голубий (спосіб, (прототип) що заявляється) Кількість Кількість Ефективність, % Патотипи, ізоляти 11 - Міжгірський агресивний (с. Майдан, Міжгірського району, Закарпатської обл.) 13 - Рахівський агресивний (м. Рахів, Закарпатської обл.) 18 - Ясинський агресивний (с. Ясіня, Рахівського району, Закарпатської обл.) 22 - Бистрецький агресивний (с. Бистрець, Верховинського району, Івано-Франківської обл.) Д1 - звичайний (с. Берегомет, Вижницького району Чернівецької обл.) Д1 - звичайний (с. Красноїльськ, Сторожинецького району, Чернівецької обл.) 52,6±1,1 56,6±1,9 9,3 58,6±2,6 66,3±2,8 13,1 66,6±1,6 73,6±2,9 11,9 56,6±1,9 58,0±2,6 8,3 66,3±1,8 76,6±2,9 11,0 18,3±1,6 22,3±1,9 14,1 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб визначення життєздатності зооспорангіїв збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc., що включає в себе просушування ґрунту, розтирання гумовим товкачиком, просіювання крізь сита 1,0 мм, 0,5 мм, 0,25 мм та 0,03 мм, центрифугування в 48,5 % розчині натрію йодистого з питомою вагою 1,4 при 3000 об/хв., виявлення життєздатних зооспорангіїв, який відрізняється тим, що фарбування літніх та зимових зооспорангіїв збудника хвороби проводять 0,5 % розчином Кумасі голубим, що дозволяє визначити життєздатні зооспорангії збудника хвороби. 3 UA 74877 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4