Спосіб визначення впливу токсичності стічних вод на водні солоні середовища

1. Спосіб визначення впливу токсичності стічних вод на водні солоні середовища шляхом визначення показників росту культури морської одноклітинної водорості Platymonas viridis Rouch або Dunaliella salina Teod., який включає культивуван 3 76248 4 водорості Phaeodactylum tricornutum, процедуру походження для гіперсолоних водойм. Зазначені біотестування й обробку результатів. Процедура види мікроводоростей були обрані в зв'язку з набіотестування складається з відбору проб води, ступним: внесення в контроль і в тестоване середовище - простота культивування й утримування в лаінокуляту культивованої водорості, підрахунку чибораторних умовах; сельності клітин водорості Phaeodactylum - можливість швидкого одержання біомаси куtricornutum на 24, 48 і 72 годину експозиції. Автольтур за короткий термін; рами запропоновано шкалу токсичності тестовано- висока чутливість до дії токсикантів; го середовища по показниках росту водорості. - широке застосування як тест-об'єктів в екотоОсновним підсумком таких робіт є визначення міксикології: німальної кратності розведення (Кр min) - відно- відносна стійкість P. viridis і D. salina до дії шення тестованої води до контрольної. Крім цього, деяких токсикантів, зокрема стічних вод різного автори посилаються на роботи з визначення мініпоходження; мально припустимої і медіанальної ефективної - доступність: водорість P. viridis широко по(летальної) концентрацій. ширена в морських акваторіях, a D. salina - типоВідомий спосіб визначення впливу токсичності вий представник водойм з високим рівнем солоностічних вод на лабораторну культуру водоростей сті. Phaeodactylum tricornutum має низку недоліків: Спосіб реалізується таким чином. Для біотес- є короткочасним експрес-тестом і не дозвотування використовують альгологічно чисті кульляє оцінити різні фази росту культури, а саме: петури з музею культур мікроводоростей Інституту ріоди індиферентності, початкового порушення біології південних морів НАН України, м. Севастофункцій клітин, період нормалізації чи навіть стиполь: Phtymonas viridis (Rouch, 1970) - зелена вомуляції росту. Саме при хронічному (довгочаснодорість род. Chlamydomonadae (Chloropkyta, му) експерименті дослідник може одержати повну Volvociphyceae) - і зелена одноклітинна джгутикова інформацію про токсичність тестованого середогалофільна водорість Dunaliella salina (Teod., 1905) вища; із род. Chlamydomonadae, - не дає повної і достовірної інформації при (Chlorophyta.Volvociphyceae). Для періодичного оцінці небезпеки скидань стічних вод різного похобіотестування морської і гіперсолоної води, які дження для гіперсолоних водойм. містять стічні води, мікроводорості культивують у В основу винаходу «Спосіб визначення рівня лабораторних умовах з використанням живильнотоксичності стічних вод» поставлена задача шляго середовища Гольдберга (для водоростей хом проведення дослідження впливу токсичності Platymonas viridis і DvnaHalla salina). середовища стічних вод на одноклітинні мікроводорості Erd-Schreiber (Butcher, 1952) - для культивування Platymonas viridis Rouch і Dunaliella salina Teod. у Platymonas viridis і середовища Артарі №1, №2 довгочасному експерименті забезпечити дослідни(1916) і Милько (1962) - для культивування ків більш повною і достовірною інформацією про Dunalialla salina. рівень токсичності різних концентрацій стічних вод. Умови культивування Поставлена мета досягається тим, що в СпоКультури водоростей вирощують у конічних собі визначення рівня токсичності стічних вод колбах місткістю 500мл при температурі 18-25°С і шляхом визначення показників росту культури природному освітленні. Як живильне середовище морської одноклітинної водорості в тестованій вовикористовують середовище Гольдберга. Морську ді, який включає культивування культури морської воду відбирають в умовно чистій зоні моря, фільтодноклітинної водорості, процедуру біотестування, рують її через подвійний паперовий фільтр №6. що складається з відбору проб води, внесення в Стерилізують морську воду шляхом трьохразового контроль і в тестоване середовище інокуляту кунагрівання на водяній бані до температури 80°С. льтивованої водорості, підрахунку чисельності Процедура біотестування: клітин водорості, як тест-об'єкти використовують 1. Проведення експерименту: культури одноклітинних морських мікроводоростей - Послідовно вносять у морське середовище Phtymonas viridis Rouch. і Dunaliella salina Teod. і інгредієнти середовища Гольдберга, різні конценпроводять довгочасний експеримент. Мікроводотрації стічних вод, а також рівну кількість культури рість Phtymonas viridis Rouch. використовують для мікроводоростей. оцінки впливу токсичності стоків на морське сере- Відбирають клітинний інокулят на початку довище. Мікроводорість Dunaliella salina Teod. видосліду, потім на 1-у, 3-ю, 6-у, 9-у, 12-у і 15-у добу користовують для оцінки небезпеки від скидань 15-добового експерименту і підраховують кількість стічних вод різного походження для гіперсолоних клітин для кожного варіанта. Кількість клітин підводойм. раховують у всьому об'ємі камери Горяєва, для Відмінність пропонованого способу від відомочого рух мікроводоростей фіксують розчином Люго полягає в тім, що автор пропонує проводити голя з гліцерином. дослідження впливу токсичності стічних вод на Експерименти проводять в трьох повторносодноклітинних мікроводоростях у довгочасному тях. В кожній колбі кількість клітин визначали та(15-добовому) експерименті. Крім цього, відмінніскож у трьох повторностях. тю пропонованого способу від відомого, є викорис2. Статистична обробка результатів експеритання як тест-об'єктів культури Plarymonas viridis менту. Результати дослідів опрацьовують статисRouch - для оцінки впливу токсичності стоків на тично, використовуючи t - критерій Ст'юдента при морське середовище і Dunaliella salina Teod. - для порівнянні параметра чисельності при рівні значуоцінки рівня небезпеки скидань стічних вод різного щості р 0,05 (Лакин, 1973). 5 76248 6 3. Визначення наявності чи відсутності токсичдою з високою концентрацією солоності, тобто ного ефекту різних концентрацій стічної води на встановлюють таку кількість природної води, при культуру водоростей. якій не буде спостерігатися токсичний ефект нечиПоказники біотестуровання стот. Для виявлення токсичності різних концентраОсновним показником, за допомогою якого цій стічних вод автор також пропонує керуватися оцінюють рівень токсичності доданих у середови«Шкалою токсичності тестованого середовища по ще стічних вод, є чисельність клітин водоростей. показниках росту водоростей Phaeodactylum За результатами експериментів складають таблиtricornutum Bohl.» (Дятлов, Петросян, 2001), за цю чисельності клітин у всіх варіантах експеримедопомогою якої по відсотку чисельності клітин у нту в абсолютних одиницях, а також значень чирозчинах визначає рівень токсичності і характерисельності клітин водоростей, виражених у стику середовища, а також кратність розведення. відносних одиницях (% відносно контролю). ДодаРяд дослідників визначає також максимально притковими показниками дослідження впливу токсичпустиму (недіючу) концентрацію і летальну конценості середовища на мікроводоростях, можуть нтрацію (LC50, LC100), які, в основному, використослугувати відсоток інгібування чисельності клітин, вують під час перевірки культур відносно дії коефіцієнт відносного приросту культур, середня стандартного токсиканта. швидкість росту, відсоток зниження середньої Приклади реалізації способу. швидкості росту, приріст і відсоток зниження приПриклад 1. Оцінювали рівень токсичності місьросту культури. ких господарсько-побутових стічних вод (ГБСВ) на На підставі отриманих результатів експеримеморську мікроводорість Platymonas viridis Rouch. нтів роблять висновок про мінімальну кратність Результати експерименту наведені в Табл.1, а розведення стічних вод морською водою або вотакож на Фіг.1-Фіг.6. Таблиця 1 Зміна чисельності клітин Platymonas viridis Rouch. під впливом різних концентрацій господарсько-побутових стічних вод Термін. Доба 0 1 3 6 9 12 15 0 (контроль) 7,78 135 , 100 17,35 9,01 100 15,68 100 0,84 9,32 3,43 2187 , 22,10 4,47 100 20,23 5160 14,27 , 100 27,65 14160 3193 , , 100 22,55 150,49 46,11 100 30,64 Концентрація стічних вод, мл/л 1 10 7,28 0,69 6,67 0,90 93,57 8,87 85,73 1157 , 11 48 176 , , 127,41 19,53 9,26 0,87 * 59,06 5,55 7,65 0,70 84,90 7,77 7,65 0,95 * 48,79 6,06 18,89 85,47 22,22 43,06 48,64 34,35 85,92 57,09 19,01 86,02 20,74 40,19 7197 , 50,83 90,86 60,38 4,13 18,69 3,98 7,71 7,95 * 5,61 25,99 17,27 182 , 8,23 2,04 * 3,95 12,12 8,56 14,74 9,79 100 8,15 0,72 104,76 9,25 5,43 0,47 * 60,27 5,22 6,30 0,61* 40,18 3,89 18,76 3,14 84,89 14,21 24,20 9,45 46,90 18,31 58,15 1175 * , 4107 8,30 , 9173 27,11 , 60,95 18,01 Примітка. У чисельнику - кількість клітин (X на 103) в мл. у знаменнику - те саме відносно чисельності в контролі, прийнятому за 100%. Зірочкою позначені значення чисельності клітин, які вірогідно відрізняються від аналогічних значень у контрольних культурах (р 0,05). На підставі отриманих результатів можна дійти висновоку про те, що в довгочасному експерименті ГБСВ у концентраціях 1, 10 і 100мл/л не викликали токсичності в морської флагеляти Platymonas viridis Rouch. Достовірне зниження понад 50% порівняно з контролем чисельності клітин на 9-12 добу під впливом стічних вод можна пояснити зниженням середньої швидкості росту культури (див. Фіг.3). причому, відсоток зниження середньої швидкості росту чисельності мікроводоростей вищий під дією стічних вод в концентрації 1 і 100мл/л (див. Фіг.4). В абсолютних значеннях кількість клітин P. viridis зростала у всіх варіантах протягом всього експерименту. Однак, на табл.1, Фіг.1 і Фіг.2 показано, що цей показник був вищий в контролі, ніж у дослідах. Слід зазначити, що відсоток інгібування чисельності був вищий при найменшій концентрації, а коефіцієнт відносного приросту, відповідно, був нижчий в цьому випадку, а також при впливі 100мл/л стічних вод. Добовий приріст культури P. viridis був вищий у випадку впливу ГБСВ у концентрації 1мл/л (див. Фіг.5). Зниження приросту посилювалося зі збільшенням концентрації стічних вод (див. Фіг.6), що, безумовно, узгоджується з даними Табл.1 і свідчить про те. що найбільше зростання кількості клітин відбу 7 76248 8 вається при збільшенні вмісту біогенів, наявних у ник був нижчий ніж контрольний, що, імовірно, стоках. свідчить про надлишкову кількість живильних і З прикладу 1 випливає, що під час експонціатоксичних компонентів стоків. льного періоду росту культури Р. viridis стічні води Приклад 2. Оцінювали рівень токсичності місьміського колектора в концентраціях 1, 10 і 100мл/л ких господарсько-побутових стічних вод (ГБСВ) на не викликали необоротних порушень у рості чисегалофільну мікроводорість Dunaliella salina Teod. льності клітин дослідженої культури, хоча, майже Результати експерименту наведені в Табл.2, а протягом всього експерименту досліджений показтакож на Фіг.7-Фіг.12. Таблиця 2 Зміна чисельності клітин Dunaliella salina Teod. під впливом різних концентрацій господарсько-побутових стічних вод Термін, доба 0 0(контроль) 53086 6268 100 1181 , 1 7,27 0,78 100 10,7 3 3,67 0,33 100 8,99 6 9 12 15 15,68 100 22,65 100 68,58 100 226,3 100 2,74 17,5 1,86 8,2 7,76 113 , 13,37 5,9 Концентрація ГБСВ, мл/л 0,1 10 43827 3170 33457 3788 82,56 5,97 63,02 7,13 * 4,55 0,52 * 62,6 7,1 9,37 1,24 * 255,3 33,8 4,63 63,7 14,34 390 0,49 * 6,7 154 * , 419 , 25,41 3,44 * 162,0 219 , 55,0 5,68 * 242,8 25,1 115,7 16,2 * 168,8 23,6 1717 14,01* , 75,9 6,2 17,75 113,2 43,09 190,2 86,86 126,6 117,3 517 , 2,24 14,3 5,31* 23,4 14,58 212 , 16,72 * 7,4 100 29136 1253 54,88 2,36 3,53 0,51* 48,5 7,0 8,65 112 * , 235,7 30,5 22,71 2,66 144,8 17,0 47,28 7,84 * 208,7 34,6 65,12 9,4 94,9 13,7 165,1 23,0 * 72,9 10,1 Примітка. У чисельнику - кількість клітин (X на 103) в мл. у знаменнику - те саме відносно чисельності в контролі, прийнятому за 100%. Зірочкою позначені значення чисельності клітин, які вірогідно відрізняються від аналогічних значень у контрольних культурах (р 0,05). Виходячи з отриманих даних експерименту щодо вивчення впливу стічних вод на мікроводорість Dunaliella salina Teod. (см. Табл.2), можна зробити висновок про нешкідливість тестованих стічних вод у концентрації 1, 10 і 100мл/л. Відсоток інгібування чисельності клітин D. salina зростав зі збільшенням концентрації ГБСВ (Фіг.7). Починаючи з 6-ої доби, коефіцієнт відносного приросту культури був найбільшим при дії концентрації 1 і 10мл/л стічних вод, у той час як у контролі, особливо, під впливом стічних вод у концентрації 100мл/л цей показник був нижчий. Такі самі результати показав розрахунок середньої швидкості росту культури: при 1 і 10мл/л швидкість росту була максимальною, а при найбільшій концентрації - мінімальною (Фіг.9). У порівнянні з контролем відсоток зниження середньої швидкості росту числа клітин D. salina був найменшим під впливом 10мл/л стічних вод (Фіг.10). Добовий приріст культури дослідженої мікроводорості був тим вищий, чим нижча концентрація тестованих ГБСВ (Фіг.11) і, відповідно, відсоток зниження приросту культури був тим нижчий, чим вища доза токсиканта (Фіг.12). Таким чином, ГБСВ у концентраціях 1 і 10мл/л викликали, в середньому, більшу стимуляцію росту числа клітин D. salina, ниж при 100мл/л. Стиму ляція спостерігалася також протягом всього експерименту, а максимальне, порівняно з контролем, зростання числа клітин припадало на 3-12 добу. У той самий час, вивчення дії стічних вод у концентрації 100мл/л показало, що аналогічний період у культури відбувався з 3-ї по 9-у добу. В усіх варіантах збільшення числа клітин в абсолютних одиницях відбувалося поступово в ході всього експерименту (табл.2). З наведених прикладів випливає, що розведення стічних вод міського колектора морською водою в співвідношеннях 1:1000 (1мл/л), 1:100 (10мл/л) і 1:10 (100мл/л) не викликає необоротних змін у рості числа клітин морської мікроводорості Platymonas viridis Rouch. і галофільної мікроводорості Dunaliella salina Teod. Переваги заявленого способу, у порівнянні з відомим, полягають у наступному: - уперше робить оцінку небезпеки скидань стічних вод різного походження для гіперсолоних водойм; - забезпечує повною і достовірною оцінкою про рівень токсичності досліджуваного середовища, оскільки дозволяє оцінити різні фази росту культури: періоди індеферентності, початкового порушення функцій клітин, період нормалізації, або, навіть, стимуляції росту, який викликаний 9 76248 10 утворенням у середовищі сприятливих умов або - завдяки проведенню довгочасного експериадаптаційнимивластивостями мікро водоростей менту, з'являється можливість установлення часу на відгук на дію токсиканта, найбільш негативної прояви впливу нечистот. 11 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 76248 Підписне 12 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601