Спосіб виявлення днк вірусу хвороби ауєскі

Спосіб виявлення ДНК вірусу хвороби Ауєскі, що включає ампліфікацію ДНК вірусу ХА як ПЛРмішені, який відрізняється тим, що використовують праймери AuDV_gE_F (5' TCG GCC СТС GCC ТСС CTG А') і AuDV_gE_R (5' TGC CCA TCT CCG GGG ССТ С 3') до гена gE та Taqполімеразу, за температури відпалу 58 °С і синтезу фрагмента довжиною 235 п.н. (19) (21) u200710068 (22) 10.09.2007 (24) 10.01.2008 (72) ГЕРІЛОВИЧ АНТОН ПАВЛОВИЧ, UA, КОРОВІН ІГОР ВІКТОРОВИЧ, UA, СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, U A (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ", U A 3 29317 праймерів Taq-полімерази Після додавання Taq-полімерази, що проводиться в останню чергу, одержану суміш ретельно перемішують на вортексі. Після чого, суміш у дозі 40мкл вносять в усі пробірки підготовлені для ампліфікації. Потім додають в усі пробірки по 1 краплі (близько 25мкл) мінерального масла. Для проведення ампліфікації у відповідну пробірку з реакційною сумішшю під шар масла вносять 5мкл розчину сумарної ДНК проби. Для негативного контрольного зразку в пробірку вносять - 5мкл деіонізованої води, а в пробірку для позитивного контрольного зразку - 5мкл розчину ДНК з інактивованої формаліном культуральної розплодки вірусу ХА. Пробірки закривають й центрифугують протягом 3-5 секунд при 2000об/хв на мікроцентрифузі. Переносять пробірки в нагрітий до температури 95°С програмний термостат (ампліфікатор) і проводять ампліфікацію за наступною програмою (табл.): Після закінчення реакції проводять аналіз продуктів ПЛР, шляхом поділу фрагментів ДНК в агарозному гелі. Потім проводять електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР. Приготування робочого розчину буфера (ТБЕ) для електрофорезу. В мірну колбу ємністю 1000,0см 3 вносять вміст пакета з буфером для електрофорезу, доводять до мітки дистильованою водою та ретельно перемішують до повного розчинення осаду. Приготування агарозного гелю. У конічну колбу ємністю 250см 3 вносять вміст одного пакета з агарозою, додають 100,0см 3 робочого розчину буфера ТБЕ і ста влять колбу на водяну баню. Вміст колби доводять до кипіння, повністю розтоплюють, помішуючи скляною палочкою та охолоджують до температури 50-60°С. Отриманий розчин агарози повинен бути прозорим і не вміщувати окремих нерозчинених часток. Після чого у колбу з розчином агарози вносять 50,0мкл розчину броміду етидія. Підготовка електрофоретичної камери до заливання агарозного гелю. Встановлюють гребінку на платформу, розміщуючи її на відстані 3см одна від одної та заливають у неї охолоджену до температури 50°С агарозу . Після застигання агарози (приблизно через 25-30хв.) обережно витягають гребінку; платформу з агарозним гелем переносять до електрофоретичної камери. В електрофоретичну камеру заливають необхідну кількість розчину буфера ТБЕ так, щоб він покривав агарозний гель шаром завтовшки 45мм. Для нанесення проби відбирають у кількості 10мкл продукту ампліфікації та вносять у відповідну лунку агарозного гелю, під шар буфера ТБЕ так, щоб вміст одного кармана агарозного гелю не перетікав у інший. Електрофорез проводять у градієнті напруги 8В/см. Потім виймають платформу з агарозним гелем з електрофоретичної камери, дають рідині стекти з гелю та промивають агарозний гель дистильованою водою у кількості 200см 3 2-3 рази. Агарозний гель вміщують на скло УФтрансілюминатору. Фрагменти аналізованої ДНК 4 виявляються у вигляді смужок жовтогарячого по 1мкл кольору при проходженні УФ-випромінювання з 0,5мкл. довжиною хвилі 310нм. Облік результатів. У негативному контрольному зразку (К-) смужки відсутні. Поява смужки на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору. У позитивних контрольних зразках (К+) одна смужка жовтогарячого кольору розміром 235 нуклеотидний залишок (н.э.). Відсутність смужки жовтогарячого кольору на рівні позитивного контролю (К+) (235н.з.) свідчить про відсутність вірусу ХА. Наявність смужки, що відповідає за електрофоретичною рухливістю позитивному контролю (235п.н.), свідчить про присутність вірусу ХА. Результат аналізу не можна вважати достовірним, якщо на доріжці будь-якого негативного контролю виявляється специфічна смужка. Необхідно поставити не менше трьох негативних контролів на етапі виділення ДНК і стільки ж на етапі постановки ПЛР для виявлення джерела контамінації. Ефективність способу розкривається в прикладах. Приклад 1. Для оцінки чутливості та відтворюваності способу щодо індикації ДНК вірусу ХА досліджували проби крові від свиней, що позитивно (15 голів) та негативно (15 голів) реагували на «Аулергін ІЕКВМ для прижиттєвого виявлення свиней-вірусоносіїв при хворобі Ауєскі» ТУ У 46.15.271-97 запропонованим методом та в реакції нейтралізації. Результати досліджень наведені в таблиці 2. Дослідження були проведені триразово, при повтореннях результати відтворені. Приклад 2. Для визначення специфічності способу було використано 10 проб клінічного матеріалу від інфікованих тварин і 5 - від інтактних. Інфіковані тварини були виявлені за допомогою діагностичного препарату. Для контролю специфічності способу використовували зразки ДНК герпесвірусів індичок, хвороби Марека та інфекційного ринотрахеїту ВРХ. Після ампліфікації встановлено наявність специфічних смуг різної інтенсивності у всіх 10 пробах клінічного матеріалу, а також в треку позитивного контрольного зразку ДНК вірусу ХА. З пробами ДНК клінічного матеріалу від здорових свиней після ампліфікації не утворювалось смуг ампліконів. Проби сумарної ДНК гетерогенних контролів також не утворювали специфічних смуг після реакції за способом, що пропонується. Розроблений спосіб виявлення ДНК вірусу хвороби Ауєскі за допомогою ПЛР, може успішно використовува тись в умовах біотехнологічного виробництва вакцин. Спосіб виявлення ДНК вірусу хвороби 5 № циклу 1 2 3 29317 Температура 95°С 95°С 58°С 72°С 72°С 6 Час 2хв 0,5хв 0,5хв 0,5хв 2хв Кількість циклів 1 40 1 Таблиця 2. Спосіб виявлення ДНК вірусу хвороби Ауєскі Метод дослідження Алергічна проба Реакція нейтралізації ПЛР Позитивно реагуючі тварини (гол.) Негативно реагуючі тварини (гол.) 15 15 12 18 16 14