Спосіб одержання альбуміну

1. Спосіб одержання альбуміну, що характеризується поєднанням наступних операцій, при яких: (a) для інактивації вірусу перший водний розчин альбуміну піддають обробці методом SD шляхом забезпечення його контакту з реагентами SD при температурі нижче 45 °С; (b) видаляють принаймні суттєву кількість реагентів SD шляхом масляної екстракції з подальшою хроматографією гідрофобної взаємодії, причому гідрофобна матриця, переважно матриця, з якою необов’язково можуть бути зв'язані гідрофобні групи, використовується для зазначеної хроматографії, за умови, що зазначеними групами є аліфатичні групи більш ніж з 24 атомами вуглецю, для одержання другого розчину альбуміну, до якого (c) необов’язково додають один або декілька стабілізаторів, вибраних з групи цукрів, амінокислот, цукрових етилових спиртів, за умови, що як зазначений стабілізатор не використовують індольні стабілізатори та жирні кислоти С6-С10, після чого (d) другий розчин альбуміну, до якого вже необов’язково був доданий стабілізатор, піддають остаточному пакуванню та стерильній фільтрації і необов’язково завантажують у кінцеві контейнери. 2. Спосіб за п. 1, який характеризується тим, що інактивацію вірусу здійснюють при температурі в діапазоні від 25 до 40 °С. 3. Спосіб за п. 1 або 2, який характеризується тим, що інактивацію вірусу здійснюють протягом періоду часу в діапазоні від 4 до 6 годин. 2 (19) 1 3 80469 4 до 150 ммоль/л, при цьому рН складає від 5,0 до нообмінник, а як буфер для розчину альбуміну 6,0. використовують ацетат натрію у кількості від 20 до 16. Спосіб за п. 15, який характеризується тим, що 30 ммоль/л, при цьому значення рН складає від рН < 5,5. 4,8 до 6,0. 17. Спосіб за п. 11 або п. 14, який характеризуєть18. Спосіб за п. 17, який характеризується тим, що ся тим, що як іонообмінник використовують катіозначення рН знаходиться в діапазоні від 4,8 до 5,2. Даний винахід стосується способу одержання терапевтично придатного альбуміну, який пройшов вір усну інактивацію. Альбумін є білком плазми з найбільшою масовою часткою. Молекула альбуміну може зв'язуватися з багатьма ендогенними і екзогенними речовинами. Така зв'язувальна здатність альбуміну є основою однієї із його основних функцій: транспорту речовин, зв'язаних з альбуміном. Завдяки такій зв'язувальній здатності альбумін є важливим депо для великої різноманітності складів, наприклад, жирних кислот з довгим ланцюгом, білірубіну, триптофан у, тироксину або іонів металів. Фармацевтично активні речовини, що уводяться, типу варфарину, дигітоксину або напроксену, також зв'язуються з альбуміном і транспортуються. Однак у зв'язку з цим дуже важливо знати, що тільки вільна фракція відповідної фармацевтично активної речовини, а саме фракція, яка не зв'язана з альбуміном, є фракцією, яка виявляє фармакологічну дію. Зменшення ділянки, зв'язаної з альбуміном, збільшує вільну фракцію і таким чином сприяє підвищенню вказаної фармакологічної активності. Всі відомі на комерційному ринку препарати альбуміну одержують методом модифікованого фракціонування за Коном (Cohn), який звичайно включає декілька стадій фракціонування. Десятиріччями використовувалась пастеризація (протягом 10 годин при 60°С) концентрату альбуміну як вірус-інактивуюча стадія. З метою виключення денатурації альбуміну під час вказаної вище стадії були використані стабілізатори. Згідно з Європейською Фармакопеєю, як стабілізатори були використані каприлат натрію (октаноат натрію) або Nацетилтриптофан, або комбінація обох речовин. З метою одержання препаратів фактора VIII або інших білків плазми, які пройшли вірусну інактивацію, використовують так званий SD-метод, описаний, наприклад, у [патентному документі ЕРА- 0 131740]. Цей опублікований опис включений у даний документ як посилання. На підставі власних досліджень заявника відомо, що зв'язувальна здатність комерційного придатного альбуміну значно понижена порівняно з натуральним альбуміном. Це пояснюється тим, що стабілізатори, які використовуються при пастеризації, зв'язуються з альбуміном і тому займають важливі транспортувальні сайта. Останнє призводить до зниження зв'язувальної здатності. Це означає, що пацієнти, які одержують подібні препарати альбуміну, піддаються дії значно підвищених концентрацій вільної активної речовини, тобто такої речовини, яка не зв'язана з альбуміном, у момент приймання фармакологічно активних речовин, що, природно, означає появу підвищеного ризику підвищення фармакологічних ефектів у пацієнта. Метою даного винаходу є створення препарату альбуміну, який позбавлений зазначеного вище недоліку. На фіг.1 показане поглинання альбуміном ультрафіолетового випромінювання від різних джерел залежно від часу елюювання у процесі хроматографічного поділу. На фіг.2 показана зв'язувальна активність альбуміну від різних джерел за присутності різних концентрацій фенілбутазону. На фіг.3 показана зв'язувальна активність альбуміну від різних джерел за присутності різних концентрацій варфарину. Дана технічна задача вирішується створенням терапевтично застосовного вірус-інактивованого альбуміну, що має підвищену зв'язувальну здатність стосовно речовин, порівняно з альбуміном, вірус-інактивованим методом пастеризації. Зокрема, альбумін, відповідно до даного винаходу, має зв'язувальну здатність, що зросла, щонайменше, на 10% у порівнянні із зв'язувальною здатністю альбуміну, вірус-інактивованого методом пастеризації. Звичайно зв'язувальна здатність зростає у межах від 20 до 500%, зокрема, від 100 до 500%. У виняткових випадках можливі навіть більш високі значення залежно від підлягаючої скріпленню речовини. Речовинами, які зв'язуються або переносяться нативним (природним) альбуміном, зокрема, є низькомолекулярні активні речовини. Прикладами таких низькомолекулярних активних речовин є органічні або неорганічні речовини, нуклеїнові кислоти, поліпептиди, що мають, як правило, молекулярну вагу £10 000 дальтонів (Da). З метою лікування, як було згадане вище, альбумін за даним винаходом може бути використаний у вигляді рідкого розчину або у вигляді твердого тіла, зокрема, у ліофілізованій формі. Відповідно до винаходу альбумін може бути одержаний з використанням способу, який характеризується поєднанням наступних операцій, при яких: (a) для інактивації вірусу перший водний розчин альбуміну піддають обробці методом SD шляхом забезпечення його контакту з реагентами SD при температурі нижче 45°С; (b) видаляють, принаймні, суттєву кількість реагентів SD шляхом масляної екстракції з подальшою хроматографією гідрофобної взаємодії, при якій для забезпечення проходження згаданого процесу хроматографії використовують гідрофоб 5 80469 6 ну матрицю, зокрема матрицю, з якою довільно ження активності так званого активатора прокалікможуть зв'язуватися гідрофобні групи, за умови, рейну (РКА). РКА відомий своєю здатністю що як зазначені групи використовуються аліфатипонижувати кров'яний тиск після приймання РКАчні групи більш ніж з 24 атомами вуглецю, для вмісних препаратів за рахунок виділення вазоакодержання другого розчину альбуміну, до якого (c) тивної речовини брадикініну із высокомолекулярдовільно додають один або декілька стабілізатоного кініногену (HMWK). рів, обраних з групи цукрів, амінокислот, цукрових PKA звичайно інактивується під час пастериетилових спиртів, за умови, що не використовують зації протеїнових препаратів. Як відомо з рівня індол як стабілізатор, а також як такий стабілізатор техніки, теплова обробка, у процесі якої РКА, щоне застосовують жирну кислоту С6-С10, після чого найменше, частково інактивується, чинить неспри(d) другий розчин альбуміну, до якого вже доятливу дію на альбумін, приготовлений відповідно вільно був доданий стабілізатор, піддають остатодо винаходу. Якщо виникне потреба, із згаданих чному пакуванню та стерильній фільтрації і довівище причин PKA може бути видалений завдяки льно завантажують у контейнери. використанню спеціальних методів. Вони включаТермін «стабілізатор типу індол» стосується ють інкубацію (витримування у термостаті) з активсіх стабілізаторів, що мають скелет індолу, навованим вугіллям, після чого здійснюється фільтприклад, ацетилтриптофан. рація переважно за допомогою глибоких фільтрів Метод SD (= розчинник/детергент), що застоабо пряма фільтрація через фільтри, що містять совується для інактивації вірусів, відомий з [патенактивоване вугілля. тного документа ЕР-А-0 131 740]. В описі до даноКрім того, для видалення РКА дуже зручні іого документа серед інших протеїнів згадувався нообмінники, наприклад, катіонообмінники або також й альбумін. аніонообмінники. Дана операція може бути успішКрім того, з [патентного документа ЕР-А-0 но здійснена шляхом забезпечення контакту роз366 946] відомо, що реагенти SD можуть бути вичину, що містить альбумін, з матрицею в колонках далені за допомогою рослинних олій, наприклад, або з використанням групової технології, відомої соєвої олії з подальшою хроматографією гідрофокваліфікованому фахівцю у даній галузі техніки. Як бної взаємодії. Таким чином, порівняно з суттєвиальтернатива, з метою зниження вмісту РКА моми ознаками способу, розкритого у [патентному жуть бути використані матриця декстрансульфату документі ЕР-А-0 366 946], спосіб, поданий у п. 8 або гепарину. формули, слід було б розглядати як аналог спосоВ одержаному розчині, що містить альбумін, бу приготування альбуміну, відповідного одному з вміст РКА зменшений і вже не піддається вияваспектів даного винаходу. Проте зазначений вище ленню у кожному оптимальному випадку. Відповіпатент для процесу хроматографії, переважно, як дно до даного стану рівня техніки РКА ідентичний матрицю пропонує, наприклад, матрицю кремнію, активізованому (в результаті коагуляції) фактору з якою зв'язуються гідрофобні бічні ланцюги, тобто XII (FXII), який проведений від його проферментної відгалужені або не відгалужені ланцюги алкілу С 6форми (FXII). Це яви ще може відбуватися на поС24. верхнях як результат автокаталізу або ферментаНесподівано було виявлено, що використання тивної дії, наприклад, калікрейну. Відповідно, вигідрофобної матриці замість матриці, яка несе в снаження FXII (проферменту), який є собі ланцюги алкілу C18, наприклад, як гідрофобні попередником РКА, також може бути рекомендобічні ланцюги, призводить до більш високої зв'язуване, але не є обов'язковим. Однак щоб запобігти вальної здатності щодо поглинання детергентів. появі оновленого покоління РКА із проферментної Отже, відпадає будь-яка потреба у додаткових форми, остання також може бути видалена у прогідрофобних гр упах, призначених для зв'язування цесі іонообмінної хроматографії. Виснаження FXII з матрицею, що використовується згідно з даним може бути довільно здійснене з метою забезпевинаходом. Тому даний винахід стосується також чення довгострокового зберігання альбуміну у рідспособу використання такої матриці. кому стані. Це може виявитися доцільним після Інактивація вірусу успішно проходить при темрозморожування розчину альбуміну, який, можлипературі в діапазоні від 25 до 40°С. во, зберігався у замороженому стані. Отже, розчин У переважному прикладі здійснення даного альбуміну після заповнення контейнерів для зберівинаходу інактивація зірусу здійснюється протягом гання може бути підданий глибокому заморожуперіоду часу в діапазоні від 4 до 6 годин. ванню. Крім того, він може бути охолоджений, і в Гліцин виявив себе дуже добрим стабілізаторідкому або сухому замороженому стані зберігатиром. ся при температурі до 40°С. Рицинова олія виявилася дуже підхожою для Таким чином, для видалення РКА або речоздійснення процесу масляної екстракції. вин-попередників РКА активність будь-якого актиБуло виявлено, що використання полістиролватора прокалікрейну (РКА), яка може бути присудивінілбензол-полімеру або полімеру на основі тня до та після операцій (а), (b) або (с), може бути метакрилату як гідрофобної матриці надає процеліквідована відомим способом, зокрема, при якому су очи щення особливої ефективності. розчин альбуміну: Гідрофобні матриці, що застосовуються відпоA) вводять у контакт з активованим вугіллям з відно до даного винаходу, можуть нести розгалунаступним видаленням активованого вугілля з жені або лінійні аліфатичні групи більш ніж з 24 розчину альбуміну; або атомами вуглецю. B) піддають іонообмінній хроматографії. Залежно від застосовуваного вихідного матеОперацію (А) здійснюють при концентрації ріалу може виявитися необхідною операція виснаальбуміну від 1 до 25% за вагою, переважно, від 5 7 80469 8 до 10% за вагою. дять до 200г/л, а вміст натрію - до 80ммол/л Na+. Операцію (В) здійснюють, зокрема, при концеПісля цього розчин піддають стерильній фільтрації нтрації альбуміну від 5 до 10% за вагою. через мембранний фільтр з розміром пор £0,2mм. Ще в одному прикладі здійснення винаходу іоСтерильним відфільтрованим розчином запонообмінник поданий у вигляді аніонообмінника, і внюють стерильні апірогенні мішки з полівінілхлобуферну дію на розчин альбуміну чинить ацетат риду в асептичних умовах, а самі мішки маркують. натрію у кількості від 100 до 150ммол/л, при знаМарковані мішки піддають глибокому замороченні водневого показника рН від 5,0 до 6,0, пережуванню при температурі