Спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних культур м’якої пшениці, стійких до метаболітів gaeumannomyces graminis var. tritici та водного дефіциту

Реферат: Спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних ліній м'якої пшениці, стійких до метаболітів Gaeumannomyces graminis var. tritici та водного дефіциту для прискорення та збільшення частоти регенерації використовують модифіковане регенераційне середовище. У середовищі 6-бензиламінопурин замінений на тідіазурон, вилучені хітозан, бурштинова та глютамінова кислоти та додатково містить цефотаксим та емоксипін. UA 81752 U (54) СПОСІБ ПІДВИЩЕННЯ РЕГЕНЕРАЦІЙНОЇ ЗДАТНОСТІ КАЛЮСНИХ КУЛЬТУР М'ЯКОЇ ПШЕНИЦІ, СТІЙКИХ ДО МЕТАБОЛІТІВ GAEUMANNOMYCES GRAMINIS VAR. TRITICI ТА ВОДНОГО ДЕФІЦИТУ UA 81752 U UA 81752 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до біотехнології, зокрема методів клітинної селекції, і може бути використана для забезпечення прискореного отримання вихідного селекційного матеріалу пшениці з комплексною стійкістю до стресових чинників довкілля. В умовах глобальних змін клімату, коли на рослинний організм діє низка біотичних та абіотичних стресових чинників, добір на комплексну стійкість є особливо актуальною і важливою частиною селекційного процесу. Поряд із застосуванням традиційних генетикоселекційних методів отримання високопродуктивних сортів та гібридів сільськогосподарських культур все більшого поширення набувають біотехнологічні прийоми при створенні вихідного матеріалу, стійкого до комплексу різних стресових чинників. Одним із таких методів є клітинна селекція, тобто добір бажаних генотипів з новими спадковими ознаками на рівні культивованих in vitro клітин у специфічних умовах. Відомий спосіб отримання калюсних ліній м'якої пшениці, стійких до культурального фільтрату Gaeumannomyces graminis var. tritici та модельованого водного дефіциту (Зінченко М.О., Дубровна О.В., Бавол А.В., Селекція in vitro м'якої пшениці на комплексну стійкість до метаболітів збудника офіобольозу та водного дефіциту // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів.-2012. – Т.10, - №1. - С. 20-27). Проте значним недоліком даного способу (прототипу) є низька регенераційна здатність клітинних ліній, яка не перевищує 3-8 %, що не забезпечує отримання достатньої кількості рослин-регенерантів для залучення в селекційний процес. В основу корисної моделі поставлена задача підвищення регенераційної здатності стійких калюсних культур м'якої пшениці для прискореного отримання та збільшення кількості рослинрегенерантів з комплексною стійкістю до стресових чинників довкілля. Поставлена задача вирішується тим, що в способі підвищення регенераційної здатності калюсних культур м'якої пшениці, стійких до метаболітів Gaeumannomyces graminis var. tritici та водного дефіциту який включає: добір стійких калюсних ліній на селективних середовищах з культуральним фільтратом та манітом; експлантацію стійких калюсів на регенераційне середовище для індукції органогенезу; культивування до отримання проростків; згідно з корисною моделлю, для підвищення частоти регенерації використовують пересадку стійких калюсів на певний об'єм (30 мл) модифікованого середовища Мурасіге-Скуга (МС) (Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Planta.-1962. - V. 15. - P. 473-497), у якому 6-бензиламінопурин замінений на тідіазурон, вилучені хітозан, бурштинова та глютамінова кислоти та додатково містить цефотаксим та емоксипін при таких співвідношеннях компонентів, мг/л: амоній азотнокислий 1650,0; калій азотнокислий - 1900,0; кальцій хлористий - 440,0; магній сірчанокислий - 370,0; калій фосфорнокислий, однозаміщений-170,0; залізо сірчанокисле 27,95; етилендіамінтетраацетат натрію - 37,23; борна кислота -6,2; марганець сірчанокислий - 22,3; цинк сірчанокислий - 8,6; калій йодистий - 0,83; натрій молібденово кислий - 0,25; мідь сірчанокисла - 0,025; кобальт хлористий -0,025; аспарагінова кислота - 50,0; глютамінова кислота - 50,0; піклорам - 1,0; тідіазурон - 1,0; цефотаксим - 75,0; емоксипін - 10,0; азотнокисле срібло -10,0; мезоінозит -100,0; тіамін-НСІ - 1,0; піридоксин-НСІ - 0,5; нікотинова кислота - 0,5; культуральний фільтрат Gaeumannomyces graminis var. tritici-500 мл; маніт - 109,6 г; сахароза 30000,0; агар-агар - 8000,0; бідистильована вода - до 1л. Запропонований спосіб характеризується такими суттєвими ознаками: добір стійких калюсних ліній на селективних середовищах з культуральним фільтратом та манітом; експлантацію стійких калюсів на регенераційне середовище для індукції органогенезу; культивування до отримання проростків. На відміну від прототипу, який передбачає (таблиця 1, середовище 1) 3-кратне пасажування ліній на ньому, що значно подовжує тривалість індукції рослин-регенерантів, при здійсненні запропонованого способу регенераційні процеси спостерігаються вже у калюсів 1 пасажу, що значно зменшує час культивування та прискорює процес отримання рослин - регенерантів. 1 UA 81752 U Таблиця 1 Концентрація компонентів регенераційного середовища, мг/л Компоненти Амоній азотнокислий Калій азотнокислий Кальцій хлористий Магній сірчанокислий Калій фосфорнокислий, однозаміщений Залізо сірчанокисле Етилендіамінтетраацетат натрію Борна кислота Марганець сірчанокислий Цинк сірчанокислий Калій йодистий Натрій молібденовокислий Мідь сірчанокисла Кобальт хлористий Мезоінозит Аспарагінова кислота Хітозан Аспарагінова кислота Глутамінова кислота Емоксипін Цефотаксим Тіамін-НСІ Піридоксин-НСl Нікотинова кислота Культуральний фільтрат Маніт Азотнокисле срібло Тідіазурон Бензиламінопурин Піклорам Сахароза Агар-агар Бідистильована вода 5 10 15 Середовище 1, MC-3 (прототип) 1650,0 1900,0 440,0 370,0 Середовище 2 MC-3/CR (заявлене) 1650,0 1900,0 440,0 370,0 170,0 170,0 27,95 37,23 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 100,0 50,0 25,0 50,0 50,0 1,0 0,5 0,5 500 мл 109,6 г 10,0 0,5 1,0 30000,0 8000,0 до 1 літру 27,95 37,23 6,2 22,3 8,6 0,83 025 0,025 0,025 100,0 50,0 10,0 75,0 1,0 0,5 0,5 500 мл 109,6 г 10,0 1,0 1,0 30000,0 8000,0 до 1 літру Новою, відмінною від прототипу ознакою, є прискорене отримання рослин - регенерантів на модифікованому середовищі (MC-3/CR) у якому 6-бензиламінопурин замінений на тідіазурон, вилучені хітозан, бурштинова та глютамінова кислоти та додатково містить цефотаксим та емоксипін у таких співвідношеннях компонентів мг/л: тідіазурон -1,0, цефотаксим -75,0; емоксипін-10,0. Використання модифікованого регенераційного середовища дозволяє у більш коротший термін та більшій кількості отримувати рослини-регенеранти пшениці з комплексною стійкістю до стресових чинників, зокрема культурального фільтрату Gaeumannomyces graminis var. tritici та модельованого водного дефіциту для використання їх в селекції на стійкість до стресів довкілля і таким чином забезпечити скорочення і спрощення біотехнологічного процесу та зменшити матеріальні затрати для його виконання. Це стало можливим здійснити на основі даних, які були одержані в результаті проведення попередніх досліджень. При використанні модифікованого живильного середовища МС (MC3/CR) відмічається збільшення кількості калюсів, що регенерують у 2-3 рази порівняно з прототипом, про що свідчать дані наступної таблиці. 2 UA 81752 U Таблиця 2 Частота регенерації у калюсних ліній пшениці, стійких до культурального фільтрату Gaeumannomyces graminis var. Tritici Калюсна лінія Лінія 1стм Лінія 2стм Лінія 3стм Лінія 4стм Лінія 5стм Лінія 6стм Лінія 1стм Лінія 2стм Лінія 3стм Лінія 4стм Лінія 5стм Лінія 6стм 5 10 15 20 25 30 35 Середовище МС-3 МС-3 МС-3 МС-3 МС-3 МС-3 MC-3/CR МС-3/ CR МС-3/ CR МС-3/ CR МС-3/ CR МС-3/ CR Кількість висаджених калюсів, шт. 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Кількість калюсів, що утворювали рослинирегенеранти, шт. 5 8 4 7 4 3 11 21 8 22 9 6 Відсоток регенерації, % 5,0±2,2 8,0±2,7 4,0±2,0 7,0±2,6 4,0±2,0 3,0±1,7 11,0±3,1 21,0±4,0 8,0±2,8 22,0±4,1 9,0±2,9 6,0±2,4 Спосіб здійснюється наступним чином: на агаризованому середовищі Мурасіге-Скуга такого складу: мг/л: амоній азотнокислий- 1650,0; калій азотнокислий - 1900,0; кальцій хлористий 440,0; магній сірчанокислий -370,0; калій фосфорнокислий, однозаміщений - 170,0; залізо сірчанокисле - 27,95; етилендіамінтетраацетат натрію - 37,23; борна кислота -6,2; марганець сірчанокислий - 22,3; цинк сірчанокислий - 8,6; калій йодистий - 0,83; натрій молібденовокислий - 0,25; мідь сірчанокисла - 0,025; кобальт хлористий - 0,025; L-аспарагін-150,0, піклорам - 2 мг/л; азотнокисле срібло -10,0; мезоінозит - 100,0; тіамін-НСІ - 1,0; піридоксин-НСl-0,5; нікотинова кислота - 0,5; культуральний фільтрат - 500 мл; сахароза - 30000,0; агар-агар - 8000,0; бідистильована вода - до 1л методом ступінчастої клітинної селекції добирають стійкі калюсні лінії, які характеризуються нормальним приростом біомаси на селективному середовищі, а й зберігають морфогенетичний потенціал. Стійкі калюси для індукції органогенезу переносять на регенераційне середовище MC-3/CR такого складу мг/л: амоній азотнокислий - 1650,0; калій азотнокислий - 1900,0; кальцій хлористий - 440,0; магній сірчанокислий - 370,0; калій фосфорнокислий, однозаміщений - 170,0; залізо сірчанокисле - 27,95; етилендіамінтетраацетат натрію - 37,23; борна кислота - 6,2; марганець сірчанокислий - 22,3; цинк сірчанокислий - 8,6; калій йодистий - 0,83; натрій молібденовокислий - 0,25; мідь сірчанокисла - 0,025; кобальт хлористий - 0,025; аспарагінова кислота - 50,0; піклорам - 1,0; азотнокисле срібло -10,0; мезоінозит - 100,0; тіамін-НСІ - 1,0; піридоксин-НСl-0,5; нікотинова кислота - 0,5; культуральний фільтрат - 500 мл; маніт 109,6 г; тідіазурон - 1,0; цефотаксим - 75,0; емоксипін - 10,0. сахароза - 30000,0; агар-агар - 8000,0; бідистильована вода - до 1л. Живильне середовище (рН-5,8) розливають у мірні колби та автоклавують при температурі 120 °C протягом 20 хвилин (тиск 1,05 атм). В стерильні чашки Петрі діаметром 80 мм розливають по 30 мл регенераційного середовища. На кожну чашку висаджують оптимальну кількість калюсної маси, яка становить 40 штук агрегатів, діаметром до 5мм на відстані 10 мм один від одного. Матеріал культивують при температурі 24±2 °C, освітленні 3-4 клк протягом пасажу до появи нормально розвинутих пагонів. Отримані рослини-регенеранти переносять на середовище для укорінення. Порівняльний аналіз заявленої корисної моделі з прототипом показав, що заявлений спосіб відрізняється новими суттєвими ознаками, які полягають в тому, що для підвищення регенераційної здатності та прискореного отримання рослин-регенерантів, стійкі калюси пересаджують на модифіковане середовище (MC-3/CR), у якому 6-бензиламінопурин замінений на тідіазурон, вилучені хітозан, бурштинова та глютамінова кислоти та додатково містить цефотаксим та емоксипін у таких співвідношеннях компонентів мг/л: тідіазурон - 1,0; цефотаксим - 75,0; емоксипін-10,0. Сукупність заявлених ознак прискорює процес отримання стійких до комплексу стресових чинників рослин-регенерантів м'якої пшениці та збільшує їх кількість у 2-3 рази і таким чином забезпечує скорочення біотехнологічний процесу і зменшення матеріальних затрат для його виконання. 3 UA 81752 U 5 10 15 20 25 Заявлений спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних ліній м'якої пшениці, стійких до метаболітів Gaeumannomyces graminis var. tritici та модельованого водного дефіциту шляхом використання модифікованого живильного середовища дозволяє прискорити процес отримання рослин-регенерантів пшениці з комплексною стійкістю та збільшити їх кількість чим і обумовлена ефективність його застосування. Використання заявлених ознак забезпечує скорочення біотехнологічного процесу і зменшення матеріальних затрат для його виконання. Може бути використаний для одержання толерантних рослин-регенерантів в біотехнології та селекції м'якої пшениці. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних ліній м'якої пшениці, стійких до метаболітів Gaeumannomyces graminis var. tritici та водного дефіциту, який включає: добір стійких клітинних ліній на селективних середовищах з культуральним фільтратом та манітом; експлантацію стійких калюсів на регенераційне середовище для індукції органогенезу; культивування до отримання проростків; який відрізняється тим, що для прискорення та збільшення частоти регенерації використовують модифіковане регенераційне середовище у якому 6-бензиламінопурин замінений на тідіазурон, вилучені хітозан, бурштинова та глютамінова кислоти та додатково містить цефотаксим та емоксипін у таких співвідношеннях компонентів мг/л: амоній азотнокислий - 1650,0; калій азотнокислий - 1900,0; кальцій хлористий - 440,0; магній сірчанокислий - 370,0; калій фосфорнокислий, однозаміщений - 170,0; залізо сірчанокисле - 27,95; етилендіамінтетраацетат натрію - 37,23; борна кислота - 6,2; марганець сірчанокислий - 22,3; цинк сірчанокислий - 8,6; калій йодистий - 0,83; натрій молібденовокислий - 0,25; мідь сірчанокисла - 0,025; кобальт хлористий - 0,025; аспарагінова кислота - 50,0; піклорам - 1,0; азотнокисле срібло - 10,0; мезоінозит - 100,0; тіамін-НСІ - 1,0; піридоксин-НСl 0,5; нікотинова кислота - 0,5; культуральний фільтрат - 500 мл; маніт 109,6 г тідіазурон - 1,0, цефотаксим - 75,0; емоксипін - 10,0; сахароза - 30000,0; агар-агар - 8000,0; бідистильована вода - до 1л. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4