Спосіб ідентифікації бактеріального опіку плодових erwinia amylоvora (burrill) winslow et al

Реферат: Спосіб ідентифікації бактеріального опіку плодових включає виділення чистої культури бактеріального опіку плодових, з наступним аналізом білкового складу бактерій методом ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі, в якому білки розділюються в електричному полі за градієнтом рН 3,5-10,0. Додатково отримують ізоелектрофореграму, специфічну для Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al., за якою ідентифікують нові виявлені ізоляти хвороби. UA 82292 U (12) UA 82292 U UA 82292 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, зокрема до фітопатології та карантину рослин, а саме - виявлення та ідентифікації збудників бактеріальних захворювань плодових культур. В сучасних фітопатологічних дослідженнях для ідентифікації патогенних мікроорганізмів використовують такі методики [1]: - IFAS - метод імунофлуоресцентного забарвлення клітин з використанням антисироватки та флуоресцентної ізотіоціанатної сполуки; результат визначається за кількістю флуоресціюючих клітин під мікроскопом з відповідними фільтрами; - DAS ELISA - фермент-залежний імуносорбційний аналіз з використанням моноклональних антитіл; - PCR - метод полімеразної ланцюгової реакції, що базується на виявленні фрагмента ДНК плазміди рЕА29, яка присутня в клітинах всіх вірулентних штамів Erwinia amylovora; Також використовується лабораторна методика визначення видової приналежності бактерій шляхом вивчення комплексу їх морфо-культуральних та фізіолого-біохімічних властивостей та порівняння їх з уже відомими штамами збудників бактеріозів (прототип). Недоліками вищезгаданих способів ідентифікації є необхідність використання складного обладнання та висока вартість реактивів. Спосіб-прототип є досить довготривалим та вимагає великих затрат робочого часу на приготування реактивів та поживних середовищ. Крім цього, через внутрішньовидову мінливість бактерій та можливість виникнення в природі та лабораторних умовах штамів, мутантних за деякими ознаками, стабільність морфологічних та фізіологічних показників виявляється недостатньою для достовірної ідентифікації патогену. В основу запропонованої корисної моделі поставлена задача: зменшити затрати робочого часу на діагностику бактерій-збудників хвороб плодових культур. Пришвидшення визначення видової приналежності патогену дозволить вчасно вживати необхідні заходи по обмеженню його поширення. Поставлена задача вирішується тим, що запропонований спосіб дозволяє швидко і достовірно ідентифікувати бактерії, виділені з уражених рослин, шляхом аналізу їх білкового складу методом ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі, в якому білки розділюються в електричному полі одночасно як за градієнтом напруги, так і за градієнтом рН 3,5-10,0, що створюється у гелі амфолітом-носієм. У результаті цього отримують ізоелектрофореграму, специфічну для Erwinia amylovora і таким чином вдається ідентифікувати нові виявлені ізоляти хвороби. Переваги способу: 1. Запропонований спосіб дозволяє значно скоротити затрати часу на ідентифікацію патогену. 2. Для роботи використовують недороге обладнання. 3. Запропонований спосіб є більш достовірним, ніж визначення видової приналежності за комплексом морфо-культуральних та фізіолого-біохімічних ознак. Отже, спосіб, що заявляється, відповідає критерію корисної моделі "новизна" та "суттєві відміни". Приклади здійснення способів Приклад 1 (прототип). Лабораторний аналіз зразків рослинного матеріалу на присутність бактеріальних патогенів за класичною схемою складається з таких етапів [2-4]: 1) виділення бактерій із на чашки Петрі з поживним середовищем (картопляний або м'ясопептонний агар); 2) вивчення і опис морфології бактеріальних колоній на різних поживних середовищах; 3) мікроскопічне дослідження бактерій - у висячій краплі та фіксованих препаратів (фарбованих за Грамом); 4) визначення патогенності бактерій з використанням сприйнятливих рослин - пагони груші, айви та яблуні, плоди груші для тесту Уайта (Фіг. 1); тест на надчутливість на листках тютюну або пеларгонії; 5) вивчення фізіолого-біохімічних властивостей бактерій з використанням діагностичних середовищ (свинцевий агар Моріса, середовище Кларка, середовища Гіса для визначення засвоєння вуглеводів, МПА з крохмалем, середовище Кінга, середовище ММ2 з сульфатом міді та ін.) для визначення видової приналежності бактерій (Фіг. 2). Весь комплекс досліджень після виділення чистих культур бактерій потребує тривалого часу (від 7-10 днів) та великих затрат праці на приготування необхідних реактивів та поживних середовищ. Крім того, тестування на патогенність вимагає використання свіжих рослин сприйнятливих до хвороби видів і тому можливе лише в певний період часу. 1 UA 82292 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Приклад 2 Для дослідження збудників бактеріальних хвороб плодових культур використовують чисту культуру бактерій, виділену із ураженого рослинного матеріалу. Бактерії, вирощені на скошеному агарі, за допомогою петлі для пересіву переносять в центрифужну пробірку з фосфатним буфером рН 8,4 (1:1), перемішують і витримують 20 годин в морозильній камері. Далі пробірки з біоматеріалом центрифугують при 15 тис. об/хв. впродовж 10 хвилин; супернатант в кількості 30 мл використовують для аналізу. Ізоелектрофоретичні дослідження білків бульб картоплі проводять в ультратонких пластинах поліакриламідного гелю (при С - відношення маси метиленбісакриламіду до загальної маси обох полімерів: акриламід + метиленбісакриламід - 3 %, Т - відношення сумарної маси обох полімерів до об'єму їх розчину - 5 %) з амфолітом інтервалу рН 3,5-10,0. В основі методу лежить принцип розділення білків за ізоелектричними точками в градієнті рН (оборотний логарифм концентрації іонів водню в розчині). Супернатант в кількості 30 мкл наносять за допомогою аплікатора на поліакриламідному гелі. Розгонку білків в електричному полі проводять на охолоджуючому столику при напрузі 600 В. Час стабілізації - 2 години. Гелі від амфоліту відмивають в розчині трихлороцтової кислоти: етанолу: води (10:25:65). Фарбування білкових треків проводять за допомогою барвника Commassi blue G-250. Відмивку надлишків фарби проводять розчином оцтової кислоти:етанолу:води (10:25:65) [5]. У результаті комп'ютерного аналізу [6] білкових спектрів бактеріального опіку - штам ІMB 2024 (еталон) встановлено, що спектр в інтервалі рН 3,0-10,0 нараховує 29 білкових компонентів. Таким чином, за допомогою способу ізоелектрофокусування білків в поліакриламідному гелі бактеріальних ізолятів можливо швидко і достовірно визначити їх видову приналежність шляхом порівняння білкових спектрів. Процес ідентифікації еталона (штаму бактеріального опіку склав 2,5 години, а способомпрототипом - 7-12 діб. Запропонований спосіб ідентифікації підтверджує експериментальна перевірка, яка здійснювалась при ідентифікації штаму ІMB 2024, отриманий з Інституту мікробіології НАН України. Джерела інформації: 1. Diagnosis of Erwinia amylovora // Diagnostic protocols for organisms harmful to plants. SMT project SMT-4-CT98-2252.-38 pp. 2. Методические указания по диагностике и мерам борьбы с бактериальным некрозом и ожогом плодовых культур. - М., 1987.-32 с. 3. Методы исследования возбудителей бактериальных болезней растений / [Бельтюкова К.И., Матышевская М.С., Куликовская М.Д., Сидоренко С.С.]. - К.: Наукова думка, 1968.-316 с. 4. Методы фитопатологии / Кирай З., Клемент З, Шоймоши Ф., Береш Й. - М.: Колос, 1974. С. 82-159. 5. Ригетти Т. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы, применение / Ригетти Т. М.: Мир, 1986.-286 с. 6. Авт. свід. № 26 245 від 29. 10. 2008р. Комп' ютерна програма "Розрахунок ізоелектричних білкових спектрів", заявлено 24.04.2008 р. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб ідентифікації бактеріального опіку плодових, що включає виділення чистої культури бактеріального опіку плодових, з наступним аналізом білкового складу бактерій методом ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі, в якому білки розділюються в електричному полі за градієнтом рН 3,5-10,0, який відрізняється тим, що отримують ізоелектрофореграму, специфічну для Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al., за якою ідентифікують нові виявлені ізоляти хвороби. 2 UA 82292 U 3 UA 82292 U Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4