Спосіб оцінки біологічної безпеки наноматеріалів in vitro

Реферат: Спосіб оцінки біологічної безпеки наноматеріалів in vitro, який відрізняється тим, що здійснюється вимірювання інтенсивності люмінолзалежної хемілюмінесценції в присутності диперйодаткупрату в культурі клітин, що зазнали впливу тестованого наноматеріалу, і якщо вона перевищує фоновий рівень світіння, роблять висновок про біологічну небезпечність дослідженого наноматеріалу. UA 82350 U (12) UA 82350 U UA 82350 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель, що заявляється, належить до медико-біологічних наук, а саме до онкології, та може бути використана для оцінки біологічної безпеки нанорозмірних матеріалів різного походження в умовах in vitro. Рівень техніки. Сучасні підходи до розробки нових засобів протипухлинної терапії передбачають таргетну доставку діючої речовини безпосередньо до злоякісно трансформованих клітин або навіть субклітинних структур. З цією метою застосовуються векторні системи, серед яких останнім часом неухильно зростає кількість нанорозмірних транспортерів з унікальними фізико-хімічними характеристиками, насамперед магнітними, оптичними, каталітичними та розвинутою активною поверхнею, що сприяє підвищенню їх біофункціоналізації. Отже, актуальною стає проблема визначення біологічної безпеки саме таких наноматеріалів, що на сьогодні вирішується за допомогою різноманітних тестів на цитотоксичність. Загальновідомими, вибраними як показник рівня техніки, методичними підходами визначення цитотоксичності сполук різного походження є: забарвлення клітин бромідом [3-(4,5диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолію (МТТ-тест)] [1], визначення в клітинах концентрації аденозинтрифосфату [2], оцінка змін експресії генів у клітинах за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) [3]. Недоліками цих методів вважаються висока (до 30 %) частота сумнівних, неоднозначних результатів, які не можуть бути адекватно інтерпретовані (МТТ-тест), висока вірогідність розкладу аденозинтрифосфату при незначних змінах умов проведення дослідження, а також значні затрати часу на проведення ПЛР. За прототип нами вибрано спосіб оцінки біосумісності матеріалів різного походження на альвеолярних макрофагах [4], що передбачає вимірювання інтенсивності хемілюмінесценції альвеолярних макрофагів після додавання до них наноматеріалів, які тестують. Позитивним у прототипі є те, що даний спосіб дозволяє швидко оцінювати біосумісність наноматеріалів різної природи після додавання їх до альвеолярних макрофагів за рахунок реєстрації в цих клітинах хемілюмінесценції. Недоліком прототипу є те, що даний тест не дає можливості кількісно оцінити ступінь біологічної безпеки дослідженого наноматеріалу. Власне опис моделі, що заявляється. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлено задачу: розробити доступний спосіб кількісної оцінки в системі in vitro біологічної безпеки наноматеріалів різного походження та створених на їх основі лікарських засобів, які пропонуються для протипухлинної терапії. Поставлена задача вирішується шляхом вимірювання інтенсивності люмінолзалежної хемілюмінесценції в присутності диперйодаткупрату, що ініціюється в нормальних, злоякісно трансформованих клітинах різного гістогенезу та лімфоцитах периферичної крові завдяки накопиченню перекисних сполук, які є продуктами вільнорадикального метаболізму, стимульованого впливом наноматеріалів. Клітини лінії MCF-7 після інкубації з наноматеріалом відмивають забуференим фосфатами фізіологічним розчином (рН 7,4) та розсаджують по 40 тис. в 20 мкл рідини в лунки 96-лункового планшету для люмінесцентних досліджень з прозорим дном. Хемілюмінесценцію реєструють з донної частини лунок при температурі 37 °C інтервалами по 30 с за наступним алгоритмом: 30 1) вимірюють фоновий рівень світіння протягом 30 с ( S1); 2) додають 20 мкл 1 мкМ розчину люмінолу в 0,1 Μ гідроксиді натрію та вимірюють 30 хемілюмінесценцію протягом 30 с ( S2); 3) додають 40 мкл 200 мкМ розчину диперйодаткупрату та вимірюють хемілюмінесценцію 30 протягом наступних 30 с ( S3). За результатами вимірювань підраховують показник світлосуми хемілюмінесценції за 30 с 30 30 30 для кожного з трьох періодів - S1, S2, S3 (в ум. од.). 30 Висновок про біологічну небезпеку тестованого наноматеріалу робиться, якщо S3 30 30 30 достовірно перевищує S1 (цитотоксична дія), або S2 достовірно перевищує S1 (виражений цитотоксичний вплив). Приклади практичного застосування корисної моделі Прикладами успішної реалізації способу можуть бути результати досліджень, проведених на клітинах лінії MCF-7, які культивували в присутності наночастинок магнітної рідини [5] та стабілізованого фосфоліпідами феромагнетика [6]. 30 Приклад І. Фоновий рівень світлосуми хемілюмінесценції за 30 с ( S1) клітин MCF-7 дорівнював 59,5 ум. од. Після 24 годин інкубації з наночастинками стабілізованого фосфоліпідами феромагнетика в концентрації 100 мкг/мл (за магнетитом) і додавання люмінолу спостерігається світіння, інтенсивність якого достовірно вища за фоновий рівень і підсилюється 1 UA 82350 U 30 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 30 додаванням диперйодаткупрату ( S2=78,0 ум. од., S3=82,1 ум. од., відповідно;), що свідчить про виражену цитотоксичну дію та біологічну небезпеку цього наноматеріалу (фіг. 1). Приклад II. Фоновий рівень світіння клітин MCF-7 дорівнював 56,0 ум. од. Після 24 годин інкубації з наночастинками магнітної рідини у концентрації 100 мкг/мл і додавання люмінолу 30 спостерігається невеликий спалах, але світлосума хемілюмінесценції за 30 с ( S2=53,5 ум. од.) не відрізняється від фонової, а достовірне підвищення інтенсивності хемілюмінесценції 30 ініціюється додаванням диперйодаткупрату ( S3=67,7 ум. од.), що свідчить про помірну цитотоксичність тестованого наноматеріалу, тобто магнітна рідина є більш біологічно безпечною (фіг. 2). Приклад III. Фоновий рівень світіння клітин MCF-7 дорівнював 63,0 ум. од. Після 24 годин інкубації з наночастинками магнітної рідини в концентрації 50 мкг/мл і додавання люмінолу спостерігається світіння, інтенсивність якого достовірно не відрізняється від фонового і не 30 30 підсилюється додаванням диперйодаткупрату ( S2=60 ум. од., S3=60,7 ум. од., відповідно), що свідчить про відсутність цитотоксичної дії та біологічну безпеку тестованого наноматеріалу (фіг. 3). Таким чином, спосіб оцінки біологічної активності наноматеріалів in vitro дозволяє швидко отримати інтегральний показник, який дає змогу кількісно порівнювати біологічну сумісність та безпеку наноматеріалів. Спосіб, що заявляється, може бути використаний при розробці нових матеріалів з використанням досягнень в області нанотехнологій для прогнозування їх впливу на клітини живих організмів. Джерела інформації: 1. Brunner T.J., Wick P., ManserP. et al. In vitro cytotoxicity of oxide nanoparticles: comparison of asbestos, silica, and the effect of particle solubility // Environ. Sci. Technol.-2006. - Vol. 40, №14. - P. 4374-4381. 2. AshaRanl P.V., Mun G.L.K., Hande M.P. et al. Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells // ACSNano.-2009. - Vol. 3,№ 2. - P. 279-290. 3. Park E.-J., Choi J., Park Y.-K. et al. Oxidative stress induced b cerium oxide nanoparticles in cultured BEAS-2B cells //Toxicology.-2008. - Vol. 245, №1-2. - P. 90-100. 4. Barth E., Sullivan Т., Berg E., Myrvik Q.N. Chemiluminescent responses of macrophages exposed to biomaterials: a biocompatibility screening test // J. Invest. Surg.-1988. - №1. - Vol. 4. - P. 291-297. 5. Патент України №47930UA на корисну модель "Спосіб отримання стабілізованого розчину наночастинок магнетиту для адресної доставки протипухлинних препаратів", заявл. 08.10.2009, опубл. 25.02.2010, Бюл. №4. 6. Патент України №9921ША на винахід "Нанокапсула з функціями наноробота", заявл. 13.04.2011, опубл. 25.07.2012, Бюл. №14. Фіг. 1. Хемілюмінесценція в культурі клітин лінії MCF-7 після 24 годин інкубації з наноферомагнетиком в концентрації 100 мкг/мл. 30 30 Примітка: Світлосума хемілюмінесценції за 30 с: S1 - фонова; S2 - після додавання 30 люмінолу; S3 - після додавання диперйодаткупрату. Фіг. 2. Хемілюмінесценція в культурі клітин лінії MCF-7 після 24 годин інкубації з наночастинками магнітної рідини в концентрації 100 мкг/мл. 30 30 Примітка: Світлосума хемілюмінесценції за 30 с: S1 - фонова; S2 - після додавання 30 люмінолу; S3 - після додавання диперйодаткупрату. Фіг. 3. Хемілюмінесценція в культурі клітин лінії MCF-7 після 24 годин інкубації з наночастинками магнітної рідини в концентрації 50 мкг/мл. 30 30 Примітка: Світлосума хемілюмінесценції за 30 с: S1 - фонова; S2 - після додавання 30 люмінолу; S3 - після додавання диперйодаткупрату. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб оцінки біологічної безпеки наноматеріалів in vitro, який відрізняється тим, що здійснюється вимірювання інтенсивності люмінолзалежної хемілюмінесценції в присутності диперйодаткупрату в культурі клітин, що зазнали впливу тестованого наноматеріалу, і якщо вона перевищує фоновий рівень світіння, роблять висновок про біологічну небезпечність дослідженого наноматеріалу. 2 UA 82350 U 3 UA 82350 U Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4