Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета flammulina velutipes (curtis) singer f-1105-продуцент екзопродуктів перекисного окиснення ліпідів

Реферат: Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-l105 - продуцент екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів. UA 76863 U (54) ШТАМ СОМАТИЧНИХ СТРУКТУР ДЕРЕВОРУЙНІВНОГО БАЗИДІОМІЦЕТА FLAMMULINA VELUTIPES (CURTIS) SINGER F-1105-ПРОДУЦЕНТ ЕКЗОПРОДУКТІВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ UA 76863 U UA 76863 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікології та біотехнології і може бути використана в промисловому грибівництві, екології та для деструкції відходів різних галузей промисловості і сільського господарства. Ксилотрофні базидіальні гриби, що викликають білу гниль деревини, мають унікальну здатність до розщеплення лігноцелюлозного комплексу цього субстрату. Зокрема, процес деструкції лігніну - надзвичайно хімічно стійкої сполуки, відбувається під впливом лігнінолітичних ферментів цих грибів, та залежить від генерації вільних, в т.ч. перекисних ліпідних, радикалів. Встановлено, що вони, в силу своєї хімічної нестабільності, здатні спричиняти численні спонтанні ланцюгові реакції [2, 4, 8, 9]. Ці реакції носять неспецифічний характер, тому існує можливість залучення ксилотрофних базидіоміцетів до процесів розкладання лігноцелюлозних відходів деревообробної, харчової промисловості та сільського господарства, а також біоремедіації забруднених середовищ [9, 10]. Отже, існує необхідність пошуку штамів дереворуйнівних базидіоміцетів, які мають високий рівень процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) в культуральній рідині, та водночас є стійкими до негативного впливу перекисних радикалів і ефективно нарощують біомасу. Відомі результати порівняльного дослідження вмісту в грибах продуктів ПОЛ. Штами ксилотрофних базидіоміцетів культивують в глибинній культурі на глюкозо-пептонному середовищі. Надаються дані щодо вмісту продуктів ПОЛ в гомогенатах міцелію і ліпідах грибів різних систематичних, екологічних і фізіологічних груп. Не представлено даних про вміст продуктів ПОЛ в культуральній рідині штамів, а також не досліджувалися штами опенька зимового Flammulina velutipes [3]. Відомі штами Flammulina velutipes, залучені до визначення стресового стану базидіоміцетів та екологічного стану місця їх зростання за вмістом продуктів перекисного окиснення ліпідів, що включає визначення вмісту продуктів ПОЛ, активних до тіобарбітурової кислоти в культурах грибів, причому визначення їх вмісту проводять в дикорослих плодових тілах базидіоміцетів із різних за екологічними умовами місць зростання та міцеліальних культурах цих грибів при штучному культивуванні в оптимальних умовах і при дії температурних стресорів [5]. Було застосовано модифікацію методу визначення продуктів ПОЛ, що не дозволяє порівняти отримані дані з іншими дослідженнями, використання методу поверхневого культивування не є ефективним в біотехнологічних процесах. Найбільш близький за технічною суттю і досягнутому результату є штам F-610 Flammulina velutipes, в міцеліальних культурах якого, отриманих шляхом штучного культивування на живильних середовищах, які містять фенол у концентрації 0,005-0,15 %, проводять визначення вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів з метою визначення ступеня токсичного навантаження фенолом на природні системи [6]. Не досліджувалася інтенсивність ПОЛ при глибинному методі культивування, для визначення продуктів ПОЛ застосовувалася модифікація метода. В основу корисної моделі поставлено задачу отримання нового штаму соматичних структур ксилотрофного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer, який відрізняється від прототипу високою інтенсивністю процесів ПОЛ в культуральній рідині, отже є продуцентом екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів. Поставлена задача вирішується тим, що інтродукований штам F-1105 гриба Flammulina velutipes (Curtis) Singer, згідно з корисною моделлю, має високу інтенсивність процесів ПОЛ в культуральній рідині при глибинному культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 25,0 °C протягом 6-ти діб на лабораторній качалці. Інтродукований штам F-1105 макроскопічного гриба Flammulina velutipes (Curtis) Singer має наступні характеристики. Систематичне положення об'єкта дослідження. Царство: Fungi Відділ: Basidiomycota Підвідділ: Agaricomycotina Клас: Agaricomycetes Підклас: Agaricomycetidae Порядок: Agaricales Родина: Physalacriaceae Рід: Flammulina Вид: Flammulina velutipes Штам F-1105 Flammulina velutipes отримано за загальноприйнятим методом виділення чистих культур базидіоміцетів з дикорослих плодових тіл [1], що були зібрані на деревині 1 UA 76863 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ушкодженого листяного дерева Salix alba -верба біла в м. Донецьку у 2011 році. Плодові тіла знаходилися на деревині в невеликій групі. Шапинки середнього розміру, до 60 мм діаметром, опуклі, охряно-золотистого кольору, центральна частина коричневого кольору, край блідожовтий. Пластинки тонкі, широкі, жовтуваті. Ніжки завдовжки 30-60 мм і діаметром близько 5 мм, циліндричні, волокнисті, порожні, на самому верху жовтуваті, нижче коричнево-бурі, жорсткі. М'якоть м'яка, водяниста, кремова, з типовим приємним запахом, в ніжці - волокниста. Споровий порошок кремово-білого кольору. Спори еліпсоїдальні, довжиною 8 мкм. Чисту міцеліальну культуру штаму F-1105 підтримують на агаризованому незахміленому пивному суслі (4° по Баллінгу) шляхом пересівів кожні 5-6 місяців. Культурально-морфологічні ознаки. Для дослідження культурально-морфологічних ознак штам F-1105 культивували на агаризованому незахміленому пивному суслі і картопляно-глюкозному агарі в чашках Петрі, та на рідкому глюкозо-пептонному живильному середовищі в поверхневій та глибинній культурі. На агаризованому середовищі міцелій розповсюджується рівномірно. Субстратні і повітряні гіфи розвиваються одночасно. Краще розвинуті повітряні гіфи. Колонія гриба має круглу форму, більш щільна в центрі. Колір молодої колонії сніжно-білий, з віком, на 7-12 добу, починаючи з центра колонії, забарвлюється до світло-жовтого, жовтувато-охряного, а потім (на 20-25 добу) до світло-бурого кольору. Субстрат не забарвлює. Текстура міцелію вовняна, висота повітряних гіф становить близько 3 мм. На застосованих для культивування живильних середовищах, міцелій має специфічний грибний запах. Утворює примордії коричневого кольору, та потім, плодові тіла спочатку в центрі, а з часом по всій поверхні колонії. На рідкому середовищі в поверхневій культурі через 5-8 діб утворюється повстяна міцеліальна плівка з грибним ароматом. З часом занурений міцелій займає весь об'єм середовища, висота повітряного міцелію може доходити до 3 мм. Зміна забарвлення повітряного міцелію від білого до світло-жовтого відбувається протягом 7-10 діб, світлоохряного - протягом 14-25 діб. За умов тривалого культивування можуть утворюватися примордії. Під час ферментації в глибинній культурі штам утворює пелети - стабільні сферичні агрегати, що складаються з розгалужених переплетених гіф. Розмір пелетів становить 1-8 мм залежно від терміну культивування, колір - жовтувато-білий. По краю пелетів відходять радіальні міцеліальні тяжі різного розміру. Окрім пелетів, в незначній кількості траплялися також вільні філаменти та невеликі шматочки міцелію неправильної форми. Мікроскопічні дослідження свідчать, що гіфи гриба гілчасті, звивисті, з початку їх розгалуження дихотомічне, вони тісно сплітаються між собою. Добре спостерігаються стінки і багаточисельні перегородки гіф. Перегородки утворюються як в місцях появи пряжок, так і між клітинами без пряжок, стінки незабарвлені. Апекси характеризуються гомогенною структурою протоплазми. Ширина гіф становить 6-9 мкм, довжина клітин - від 20 до 80 мкм і більше. З часом, у віці 5 діб і більше, в клітинах міцелію з'являються вакуолі та жирові включення. Фізіолого-біохімічні ознаки. Аероб. Росте при температурі 22-26 °C. Оптимум рН живильного середовища 6,2-6,5 од. За інтенсивністю росту та біосинтетичними показниками, найкращими джерелами вуглецевого живлення є глюкоза, рафіноза, сахароза, ксилоза, мальтоза, лактоза, крохмаль, целюлоза, лігнін. Відношення до джерел азоту: для росту використовує пептон, аспарагінову та глютамінову кислоти, сечовину, амонійний та нітратний азот. Приклад конкретного виконання. В цьому прикладі описується скринінгове культивування 9 штамів Flammulina velutipes, зокрема F-1105, і визначення ростових показників та інтенсивності процесів ПОЛ в міцелії та культуральному фільтраті (КФ). Для визначення ростових показників та інтенсивності ПОЛ, штами культивують глибинним методом на глюкозо-пептонному середовищі (ГПС) об'ємом 50 мл. Готують ГПС наступного складу, г/л [6]: глюкоза 10,0 пептон 3,0 КН2РО4 0,6 К2НРО4 0,4 MgSO4∙7H2O 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4∙7H2O 0,001 дистильована вода до 1 літра. Характеристики ГПС наступні: співвідношення C:N дорівнює 13:1, а рН - 6,70 од. 2 UA 76863 U 5 10 15 20 Підготовлене живильне середовище розливають по 50 мл в колби ємністю 250 мл та стерилізують в автоклаві при 126±2 °C протягом 45 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації складає 6,61 од. Як інокулюм використовують чисту 7-ми денну глибинну міцеліальну культуру штаму F-1105, вирощену на ГПС. Контроль чистоти інокулюму проводять за допомогою світлового мікроскопу, наприклад XS-5520 MICROmed. Розглядають септований міцелій, виявляють пряжки, констатують відсутність бактеріальних клітин. Інокуляцію здійснюють асептично шляхом внесення 5 мл посівної культури за допомогою стерильної піпетки. Термін культивування складає 6 діб при оптимальній для росту штаму F.velutipes F-1105 температурі 25 °C на лабораторній качалці зі зворотно-поступальним рухом з частотою 120 коливань за хвилину. Оптимальний режим культивування визначено експериментально. Наприкінці ферментації міцелій відділяють від культуральної рідини, отримуючи таким чином культуральний фільтрат. Водневий показник культурального фільтрату встановлюють потенціометричним методом, наприклад на рН-метрі "рН-150МИ". Міцелій промивають дистильованою водою. Вимірюють концентрацію абсолютно сухої біомаси міцелію ваговим методом. Для цього міцелій висушують у відкаліброваних боксах при 105 °C до постійної маси та зважують. Інтенсивність процесів ліпідної пероксидації в водній витяжці гомогенізованого міцелію (МГ) та КФ визначають за вмістом продуктів ПОЛ, активних до тіобарбітурової кислоти (ТБК-АП), з використанням модифікації методу [7]. Досліди проводять у трикратній повторності. Отримані експериментальні дані обробляють з використанням Microsoft Excel та пакету програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Таблиця Накопичення біомаси та вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів в міцелії і культуральному фільтраті штамів Flammulina velutipes Штам F-03 F-102 F-104 F-107 F-11 F-1105 F-112 F-204 F-610 Біомаса,г/л рН КФ 1,52±0,20 3,52±0,12 3,26±0,26 3,04±0,11 3,13±0,14 2,58±0,16 3,62±0,09 3,96±0,09 3,39±0,30 6,35±0,16 6,16±0,02 5,85±0,01 6,08±0,01 6,36±0,03 6,41±0,03 6,12±0,02 5,88±0,04 6,24±0,01 ТБК-АП, нмоль/ г (мл) Міцелій КФ 227,70±23,63 0,97±0,12 134,70±12,52 0,94±0,07 142,13±13,40 0,96±0,12 130,45±8,19 0,86±0,06 59,81±3,19 0,81±0,02 95,80±5,96 1,11±0,05 115,24±8,14 0,88±0,13 126,10±9,91 0,79±0,11 114,20±10,00 0,87±0,06 25 30 35 40 Таким чином, запропонований штам F-1105 їстівного базидіального гриба Flammulina velutipes (Curtis) Singer є високоактивним продуцентом екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів і може бути використаний в промисловому грибівництві, екології та для деструкції відходів різних галузей промисловості і сільського господарства. Штам F-1105 Flammulina velutipes (Curtis) Singer зберігається в колекції культур шапинкових грибів кафедри фізіології рослин Донецького національного університету. Джерела інформації: 1. Бисько Н.А. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре / Н.А. Бисько, А.С. Бухало, С.П. Вассер и др. - К.: Наук, думка, 1988. - 144 с. 2. Капич А.Н. Определение антиоксидантной активности на модели перекисного окисления линолевой кислоты, инициированного грибной марганец пероксидазой / А.Н. Капич, Т.В. Корнейчик // Успехи медицинской микологии, 2007. - Т. 9. - С. 162-164. 3. Капич А.Н. Содержание в грибах продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой / А.Н. Капич, Т.С. Гвоздкова // Микология и фитопатология, 1998. - Т. 32, вып. 4. - С. 30-36. 4. Капич А.Н. Сопряжение перекисного окисления липидов с деградацией лигнина у дереворазрушающих базидиомицетов /А.Н. Капич // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр., 2011. - Т. 3. - С.316-335. 3 UA 76863 U 5 10 15 20 5. Патент 12384 України. Спосіб визначення стресового стану базидіоміцетів та екологічного стану місця їх зростання за вмістом продуктів перекисного окиснення ліпідів / Федотов О.В. Заявка № u 2005 04732, від 20.05.2005, кл. С04В35/00, A01G7/00, С30В28/00, А01Н3/00, Бюл. № 2, від 15.02.06. 6. Патент 57945 України. Спосіб мікотестування забруднення навколишнього середовища фенолом / Федотов О.В., Перцевой М.С. Заявка № U201009019, від 19.07.2010, МПК (2011.01), кл. A01G7/00, А01Н15/00 Бюл. № 6, від 25.03.2011. (прототип). 7. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили / Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68. 8. Hammel К. Е. Reactive oxygen species as agents of wood decay by fungi / K.E. Hammel, A.N. Kapich, K.A.Jr. Jensen, Z.C. Ryan // Enzyme and Microbial Technology.- 2002. - 30. - P. 445-453. 9. Pozdnyakova N.N. Influence of PAHs on ligninolytic enzymes of the fungus Pleurotus ostreatus Dl / N.N. Pozdnyakova, S.V. Nikiforova, O.V. Turkovskaya // Cent. Eur. J. Biol.-2010. - № 5 (1). - P. 83-94. 10. Winquist E. Production of lignin modifying enzymes on industrial waste material by solid-state cultivation of fungi / E. Winquist, U. Moilanen, A. Mettala, M. Leisola, A. Hattaka // Biochem. Eng. J. 2008. - 42. - P. 128-132. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-l105 - продуцент екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4