Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета pleurotus eryngii (dc.) quel. p-er – продуцент екзопродуктів перекисного окиснення ліпідів

Реферат: UA 78482 U UA 78482 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікології та біотехнології і може бути використана в промисловому грибівництві, екології та для деструкції відходів різних галузей промисловості і сільського господарства. Здатність до глибокого розкладання і засвоєння лігноцелюлозного комплексу деревини описана для грибів різних таксономічного груп, але найбільш активними деструкторами є базидіоміцети білої гнилі (лігнотрофи). Позаклітинні ферментні системи цих грибів здатні до ефективної деструкції широко розповсюдженого і дуже стійкого біополімеру - лігніну. Встановлено, що процес його біодеградації залежить від активації кисню і генерації перекисних ліпідних радикалів, які спричинюють спонтанні ланцюгові реакції за вільнорадикальним механізмом [2, 4, 8, 9, 10]. Ці вільнорадикальні реакції носять неспецифічний характер, тому можливим є залучення ксилотрофних базидіоміцетів до процесів розкладання лігноцелюлозних відходів деревообробної, харчової промисловості та сільського господарства, а також біоремедіації забруднених середовищ [10, 11]. Отже, існує необхідність пошуку штамів дереворуйнівних базидіоміцетів, які мають високий рівень процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) в культуральній рідині, та водночас є стійкими до негативного впливу перекисних радикалів і ефективно нарощують біомасу. Відомі результати дослідження росту штаму Pleurotus eryngii на агаризованому живильному середовищі для робіт з природними та гібридними штамами їстівних і лікарських базидіоміцетів, що містить агар-агар, воду, причому середовище додатково містить відвар бульб топінамбура i відвар повітряно-сухих суцвіть конюшини рожевої [6]. Не проводилися дослідження процесів ПОЛ досліджуваних штамів при культивуванні на розробленому живильному середовищі. Відомі результати дослідження процесів активації кисню при окисленні лігнін-похідних гідрохінонів 2-метокси-1,4-бензогідрохінону і 2,6-діметокси-1,4-бензогідрохінону лакказою Pleurotus eryngii. Для отримання лаккази штам-продуцент вирощується в культурі на глюкозоамонійному середовищі [8]. Не проводилося визначення вмісту продуктів ПОЛ в міцелії та культуральній рідині P. eryngii. Відомі результати порівняльного дослідження вмісту в грибах, зокрема, роду Pleurotus, продуктів ПОЛ. Штами ксилотрофних базидіоміцетів культивують в глибинній культурі на глюкозо-пептонному середовищі. Надаються дані щодо вмісту продуктів ПОЛ в гомогенатах міцелію і ліпідах грибів різних систематичних, екологічних і фізіологічних груп [3]. Не представлено даних про вміст продуктів ПОЛ в культуральній рідині штамів Pleurotus eryngii, результати, отримані щодо інших штамів роду Pleurotus, не є порівнюваними через використання відмінної модифікації методу. Найбільш близьким за технічною суттю і досяжності результату є штам Pleurotus ostreatus P01, залучений до способу визначення стресового стану базидіоміцетів та екологічного стану місця їх зростання за вмістом продуктів перекисного окиснення ліпідів, що включає визначення вмісту продуктів ПОЛ, активних до тiобарбітурової кислоти в культурах грибів, причому визначення їх вмісту проводять в дикорослих плодових тілах базидіоміцетів із різних за екологічними умовами місць зростання та міцелiальних культурах цих грибів при штучному культивуванні в оптимальних умовах і при дії температурних стресорів [5]. Було застосовано модифікацію методу визначення продуктів ПОЛ, що не дозволяє порівняти отримані дані з іншими дослідженнями, не досліджувалася інтенсивність ПОЛ при глибинному методі культивування, а використання методу поверхневого культивування не є ефективним в біотехнологічних процесах, не досліджувалися штами Pleurotus eryngii. В основу корисної моделі поставлено задачу отримання нового штаму соматичних структур ксилотрофного базидіоміцету Pleurotus eryngii (DC.) Quél., який відрізняється від прототипу за видовою приналежністю та високою інтенсивністю процесів ПОЛ в культуральній рідині, отже є продуцентом екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів. Поставлена задача вирішується тим, що інтродукований штам Р-еr гриба Pleurotus eryngii (DC.) Quél., згідно з корисною моделлю, має високу інтенсивність процесів ПОЛ в культуральній рідині при глибинному культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 25,0 °C протягом 6-ти діб на лабораторній качалці. Інтродукований штам Ρ-er макроскопічного гриба Pleurotus eryngii (DC.) Quél. має наступні характеристики. Систематичне положення об'єкта дослідження. Царство: Fungi Відділ: Вasidiomycota Підвідділ: Agaricomycotina Клас: Agaricomycetes 1 UA 78482 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Підклас: Agaricomycetidae Порядок: Agaricales Родина: Pleurotaceae Рід: Pleurotus Вид: Pleurotus eryngii Штам P-er Pleurotus eryngii отримано з ТОВ "Укрміцелiй" у 1997 році. Чисту міцеліальну культуру штаму Ρ-er підтримують на агаризованому незахміленому пивному суслі (4° по Баллінгу) [1] шляхом пересівів кожні 5-6 місяців. Культурально-морфологічнi ознаки. Для дослідження культурально-морфологічних ознак штам Р-еr культивували на агаризованому незахміленому пивному суслі і картопляно-глюкозному агарі в чашках Петрi, та на рідкому глюкозо-пептонному живильному середовищі в поверхневій та глибинній культурі. На агаризованому середовищі міцелій розповсюджується рівномірно. Субстратні і повітряні гіфи розвиваються одночасно. Краще розвинуті повітряні гіфи. Колонія гриба має круглу форму, більш щільна в центрі. Колір молодої колонії сніжно-білий, з віком, приблизно через 20-30 діб, починаючи з центра колонії, набуває світло-охряного відтінку. Субстрат не забарвлює. Міцелій має м'яко-ворсисту поверхню, висота повітряних гіф сягає 5-7 мм. На застосованих для культивування живильних середовищах міцелій має характерний запах. Утворює примордії світло-охряного кольору та, згодом, плодові тіла на агаризованих живильних середовищах як у пробірках, так і в чашках Петрі ближче до краю колонії. На рідкому середовищі в поверхневій культурі через 5-8 діб утворюється міцеліальна плівка. З часом занурений міцелій займає весь об'єм середовища, висота повітряного міцелію може доходити до 5 мм. Через 25-35 діб культивування на плівці повітряного міцелію з'являються світло-охряні зони, але примордії не утворюються. У цей же час культуральна рідина набуває жовтувато-помаранчевого відтінку. Під час росту в глибинній культурі утворюються сферичні міцеліальні агрегати, що складаються з розгалужених переплетених гіф - пелети. Їх розмір становить 3-8 мм залежно від терміну культивування, співвідношення об'єму живильного середовища та інокулюму, подрібненості останнього. Поверхня пелетів рівна, колір - білий. Мікроскопічні дослідження свідчать, що гіфи гриба гілчасті, звивисті, з початку їх розгалуження неупорядковане. Гіфи тісно сплітаються між собою. Добре спостерігаються стінки і багаточисельні перегородки гіф. Перегородки утворюються як в місцях появи пряжок, так і між клітинами без пряжок, стінки незабарвленi. Апекси характеризуються гомогенною структурою протоплазми. З часом, у віці 5 діб і більше, в клітинах міцелію з'являються вакуолі та жирові включення. Приклад конкретного виконання. В цьому прикладі описується скринінгове культивування 18 штамів роду Pleurotus, зокрема штам Р-еr Pleurotus eryngii, і визначення ростових показників та інтенсивності процесів ПОЛ в міцелії та культуральному фільтраті (КФ). Для визначення ростових показників та інтенсивності ПОЛ штами культивують глибинним методом на глюкозо-пептонному середовищі (ГПС) об'ємом 50 мл. Готують ГПС наступного складу, г/ л [5]: глюкоза 10,0 пептон 3,0 КН2РО4 0,6 К2НРО4 0,4 0,5 MgSO47Н2О СаСl2 0,05 0,001 ZnSO47Н2О дистильована вода до 1 літра. Характеристики ГПС наступні: співвідношення C:N дорівнює 13:1, а рН - 6,72 од. Підготовлене живильне середовище розливають по 50 мл в колби ємністю 250 мл та стерилізують в автоклаві при 126±2 °C протягом 45 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації складає 6,64 од. Як інокулюм використовують чисту 7-ми денну глибинну міцеліальну культуру штаму Ρ-er, вирощену на ГПС. Контроль чистоти інокулюму проводять за допомогою світлового мікроскопа, наприклад XS-5520 MICROmed. Розглядають септований міцелій, виявляють пряжки, констатують відсутність бактеріальних клітин. Інокуляцію здійснюють асептично шляхом внесення 5 мл посівної культури за допомогою стерильної піпетки. 2 UA 78482 U 5 10 15 Термін культивування складає 6 діб при температурі 25 °C на лабораторній качалці зі зворотно-поступальним рухом з частотою 120 коливань за хвилину. Оптимальний режим культивування визначено експериментально. Наприкінці ферментації міцелій відділяють від культуральної рідини, отримуючи таким чином культуральний фільтрат. Водневий показник культурального фільтрату встановлюють потенціометричним методом, наприклад на рН-метрі "рН-150МИ". Міцелій промивають дистильованою водою. Вимірюють концентрацію абсолютно сухої біомаси міцелію ваговим методом. Для цього міцелій висушують у відкаліброваних бюксах при 105 °C до постійної маси та зважують. Інтенсивність процесів ліпідної пероксидації в водній витяжці гомогенізованого міцелію (МГ) та КФ визначають за вмістом продуктів ПОЛ, активних до тіобарбітурової кислоти (ТБК-АП), з використанням модифікації методу [7]. Досліди проводять у трикратній повторності. Отримані експериментальні дані обробляють з використанням Microsoft Excel та пакету програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Таблиця Накопичення біомаси та вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів в міцелії і культуральному фільтраті штамів роду Pleurotus Вид Штам Біомаса, г/л pH КФ P.citrinopileatus P. eryngu P-citr P-er P-01 P-081 P-6v P-91 P-94 P-998 P-089 Ρ-105 Ρ-12κ Ρ-191 Ρ-203 Ρ-206 Ρ-209 Ρ-210 Ρ-4κ Р-кл 1,36±0,12 3,65±0,22 3,00±0,08 2,30±0,02 2,49±0,04 1,31±0,10 2,19±0,04 1,78±0,04 3,51±0,24 2,65±0,13 1,63±0,10 3,79±0,11 2,53±0,16 2,80±0,19 1,41±0,06 1,35±0,10 1,82±0,08 1,70±0,08 6,54 6,29 6,66 6,88 6,59 7,09 6,58 6,63 6,74 6,82 6,64 6,68 6,95 6,96 6,75 6,50 6,61 6,76 P. ostreatus ТБК-АП, нмоль/ г (мл) Міцелій КФ 91,69±5,32 134,77±10,07 92,00±3,33 77,32±5,74 62,00±4,90 96,30±6,02 73,52±6,24 78,92±5,95 85,13±6,65 73,82±0,76 73,62±3,26 68,60±5,33 78,88±9,90 72,75±6,61 79,47±6,89 81,45±5,63 64,04±4,23 79,97±8,88 0,88±0,02 1,14±0,12 0,97±0,03 0,87±0,05 0,90±0,01 0,89±0,09 0,89±0,05 0,97±0,08 1,00±0,03 0,94±0,04 0,86±0,03 0,88±0,02 0,93±0,06 0,88±0,04 0,84±0,04 0,87±0,05 0,81±0,05 0,85±0,05 Примітка: ρ0,05 20 25 Таким чином, запропонований штам P-er їстівного базидіального гриба Pleurotus eryngii (DC.) Quél. є високоактивним продуцентом екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів і може бути використаний в промисловому грибівництві, екології та для деструкції відходів різних галузей промисловості і сільського господарства. Штам P-er Pleurotus eryngii (DC.) Quél. зберігається в колекції культур шапинкових грибів кафедри фізіології рослин Донецького національного університету. Джерела інформації:, які використані при складанні заявки: 1. Бисько Н.А. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре / Н.А. Бисько, А.С. Бухало, С.П. Вассер и др. - Киев: Наук, думка, 1988.-144 с. 2. Капич А.Н. Определение антиоксидантной активности на модели перекисного окисления линолевой кислоты, инициированного грибной марганец пероксидазой/ А.Н. Капич, Т.В. Корнейчик// Успехи медицинской микологии.-2007. - Т. 9. - С. 162-164. 3 UA 78482 U 5 10 15 20 25 30 3. Капич А.Н. Содержание в грибах продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой/ А.Н. Капич, Т.С. Гвоздкова// Микология и фитопатология.-1998. - Т. 32, вып. 4. - С. 30-36. 4. Капич А.Н. Сопряжение перекисного окисления липидов с деградацией лигнина у дереворазрушающих базидиомицетов/ А.Н. Капич// Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр.-2011. - Т. 3.-316-335. 5. Патент 12384 України. Спосіб визначення стресового стану базидіоміцетів та екологічного стану місця їх зростання за вмістом продуктів перекисного окиснення ліпідів/ Федотов О.В. Заявка № u 2005 04732, від 20.05.2005, кл. С04В35/00, A01G7/00, С30В28/00, А01НЗ/00, Бюл. № 2, від 15.02.06. (прототип). 6. Патент 48331 України. Живильне середовище для робіт з природними та гібридними штамами їстівних і лікарських базидіоміцетів/ Ткаченко Н.П., Сичов П.А./ Гимофеев О.А. Заявка № u200910515, від 16.10.2009, МПК (2009): C12N 1/14 (2006.01), A01G 31/00 Бюл. № 5, від 10.03.2010. 7. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты/ И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили/ Современные методы в биохимии. -М.: Медицина, 1977. - С. 66-68. 8. Guillen F. Oxygen activation during oxidation of methoxyhydroquinones by laccase from Pleurotus eryngii/ F. Guillen, C. Munoz, V.G. Toribio, A.T. Martinez, M. J. Martinez// Appl Environ Microbiol.-2000.-66. - P. 170-175. 9. Hammel K. E. Reactive oxygen species as agents of wood decay by fungi/ K.E. Hammel, A.N. Kapich, K.A.Jr. Jensen, Z.C. Ryan// Enzyme and Microbial Technology.-2002.-30. - P. 445-453. 10. Pozdnyakova N.N. Influence of PAHs on ligninolytic enzymes of the fungus Pleurotus ostreatus D1/ N.N. Pozdnyakova, S.V. Nikiforova, O.V. Turkovskaya// Cent. Eur. J. Biol.-2010. - № 5 (1). - P. 83-94. 11. Winquist E. Production of Hgnin modifying enzymes on industrial waste material by solid-state cultivation of fungi/ E. Winquist, U. Moilanen, A. Mettala, M. Leisola, A. Hattaka// Biochem. Eng. J.2008.-42. - P. 128-132. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета Pleurotus eryngii (DC.) Quél. P-er продуцент екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4