Спосіб одержання водорозчинного b-глюкану

Реферат: UA 83594 U UA 83594 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, зокрема до технології одержання водорозчинних фрагментів (1→3/1→6)-β-D-глюкану клітинних стінок дріжджів Saccharomyces cerevisiae, який має імуномодулюючі, протипухлинні та радіопротекторні властивості. Бета-глюкан активує клітини системи мононуклеарних фагоцитів як прямим шляхом, так і через систему комплементу. Продукти активації обох систем, діючи через відповідні рецептори, втягують у запально-імунний процес все більшу кількість мононуклеарних фагоцитів, поліморфноядерних лейкоцитів, лімфоцитів, тучних клітин і тромбоцитів. Ці продукти забезпечують мобілізацію, кооперацію і регуляцію клітинних процесів імунної відповіді (McCarthy К., Musson R.A, Henson P.M: Protein synthesis-dependent and protein synthesisindependent secretion of lysosomal hydrolases from rabbit and human macrophages. J Reticuloendothel Soc; 1982 Feb; 31(2):131-44). Визначальну роль у взаємодії глюканів з елементами імунної системи відіграє конформація молекули в момент впливу. Фізіологічна активність β-глюканів визначається багатьма факторами: типом та конфігурацією зв'язків між залишками моносахаридів, розгалуженістю та конформацією макромолекули, ступенем її полімеризації; розчинністю у воді, молекулярною масою полісахариду та ін. Встановлено, що фізіологічна дія нерозчинних глюканів значно менша, ніж розчинних (Беседнова, Н. Н. Иммунотропные свойства (1→3), (1→6)-β-D-глюканов / Н. Н. Беседнова, Л. А. Иванушко, Т. Н. Звягинцева Л. А. Елякова // Антибиотики и химиотерапия.-2000. - № 5. - С. 37-44). Глюкани дріжджів мають розгалужену структуру, основою якої є кор, що складається з β-Dглюкопіранозних залишків, зв'язаних (1→3) глікозидними зв'язками. До положень О-6 моносахаридних залишків кору приєднуються бічні відгалуження, розмір яких варіює. Здатність глюканів розчинятися у воді можна підвищити шляхом їх хімічної модифікації. В літературі наведено дані щодо отримання та визначення властивостей їх сульфатованих, фосфатованих та інших похідних, які здатні розчинятися у воді. Відомий спосіб одержання водорозчинного фосфатованого глюкану дріжджів (Патент США № 4739046), який передбачає розчинення частинок глюкану в сильному полярному розчиннику, що містить сильний хаотропний агент і фосфатну кислоту. Цей спосіб передбачає обробку водонерозчинного глюкану дріжджів Saccharomyces cerevisiae розчинами диметилсульфоксидом (DMSO) чи сечовиною концентрацією 4-12 М. Суспензію перемішують, суміш підігрівають до Т = 50-150 °C та поступово додають фосфатну кислоту. Обробку проводять впродовж 1-12 годин при Т = 100 °C, вихід при цьому розчинного глюкану складає 7090 %. Ступінь фосфатованих груп - 1,48 % - 2,23 %. Однак, отриманий таким чином водорозчинний глюкан змінює конформацію молекули, що, в свою чергу, негативно впливає на біологічну активність полісахариду (Chen, Jiezhong. Medicinal importance of fungal β-(1→3), (1→6)-glucans / Jiezhong Chen, Robert Seviour // Mycological research.-2007. - P. 635-652). Відомий спосіб вирішує задачу, одержання водорозчинного глюкану шляхом хімічного гідролізу, а тому не може бути вибраний прототипом. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити ефективний ферментативний спосіб одержання низькомолекулярного водорозчинного β-(1→3/1→6)-D-глюкану клітинних стінок дріжджів Saccharomyces cerevisiae. Поставлена задача вирішується тим, що включає обробку водонерозчинного β-глюкану клітинних стінок хлібопекарських дріжджів Saccharomyces cerevisiae мультиферментним 3 препаратом Rovabio Excel АР при концентрації ферменту у розчині 0,25-0,5 мг/см протягом 2472 годин і співвідношенні фермент:субстрат 1:(15-45), після гідролізу суміш кип'ятять 15 хвилин, супернатан відокремлюють і сушать. Режими деструкції макромолекул водонерозчинного глюкану підібрані експериментально. Отримані препарати являють собою порошок білого кольору. Вихід водорозчинних продуктів деструкції глюкану коливається у діапазоні 40-90 % маси вихідного полісахариду. Результати молекулярно-масового розподілу свідчать, що отримані препарати являють собою гетерогенну за молекулярною масою суміш, у якій присутні фрагменти зі ступенем полімеризації у досить широкому інтервалі значень, а вміст фракції з Мr 1-30 кДа коливається у діапазоні 15-60 % сухої маси глюкану клітинних стінок дріжджів. Заявлений спосіб дає можливість одержати водорозчинний низькомолекулярний β-глюкан дріжджів Saccharomyces cerevisiae, який має більшу фізіологічну активність, ніж водонерозчинний чи модифікований розчинний, отриманий хімічним способом, завдяки розчинності у воді та відсутністю зміни конформації молекули полісахариду. Спосіб одержання препарату здійснюють у наступному порядку. Водонерозчинний β-глюкан клітинних стінок хлібопекарських дріжджів Saccharomyces cerevisiae обробляють 1 UA 83594 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мультиферментним препаратом Rovabio Excel АР (АВЕНТІС, Франція), що має переважно ендо1,4-β-ксиланазну та ендо-1,3(4)-β-глюканазну активності. Ферментний препарат попередньо очищають від супутніх йому вуглеводних речовин. Ферментативний гідроліз проводять при Т = 3 37 °C і рН 6. Варіюючи концентрацією ферменту у розчині (0,25-0,5 мг/см ), тривалістю ферментолізу (24-72 годин) і співвідношенням фермент:субстрат (E:S-1:(15-45). Після закінчення гідролізу суміш кип'ятять впродовж 15 хвилин для інактивації ферменту, центрифугують при 8000 об./год. 15 хвилин, та супернатан висушують при температурі 50 °C. Отриманий препарат являє собою порошок білого кольору. Приклад № 1. При одержанні препарату, який заявляється, 100 мг водонерозчинного β-глюкану заливають 3 26,4 см ферментного препарату Rovabio Excel АР (АВЕНТІС, Франція) концентрацією 0,25 3 мг/см та проводять гідроліз при Т = 37 °C і рН 6 впродовж 24 годин. Після закінчення гідролізу суміш кип'ятять впродовж 15 хвилин для інактивації ферменту, центрифугують при 8000 об./год. 15 хвилин, та супернатан висушують при температурі 50 °C. Вихід водорозчинних продуктів деструкції глюкану та молекулярно-масовий розподіл представлено у таблицях 1 та 2 відповідно. Приклад № 2. При одержанні препарату, який заявляється, 100 мг водонерозчинного β-глюкану заливають 3 13,3 см ферментного препарату Rovabio Excel АР (АВЕНТІС, Франція) концентрацією 0,25 3 мг/см та проводять гідроліз при Т = 37 °C і рН 6 впродовж 24 годин. Після закінчення гідролізу суміш кип'ятять впродовж 15 хвилин для інактивації ферменту, центрифугують при 8000 об./год. 15 хвилин, та супернатан висушують при температурі 50 °C. Вихід водорозчинних продуктів деструкції глюкану та молекулярно-масовий розподіл представлено у таблицях 1 та 2 відповідно. Приклад № 3. При одержанні препарату, який заявляється, 100 мг водонерозчинного β-глюкану заливають 3 26,4 см ферментного препарату Rovabio Excel АР (АВЕНТІС, Франція) концентрацією 0,25 3 мг/см та проводять гідроліз при Т = 37 °C і рН 6 впродовж 48 годин. Після закінчення гідролізу суміш кип'ятять впродовж 15 хвилин для інактивації ферменту, центрифугують при 8000 об./год. 15 хвилин, та супернатан висушують при температурі 50 °C. Вихід водорозчинних продуктів деструкції глюкану та молекулярно-масовий розподіл представлено у таблицях 1 та 2 відповідно. Приклад № 4. При одержанні препарату, який заявляється, 100 мг водонерозчинного β-глюкану заливають 3 13,3 см ферментного препарату Rovabio Excel АР (АВЕНТІС, Франція) концентрацією 0,25 3 мг/см та проводять гідроліз при Т = 37 °C і рН 6 впродовж 48 годин. Після закінчення гідролізу суміш кип'ятять впродовж 15 хвилин для інактивації ферменту, центрифугують при 8000 об./год. 15 хвилин, та супернатан висушують при температурі 50 °C. Вихід водорозчинних продуктів деструкції глюкану та молекулярно-масовий розподіл представлено у таблицях 1 та 2 відповідно. Приклад № 5. При одержанні препарату, який заявляється, 100 мг водонерозчинного β-глюкану заливають 3 26,4 см ферментного препарату Rovabio Excel АР (АВЕНТІС, Франція) концентрацією 0,25 3 мг/см та проводять гідроліз при T=37 °C і рН 6 впродовж 72 годин. Після закінчення гідролізу суміш кип'ятять впродовж 15 хвилин для інактивації ферменту, центрифугують при 8000 об./год. 15 хвилин, та супернатан висушують при температурі 50 °C. Вихід водорозчинних продуктів деструкції глюкану та молекулярно-масовий розподіл представлено у таблицях 1 та 2 відповідно. Приклад № 6. При одержанні препарату, який заявляється, 100 мг водонерозчинного β-глюкану заливають 3 13,3 см ферментного препарату Rovabio Excel АР (АВЕНТІС, Франція) концентрацією 0,25 3 мг/см та проводять гідроліз при Т = 37 °C і рН 6 впродовж 72 годин. Після закінчення гідролізу суміш кип'ятять впродовж 15 хвилин для інактивації ферменту, центрифугують при 8000 об./год. 15 хвилин, та супернатан висушують при температурі 50 °C. Вихід водорозчинних продуктів деструкції глюкану та молекулярно-масовий розподіл представлено у таблицях 1 та 2 відповідно. Приклад № 7. При одержанні препарату, який заявляється, 100 мг водонерозчинного β-глюкану заливають 3 3 4,4 см ферментного препарату Rovabio Excel АР (АВЕНТІС, Франція) концентрацією 0,5 мг/см та проводять гідроліз при Т = 37 °C і рН 6 впродовж 24 годин. Після закінчення гідролізу суміш 2 UA 83594 U 5 10 15 20 25 кип'ятять впродовж 15 хвилин для інактивації ферменту, центрифугують при 8000 об./год. 15 хвилин, та супернатан висушують при температурі 50 °C. Вихід водорозчинних продуктів деструкції глюкану та молекулярно-масовий розподіл представлено у таблицях 1та 2 відповідно. Приклад № 8. При одержанні препарату, який заявляється, 100 мг водонерозчинного β-глюкану заливають 3 3 4,4 см ферментного препарату Rovabio Excel АР (АВЕНТІС, Франція) концентрацією 0,5 мг/см та проводять гідроліз при Т = 37 °C і рН 6 впродовж 48 годин. Після закінчення гідролізу суміш кип'ятять впродовж 15 хвилин для інактивації ферменту, центрифугують при 8000 об./год. 15 хвилин, та супернатан висушують при температурі 50 °C. Вихід водорозчинних продуктів деструкції глюкану та молекулярно-масовий розподіл представлено у таблицях 1 та 2 відповідно. Приклад № 9. При одержанні препарату, який заявляється, 100 мг водонерозчинного β-глюкану заливають 3 3 13,3 см ферментного препарату Rovabio Excel АР (АВЕНТІС, Франція) концентрацією 0,5 мг/см та проводять гідроліз при Т = 37 °C і рН 6 впродовж 72 годин. Після закінчення гідролізу суміш кип'ятять впродовж 15 хвилин для інактивації ферменту, центрифугують при 8000 об./год. 15 хвилин, та супернатан висушують при температурі 50 °C. Вихід водорозчинних продуктів деструкції глюкану та молекулярно-масовий розподіл представлено у таблицях 1 та 2 відповідно. Приклад № 10. При одержанні препарату, який заявляється, 100 мг водонерозчинного β-глюкану заливають 3 3 6,7 см ферментного препарату Rovabio Excel АР (АВЕНТІС, Франція) концентрацією 0,5 мг/см та проводять гідроліз при Т = 37 °C і рН 6 впродовж 72 годин. Після закінчення гідролізу суміш кип'ятять впродовж 15 хвилин для інактивації ферменту, центрифугують при 8000 об./год. 15 хвилин, та супернатан висушують при температурі 50 °C. Вихід водорозчинних продуктів деструкції глюкану та молекулярно-масовий розподіл представлено у таблицях 1 та 2 відповідно. Таблиця 1 Вихід водорозчинних вуглеводів, % маси вихідного полісахариду за прикладами № 1-10 № зразка 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Концентрація Е, 3 мг/см Тривалість ферментолізу, год. 1:15 1:30 1:15 1:30 1:15 1:30 1:45 1:45 1:15 1:30 24 0,25 48 72 0,5 Співвідношення E:S 24 48 72 30 3 Вихід водорозчинних вуглеводів, % 75,1±1,1 74,7±1,1 89,3±1,1 86,1±1,1 90,3±1,1 88,1±1,1 48,7±1,1 56,8±1,1 65,0±1,1 68,1±1,1 UA 83594 U Таблиця 2 Молекулярно-масовий розподіл водорозчинних продуктів ферментолізу, % співвідношення за прикладами № 1-10 № зразка 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 >30 37,0±0,5 31,9±0,5 31,7±0,5 21,2±0,5 15,7±0,5 21,5±0,5 15,7±0,5 15,7±0,5 17,4±0,5 13,5±0,5 Молекулярна маса, кДа 1-30 56,6±0,5 62,4±0,5 44,7±0,5 67,1±0,5 57,4±0,5 52,5±0,5 57,4±0,5 57,4±0,5 76,1±0,5 80,5±0,5