Спосіб таксономічної ідентифікації ентеробактерій

1. Спосіб таксономічної ідентифікації ентеробактерій на основі уніфікованої, стандартизованої та автоматизованої процедури аналізу результатів стандартних біохімічних тестів, який відрізняється тим, що за допомогою формалізованих процедур визначають тест-комплекси, специфічні для кожного представника родини Enterobacteriaceae, проводять частину стандартних біо хімічних тестів, результати яких аналізують на предмет наявності тест-комплексів, при цьому у випадку наявності тест-комплексів, специфічних для одного або переважно одного виду, ідентифікацію вважають завершеною; у випадку, коли присутні тесткомплекси різних ентеробактерій, проводять додаткові тести зі стандартного переліку та повторюють аналіз до тих пір, поки кількість тесткомплексів, характерних для одного виду, не перевищить 50%. 2. Спосіб за п. 1, в якому, при недостатній інформативності першої частини біохімічних тестів, добір оптимальних додаткових тестів здійснюється автоматизовано на основі комп'ютерного аналізу наявних фактичних даних та ступеня їх відповідності певним групам тест-комплексів окремих видів. (19) UA (21) a200613975 (22) 28.12.2006 (24) 25.11.2008 (46) 25.11.2008, Бюл.№ 22, 2008 р. (72) ДЕРКАЧ СВІТЛАНА АНДРІЇВН А, U A, КАЦ МАРК ДАВИДОВИЧ, U A, НОС АТЕНКО АЛА ІВАНІВНА, U A, ДАВИДЕНКО ОЛЕКСІЙ МАРКОВИЧ, U A, КУЧМА ІРИН А ЮРІЇВНА, U A, КРИЛОВА ІРИНА АН АТОЛІЇВН А, U A, ВОРОНКІНА ІРИНА АНАТОЛІЇВНА, U A, ВОЛКОВ ТАРАС ОЛЕКСАНДРОВИЧ, UA, ВОЛЯНСЬКИЙ АНДРІЙ ЮРІЙОВИЧ, U A, КОНДРАТЬЄВ АНДРІЙ ЮРІЙОВИЧ, U A (73) ДЕРКАЧ СВІТЛАНА АНДРІЇВН А, U A, КАЦ МАРК ДАВИДОВИЧ, U A, НОС АТЕНКО АЛА ІВАНІВНА, U A, ДАВИДЕНКО ОЛЕКСІЙ МАРКОВИЧ, U A, КУЧМА ІРИН А ЮРІЇВНА, U A, КРИЛОВА ІРИНА АН АТОЛІЇВН А, U A, ВОРОНКІНА ІРИНА АНАТОЛІЇВНА, U A, ВОЛКОВ ТАРАС ОЛЕКСАНДРОВИЧ, UA, ВОЛЯНСЬКИЙ АНДРІЙ ЮРІЙОВИЧ, U A, КОНДРАТЬЄВ АНДРІЙ ЮРІЙОВИЧ, UA, ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА АМН УКРАЇНИ, U A (56) Kasthuri V. et al.:"Comparison of Commercially Available Kits with Standard Methods for the detection of Coliforms and Escherichia coli in Foods" Applied and Environmental Microbiology, July 1996, p.2236-2243. Кац М.Д. "Алгоритм изобретения при решении технологических и научных задач" [он-лайн] [знайдено 2008-06-24] Знайдено із Інтернет Идентификация энтеробактерий и стафилококков. Информационные материалы. Научно-производственное объединение "Диагностические системы"- Нижний Новгород. - 2007. C2 2 (11) 1 3 84772 фізіологічних властивостей та невизначеністю таксономічного положення окремих представників сімейства, зумовлює відповідні складнощі з диференціацією близьких за своїми ознаками видів. Сучасні методи визначення видової приналежності мікроорганізмів на основі аналізу бактеріального геному (нуклеотидної послідовності 168рРНК, гомології ДНА, тощо [1,2]) є досить об'єктивними та високочутливими, але рівень собівартості дослідження залишає ці методи малодоступними для бюджетних установ, що здійснюють епідеміологічний моніторинг. Крім того, складність технології при недостатньому рівні кваліфікації персоналу зумовлює відповідний рівень хибнопозитивних та хибно-негативних результатів. Стандартний спосіб таксономічної ідентифікації ентеробактерій за фенотипічними ознаками передбачає проведення 49 біохімічних тестів, що дозволяють охарактеризувати фізіологічні та метаболічні особливості мікроорганізму. Отриману сукупність фенотипічних ознак аналізують шляхом візуального зіставлення з сукупностями ознак, характерними для кожного представника сімейства, наведеними в таблицях визначника бактерій Берджі [3]. До ознак, що збігаються з суттєвими ознаками рішення, яке патентується, належить застосування комплексу фенотипічних параметрів, зокрема результатів біохімічних та фізіологічних тестів зі стандартного переліку визначника Берджі. До факторів, що заважають вказаному аналогу забезпечити бажаний технічний результат можна віднести наступні моменти: (і) - існуючий рівень фенотипічної мінливості циркулюючих штамів далеко не завжди дозволяє однозначно інтерпретувати отримані результати; (іі) - за наявності розбіжності фактичного фенотипу досліджуваного штаму з наведеними у визначнику ознаками типових представників родини, лаборантом приймається суб'єктивне рішення, коректність якого в значній мірі залежить від досвіду та інтуїції виконавця. Крім того, звичайним для повсякденної лабораторної практики шляхом прискорення досить тривалої процедури ідентифікації є скорочення кількості тестів, що підвищує вірогідність отримання неоднозначних сполучень ознак. Для стандартизації процедури аналізу результатів біохімічних тестів в комерційних тестсистемах (MICRO-ID, mini API)[4] розроблені каталоги кодів, сконструйовані на основі бази даних, що включає тест на рухли вість та 15-20 біохімічних ознак представників сімейства зі стандартного переліку [5]. Каталог містить інформацію, щодо частоти їх позитивних та негативни х значень для кожного виду, згідно з визначником Берджі. Інформація розміщена у 4 графах: І - кодове число мікроорганізму; II - видова назва; III - абсолютна вірогідність видової ідентифікації; IV - відносна вірогідність видової ідентифікації (при співпадінні кодових чисел). Урахування результатів біохімічного тестування здійснюють з використанням кодової картки, де тести поділені на 7 груп (по З тести в кожній групі) та кожному тесту присвоєне цифрове значення (4, 2, 1). При заповненні кодової картки результат тесту, в разі позитивної реак 4 ції, позначається відповідним йому цифровим значенням (4, 2, 1), при негативній реакції значення кожного тесту дорівнює нулю. С ума цифрових значень в кожному триплеті є кодовим числом мікроорганізму. Якщо кодове число виділеної культури відсутнє в каталозі кодів - досліджуваний штам має розглядатися як не ідентифікований. Якщо кодове число ідентифікованої культури відповідає одночасно кільком видам, - за результат ідентифікації обирають вид, що має найбільше значення показника відносної вірогідності, вказаної в каталозі. Каталоги кодів придатні також і для аналізу даних, отриманих за допомогою стандартних диференціально-діагностичних середовищ за умови, що добір та послідовність урахування результатів тестів аналогічна таким у кодовій картці (та, відповідно, у тест системі, до якої розроблений каталог). Для методу, що передбачає ідентифікацію ентеробактерій за фенотюгічними ознаками з використанням каталогу кодів, до ознак, що співпадають з суттєвими ознаками рішення, яке заявляється, належать: (і) - ідентифікація за комплексом фенотипічних ознак; (ії) - використання результатів біохімічних тестів зі стандартного переліку; (ііі) - формалізація процедури аналізу результатів тестування. Основним фактором, що заважає отриманню бажаного технічного результату є те, що за використаним принципом, метод дозволяє отримати достовірні результати виключно в тих самих межах, що і якісно виконаний візуальний аналіз. Формалізація процедури дійсно знижує вплив суб'єктивного фактору на достовірність ідентифікації, однак штами, що не можуть бути охарактеризовані достатньо однозначно з використанням скороченого набору тестів, потребують подальшого дослідження по розширеній програмі, що в умовах звичайної лабораторної практики не завжди можливо. Найближчим аналогом способу, що заявляється є модернізований варіант попереднього аналогу, в якому урахування результатів біохімічних тестів здійснюється за допомогою програмного забезпечення для ПК автоматизованого робочого місця мікробіолога [5]. База даних та загальні принципи, використані при розробці цієї комп'ютерної програми, аналогічні таким, що застосовуються при конструюванні каталогу кодів. Відповідно, до спільних ознак цього способу та рішення яке патентується, належать: (і) - ідентифікація за комплексом фенотипічних ознак; (іі) - використання результатів біохімічних тестів зі стандартного переліку; (ііі) - формалізації процедури аналізу результатів тестування; (іііі) - автоматизація процедури аналізу із застосуванням спеціального програмного забезпечення. Основна причина, що заважає отриманню бажаного технічного результату, відповідно, також співпадає з наведеною для попереднього аналогу та є спільною для всіх існуючи х методів фенотипі 5 84772 чної ідентифікації мікроорганізмів - недостатній рівень достовірності результатів за наявності недостатньо типового фенотипу мікроорганізму. Характерним для сучасного рівня техніки шляхом вирішення аналогічних проблем є побудова системної математичної моделі, що дозволяє за допомогою формальних процедур (тобто без участі експертів), по наявним експериментальним даним генерувати нові, невідомі раніше знання про системні закономірності [6]. Одним з варіантів, придатних для адекватного моделювання в галузі розробки, є метод мозаїчного портрету (ММП) [7], що передбачає виявлення та використання специфічних для кожного об'єкту дослідження стабільних комплексів ознак, формалізований аналіз яких дає значно більш достовірні результати у порівнянні з методами, що базуються на аналізі окремих ознак. При створенні винаходу поставлена задача: розробити спосіб таксономічної ідентифікації ентеробактерій, в якому за рахунок застосування формалізованої процедури пошуку специфічних тест-комплексів з використанням методу мозаїчного портрету, підвищити рівень інформативності даних, отриманих при здійсненні стандартної процедури фенотипічної ідентифікації, оптимізувати процес аналізу та забезпечити зростання рівня достовірності отриманих результатів. Поставлена задача вирішується шляхом визначення високоспецифічних комплексів ознак (далі тест-комплексів) для кожного представника родини Enterobacteriaceae, створення відповідної бази даних та формалізації всіх етапів аналізу результатів стандартних тестів з використанням принципів та методології ММП. Специфічними для кожного представника родини Enterobacteriaceae тест-комплексами є такі сполучення окремих значень стандартних тестів, які зустрічаються тільки у цього виду і не зустрічаються в жодної з інших 114 бактерій родини. Кількість таких сполучень суттєво перевищує об'єм первинного матеріалу, що аналізується, при тому що специфічність кожного тест-комплексу значно вища, ніж у окремих тестів, оскільки він зустрічається тільки у цього мікроорганізму. В якості фактично відомих і характерних для кожного представника роду значень сорока дев'яти тестів, були використані дані визначника Берджі. Таблиця родини ентеробактерій, кожний рядок якої містить результати тестів, а кожний стовпчик відноситься до одного мікроорганізму перебудовується наступним чином: - кожний рядок створеної таблиці описує бактерію за номером, відповідним її порядковому номеру в таблиці Берджі; - в кожному стовпчику створеної таблиці наведені порядкові номери та результати відповідних тестів: (-) імовірність негативного результату 90100%; (+) імовірність позитивного результату 90100%. Результати тестів з імовірністю менш ніж 90% ([-], d, [+]), при визначенні специфічних тесткомплексів не використовувались. 6 Одержані за допомогою формалізованих процедур сполучення ознак певного виду мають наступний вигляд: (шість з дев'яноста восьми специфічних тесткомплексів Arsenophonus nasoniae ) 1. IЗ* (-) 14(+) 2. 14(+) 47(-) 3. 34(+) 42(-) 4. 40(-) 42(-) 46(-) 96 40(-)42(-)47(-) 97 42(-) 46(-) 47(-) * Число перед дужкою відповідає номеру тесту в таблиці Берджі. Аналогічна процедура здійснюється послідовно для кожного з решти 114 представників сімейства Enterobacteriaceae. На основі отриманої таким чином бази даних, розроблено програмне забезпечення для ПК, придатне для аналізу результатів стандартних біохімічних та фізіологічних тестів на предмет наявності та кількісного співвідношення тест-комплексів, специфічних для певних видів ентеробактерій. Для ідентифікації виділеної культури мікроорганізмів проводять десять - двадцять тестів зі стандартного переліку Берджі. Якщо при аналізі отриманих результатів виявляються тесткомплекси переважно одного (або тільки одного) мікроорганізму, ідентифікація вважається закінченою. В багатьох випадках виконання першого етапу достатньо для достовірної ідентифікації. У випадку, коли результати аналізу свідчать про переважну наявність (>50%) тест-комплексів різних мікроорганізмів, програма, виходячи з наявних фактичних даних та ступеню їх відповідності певним групам тест-комплексів окремих видів, пропонує додаткові два - три тести, що дозволяють оптимально вирішити питання диференпійної діагностики. Ідентифікація вважається закінченою, коли загальна кількість виявлених тест-комплексів, характерних для певного виду, перевищить сумарну кількість тест-комплексів, що зустрічаються у інших ентеробактерій, тобто складе більш ніж 50% всіх виявлених тест-комплексів. Збільшення точності ідентифікації досягається за рахунок використання надмірної кількості тесткомплексів. У випадку якщо будь-який тест характерний переважно для даного мікроорганізму зі значенням (+), буде оцінений як (-), це призведе до зниження відсотка всіх специфічних для нього тест-комплексів, в який включено і „помилковий" тест, і, відповідно, до появи в опису деякої кількості тест-комплексів інших бактерій. Оскільки вірогідність появи "помилкової" оцінки конкретного тесту не перевищує 10% (так саме, як і в наведених аналогах рішення, що патентується), за рахунок використання надмірної кількості тест-комплексів (в більшість яких „провокаційний" тест не входить) забезпечується значно вищій рівень достовірності отриманого результату при використанні майже ідентичного об'єму первинного матеріалу. Для перевірки ефективності створеної комп'ютерної програми застосовано різні можливі варіанти значень тих чи інших тестів, як з використанням значень усіх сорока дев'яти тестів, так і по резуль 7 84772 татах скороченої до 15-20 тестів схеми ідентифікації. Оскільки в основі моделі лежить саме опис видового фенотипу (49тестів з усіма вірогідними варіантами, згідно визначнику Берджі), - при внесенні в комп'ютер значень усіх сорока дев'яти тестів, в будь-якому з можливих варіантів комбінації їх значень, досягається 100% (від імовірного) рівень достовірності результату. Аналіз триває кілька хвилин. При використанні меншої кількості тестів для бактеріологічної ідентифікації циркулюючих та 8 музейних штамів мікроорганізмів, переваги запропонованого рішення стають особливо відчутними: на основі ідентичного за обсягом первинного матеріалу спосіб дозволяє в коротші терміни проводити значно більш надійну диференційну діагностику серед схожих за фенотипічними ознаками представників різних таксономічних груп, у порівнянні зі стандартними методами. У прикладах наведено протоколи ідентифікації окремих представників родини Enterobacteriaceae у вигляді таблиць. Приклад 1 Таблиця 1 Ідентифікація Rahnella №77 за повною схемою № п/п 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40. Оцінка тесту за Варіанти оцінки тестів позначених дослідником визначником БеІ II III IV рджі 2 3 4 5 6 7 Фарбування по Граму Оксидаза Утворення індолу Проба з метиловим червоним [+] ? + + Реакція Фогес-Проскауера + + + + + Цитрат (середовище Сіменса) + + + + + Утворення H2S Гідроліз сечовини Фенілаланіндезаміназа (24 год) + + + + + Лізин декарбоксилаза Аргининдигідролаза Орнітиндекарбоксилаза Рухомість Гідроліз желатини (22°С) Зростання в присутності KCN Використання малонату + + + + + Утворення кислоти з D-глюкози + + + + 4Утворення газу з D-глюкози + + + + + Утворення кислоти з: D-адонітолу L-арабінози + + + + + Гліцерилу [-] ? + Дульцитолу [+] ? + + Міоінозитолу D-ксилози + + + + Лактози + + + + + Мальтози + + + + + D- манітолу + + + + + D-маннози + + + + + Мелібіози + + + + + a-метіл-D-глюкозиду L-рамнози + + + + + Рафінози + + + + + Салі цину + + + + + Сахарози + + + + + D-сорбітолу + + + + + Трегалози + + + + + Целлобіози + + + + + Мукату D ? + + Tampam (середовище Джорданса) Гідроліз ескуліну + + + + + ТЕСТ 9 84772 10 Продовження таблиці 1 41 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49 Використання ацетату Відновлення нітрату Дезоксирібонуклеаза (25°С) Ліпаза ОНРГ Пігмент Розташування джутиків Утворення каталази (24 години) Окислення-бродіння + + Р + F + + ? + ? + + + + + + ? ? ? + + + ? ? ? =26т.к. =2бт.к. =17т.к. Іден- Ідентифі- =17т.к. Іден- Ідентифітифі-кація тифі-кація кація закація зазакінчена закінчена кінчена кінчена Висновок по результатах ідентифікації (кількість тест-комплексів) Приклад 2 Таблиця 2 Ідентифікація Proteus vulgaris N 71 за скороченою процедурою № п/п 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 ТЕСТ 2 Індол Метилрот Фогес-Проскауер Цитрат Сімонса H2S Сечовина Феніланін Лізин Аргинин Орнітин Рухомість Желатина Малонат натрію Газ із глюкози Лактоза Сахароза Маніт Дульцит Саліцин Адоніт Інозіт Сорбіт Рафіноза Рамноза Арабіноза Висновок по результатах ідентифікації Оцінка теста за визначником Берджі 3 + + Р + + + + + Р + Р Варіанти оцінки тестів, позначених дослідником І II 4 + + 7 + + + + + ? + ? =26т.к. Ідентифікація закінчена Джерела інформації: 1. Ribosomal DNA sequencing: experiences from use in the Danish National Reference Laboratory for Identification of Bacteria. J.J.CHRISTENSEN, Ill IV V 5 6 7 8 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + =31т.к. =27т.к Іде- =26т.к Іде- =31 т. к. ІдентифінтифінтифіІдентифікація за- кація за- кація за- кація закінкінчена кінчена кінчена чена K.ANDRESEN, T.JUSTESEN, M.KEMP//APMIS.Sep 2005 - Vol.113, Issue 9, P.621-628. 2. Rebecca S.Y. Wong, Anthony W. Chow. Identification of enteric pathogens by heat shock protein 60kDa (HSP60) gene sequences.// FEMS 11 84772 Microbiology Letters, Jan 2002 .- Vol.206, Issue 1, P. 107-113. 3. Bergey's Manual of Systematic ofBacteriology.1986. - P.409-598. 4. Venkateswaran et al., "Comparison of Commercially Available Kits with Standard Methods for the Detection of Coliforms and Escherichia coli in Foods", Applied and Environmental Microbiology, 62(7): 223 6-2243, (1996). 5. Сасова В.А., Залесских Н.В., Бурков А.Н. Идентификация ентеробактерий и стафилокок Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 12 ков.- Н.Новгород, НПО «Диагностические системы», 2003. - 30 с. 6. Кап М.Д. Алгоритм изобретения при решении технологических и научных задач.//"ММ Деньги и Технологи". - 2003. - №6. - С.26-31. 7. Kats M., Kestelman V., Da videnko A. Intelligent technology of complex systems study as a methodological background for development of high medical technologies.//Scientific Izrael Technological advantages.- 2004.- M.6.- №1-2.-P.5562. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601