Спосіб введення, культивування та розмноження винограду in vitro

Реферат: Спосіб введення, культивування та розмноження винограду in vitro включає введення ініціальних експлантів у культуру in vitro, проліферацію бруньок та індукцію росту пагонів, укорінення і розмноження рослин в умовах in vitro. Для введення у культуру in vitro ініціальних експлантів їх стерилізують від фітопатогенів у розчині препарату дезавіт 5,0 % або дезефект 3,8 % протягом 20 хв., проліферуючі пагони та мікрочубуки укорінюють на безгормональному базовому поживному середовищі Мурасіге і Скуга (МС), обробляючи їх базальну частину ауксиновмісною пудрою, у передадаптаційний період мікрочубуки висаджують на двошарове поживне середовище із агроперлітом. UA 85875 U (54) СПОСІБ ВВЕДЕННЯ, КУЛЬТИВУВАННЯ ТА РОЗМНОЖЕННЯ ВИНОГРАДУ IN VITRO UA 85875 U UA 85875 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства, зокрема до виноградарства, може використовуватись при цілорічному і сезонному культивуванні та розмноженні винограду в умовах in vitro. Відомим аналогом є методика культивування рослин винограду у культурі тканин in vitro (Голодрига П. Я. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда / П. Я. Голодрига, В. А. Зленко, Л. А. Чекмарев. Ялта: ВНИИВ, 1986. - 56 с), яка включає наступні етапи: відбір та стерилізацію первинних експлантів, проліферацію вічок та індукцію розвитку пагонів, живцювання та укорінення мікрочубуків, адаптацію рослин in vitro до умов in vivo, вирощування стандартних саджанців. Згідно з вказаною методикою для введення винограду в культуру in vitro у листопаді-грудні заготовляють лозу з виділених та перевірених на ураження різними інфекціями кущів винограду. У січні-лютому пагони нарізають на 8-15 см чубуки, які протягом 2-3 діб вимочують у розчині ІОК (2 мг/л) і пророщують при температурі 25-30 °C. З зелених пагонів виділяють верхівки розміром 2-3 см, які протягом 30-40 сек. стерилізують у 70 % етиловому спирті та протягом 8-10 хв. у розчині гіпохлориту натрію. Далі протягом 10-15 хв. 4-5 разів промивають стерильною дистильованою водою. Стерилізацію експлантів проводять в умовах асептичного ламінарбоксу. Після стерилізації виділяють апікальні меристеми з листковими зачатками розміром 0,5-0,8 мм та висаджують на рідке поживне середовище Мурасіге-Скуга (М1) з 1 мг/л 6 бензиламінопурину (БАП). Культивування експлантів проводять у культуральному боксі при температурі 23-28 °C, освітленні 1000-5000 лкс. Через 20-30 днів експланти, які збільшувались у розмірах до 1-2 см, пересаджували на рідке середовище М2 з вмістом БАП 2 мг/л. Отримані агрегати бруньок та пагонів розділяють та висаджують на середовище М 2, це повторюють 2 рази на місяць. Перед укоріненням експлантів останній пасаж агрегатів бруньок проводять на рідкому середовищі М3 із вмістом БАП 1 мг/л, що сприяє видовженню пагонів. Подальше розмноження здійснюють шляхом мікрочубукування рослин та висаджування одновічкових чубуків на рідке середовище Н1, та агаризоване Н2 із вмістом 0,1 мг/л індолілоцтової кислоти (ІОК) та 1 мг/л ферулової кислоти. Іншою відомою технологією є технологія, згідно з якою для стерилізації первинних експлантів додатково використовують розчин хінозолу 2 г/л, для введення експлантів у культуру тканин in vitro використовують апекси та мікрочубуки, які висаджують на агаризовані поживні середовища доповнені фітогормонами для проліферації (БАП 0,2 мг/л) та укорінення (ІОК 0,2 мг/л) (Зеленянская Н. Н. Технология размножения винограда с использованием культуры тканей in vitro / Н. Н. Зеленянская, Л. В. Джабурия, II. И. Теслюк // ВиноГрад. - 2009. - № 3. - С. 50-53). Спільними ознаками відомих рішень та заявленої корисної моделі є такі: відбір та стерилізація первинних експлантів, проліферація бруньок та індукція розвитку пагонів, укорінення пагонів та одновічкових мікрочубуків. Недоліками відомих аналогів є використання експлантів малих і гранично малих розмірів, зокрема апікальних меристем, що виправдано тільки при оздоровленні рослин від вірусних захворювань методом культури in vitro у поєднанні з термотерапією. Для клонального мікророзмноження винограду використання таких ініціальних експлантів недоцільне, оскільки це пов'язано з їх низькою приживлюваністю, збільшенням періоду регенерації експлантів, та можливістю виникнення генетичних зміни. Крім того, обробка ініціальних експлантів у 70 % етиловому спирті та у розчині гіпохлориту натрію є не достатньою для повної стерилізації мікрочубуків (експлантів розміром 8-10 мм з бруньками, очищеними від захисних лусок), а хінозол, який також застосовують в процесі стерилізації, є небезпечним для людини препаратом. Для укорінення мікрочубуків у поживне середовище додають фітогормони (ауксини), які позитивно впливають на ризогенез експлантів тільки на первинних етапах, а при подальшому розвитку кореневої системи їх вміст с некорисним і навіть небажаним. Тому, вплив цих речовин на укорінення пагонів необхідно обмежувати у часі. На агаризованому поживному середовищі коренева система мікроклонів винограду in vitro розвивається в умовах незначного вмісту кисню, що супроводжується відсутністю кореневих волосків, які забезпечують поглинання води і поживних речовин після перенесення мікроклонів в умови in vivo. Тому, у першу чергу, необхідно забезпечувати умови для отримання нормально функціонуючої кореневої системи. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити технологічні прийоми стерилізації, укорінення та розмноження винограду in vitro з метою підвищення кількості життєздатних мікроклонів винограду у передадаптаційний період. 1 UA 85875 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Технічний результат корисної моделі виражається у покращенні приживання ініціальних експлантів на етапі введення в культуру in vitro, зменшення періоду укорінення мікрочубуків на етапі розмноження, збільшення кількості життєздатних рослин із добре розвиненою кореневою системою у передадаптаційний період. Поставлена задача вирішується тим, що у способі введення, культивування та розмноження винограду in vitro, який включає введення ініціальних експлантів у культуру in vitro, проліферацію бруньок та індукцію росту пагонів, укорінення і розмноження рослин в умовах in vitro, згідно з корисною моделлю, для введення у культуру in vitro ініціальних експлантів їх стерилізують від фітопатогенів у розчині препарату дезавіт 5,0 % або дезефект 3,8 % протягом 20 хв., проліферуючі пагони та мікрочубуки укорінюють на безгормональному базовому поживному середовищі Мурасіге і Скуга (МС), обробляючи їх базальну частину ауксиновмісною пудрою, у передадаптаційний період мікрочубуки висаджують на двошарове поживне середовище із агроперлітом. Дезефект - засіб дезінфекції та санітарної обробки, для знищення бактерій, вірусів, грибних інфекцій. У складі препарату н - Алкіл диметил бензил амоній хлорид (4,5 %), н - Алкіл диметил етилбензил амоній хлорид (4,5 %). Дезавіт - засіб дезінфекції, основним компонентом якого є водорозчинний синтетичний бактерицидний поліелектроліт на основі гуанідинових сполук. Активний по відношенню до широкого спектру патогенних мікроорганізмів. Агроперліт - природний мінерал, отриманий із вулканічного піску який покращує структуру фунту, є хімічно інертним із нейтральним показником рН. Його рекомендують для вирощування рослин, укорінення саджанців. Покращує доступ повітря та поживних речовин до коренів рослин, вбирає і поступово віддає вологу, сприяє зниженню кислотності, засолення ґрунту, підвищує опірність мікробному гниттю. Технічна характеристика агроперліту: щільність 80-100 3 кг/м , загальна шпаруватість не менше 95-97 %, водозатримуюча здатність - 51 %, водопоглинення - 500-700 %, хімічна стійкість 97-99 %. До складу агроперліту входять такі хімічні сполуки: SiO2 - 75,6 %, Аl2О3 - 12,9 %, Fe2О3 - 0,43 %, СаО - 1,04 %, MgO - 0,7 %, К2О 4,21 %, Na2O - 3,44 %, рН - 4,9. Спосіб здійснюють таким чином. Вихідним матеріалом для введення винограду в культуру тканин in vitro є молоді зелені пагони, отримані після пророщування здеревянілої лози. Апекси та мікрочубуки, відібрані з 1-6 вузлів, ретельно очищають від покривних тканин, лусочок, промивають у мильному розчині та чистій водопровідній воді, протягом 20 хв. стерилізують шляхом витримування у розчинах дезінфікуючих препаратів дезавіт (5,0 % концентрація) або дезефект (3,8 % концентрація), 5-7 хвилин у розчині "Білизни", розведеній у дистильованій воді у співвідношенні 1:5 та 10-30 с у 70 % етиловому спирті, далі проводять 3-разове промивання матеріалу автоклавованою дистильованою водою. Для кращого розуміння матеріалів по стерилізації ініціальних експлантів винограду наводимо приклад: Приклад 1 Для введення в культуру тканин in vitro використовували ініціальні експланти технічного сорту винограду Марсельський чорний ранній клон 1294. Експланти контрольного варіанту стерилізували шляхом витримування протягом 20 хв. у розчині хінозолу 2 г/л, 5-7 хвилин у розчині "Білизни", розведеній дистильованою водою у співвідношенні 1:5, 10-30 с у 70 % етиловому спирті, 3-разово промивали матеріал автоклавованою дистильованою водою. У дослідних варіантах етап стерилізації в хінозолі замінили дезінфікуючими препаратами дезавіт (5,0 % концентрація) або дезефект (3,8 % концентрація). Отримані результати показали, що через 5 діб після введення експлантів у культуру in vitro в контрольному варіанті за рахунок ушкодження покривних тканин було відбраковано 20 % експлантів, а після стерилізації препаратами дезефект та дезавіт приживання становило 100 % (Табл. 1). Таблиця 1 Приживання ініціальних експлантів винограду сорту Марсельський чорний ранній 1294 у залежності від способу стерилізації Приживання ініціальних експлантів, % Варіант через 5 діб через 10 діб Контроль 80 70 Дезефект 3,8 % (20 хв.) 100 93 Дезавіт 5, % (20 хв.) 100 95 2 UA 85875 U 5 10 15 20 25 30 Через 10-15 діб у контрольному варіанті кількість життєздатних експлантів зменшувалась до 70 65 %, а у дослідних варіантах приживання було на рівні 93-80 % (дезефект) та 95-86 % (дезавіт). Застосування такої методики стерилізації дозволяло зменшити відсоток інфікованих ініціальних експлантів до 10-14 %. Після стерилізації ініціальних експлантів їх висаджують у культуральні ємності на модифіковане поживне середовище Мурасіге і Скуга з додаванням цитокініну 6 - БАП для стимуляції процесів проліферації пазушних бруньок та апікальних меристем. Культивування мікроклонів проводять у культуральних боксах при температурі 24 25 °C, фотоперіоді 16 годин, вологості повітря - 70 %, освітлені 2500-3000 лк. Для стимулювання ризогенезу через 20-30 днів експланти пересаджують у культуральні ємності більшого об'єму на поживні середовища з додаванням індолілоцтової кислоти. Рослини у яких сформувалось 6-8 вузлів живцюють і висаджують на безгормональне поживне середовище Мурасіге і Скуга. Перед висаджуванням базальну частину мікрочубуків обробляють ауксиновмісною пудрою виготовленою на основі тальку. Для виготовлення пудри на 100 грам талька беруть 20 мл розчину ІОК з концентрацією 12,5 мг/мл, суміш ретельно розмішують, підсушують і розтирають у порошок у керамічній ступці. Приготовлену пудру автоклавують у чашках Петрі. Перед посадкою одновічкових чубуків на поживне середовище їх базальну частину зволожують стерильною водою, за допомогою фільтрувального паперу злегка просушують, занурюють у виготовлену пудру і висаджують на безгормональне поживне середовище. Приклад 2 Дослідження проводили на мікроклонах підщепних сортів винограду - РР 101-14 та БР Кречунел 2. Прийом додавання ІОК до поживного середовища МС замінили прийомом обпудрювання базальної частини мікрочубуків пудрою виготовленою на основі тальку, яка містила 12,5 мг ІОК/мл. Контрольним було ростове поживне середовище МС, виготовлене за прописом. Проведення біометричних обліків розвитку експлантів підщепних сортів винограду через 25 днів культивування показало, що у порівняні з контролем кількість коренів, яка утворювалася у варіанті з 12,5 мг ІОК/мл збільшувалася на 20-30 %, їх довжина зменшувалася на 0,5-1,0 см, висота пагонів рослин збільшувалася на 0,5-1,5 см. Загальне вкорінення становило 85-90 %. Причому початок утворення коренів відмічали вже на 7-8 день, що сприяло апікальному росту мікрочубуків (Табл. 2). Таблиця 2 Вплив гормональної пудри на розвиток мікроклонів винограду підщепних сортів Варіант Контроль Пудра 12,5 мг ІОК/мл 35 40 45 50 РР висота рослин, см 2,2 3,8 101-14 кількість коренів, шт. 2,3 3,2 БР Кречунел 2 висота рослин, см 3,2 3,9 Таким чином, порівняно з контрольним варіантом досліду після застосування ауксиновмісної пудри відсоток укорінених рослин зростав у 1,5-2,0 рази, кількість коренів збільшувалася у 1,21,7 рази, а їх довжина зменшувалась. Для забезпечення оптимальних умов для розвитку кореневої системи у передадаптаційний період мікрочубуки висаджують на двошарове поживне середовище з агроперлітом. Для його приготування використовують середовище Мурасіге і Скуга з вмістом агару 7 г/л та додають агроперліт за умови, що його шар буде не більшим ніж 0,2-0,4 см. Поживне середовище стерилізують загальноприйнятим способом. Мікрочубуки висаджують на вищевказане середовище і вирощують до оптимальних розмірів. Приклад 3 Дослідження проводили на мікроклонах винограду підщепного сорту БР Кречунел 2. Мікрочубуки висаджували на двошарові поживні середовища з агроперлітом та вмістом агару 7 г/л, контролем було поживне середовище МС, виготовлене за прописом. Приживання мікрочубуків винограду через 10 днів після висаджування на контрольне та двошарове поживне середовищ/ становило 100 %. Через два місяці культивування визначали біометричні показники розвитку мікроклонів винограду (Табл. 3). 3 UA 85875 U Таблиця 3 Біометричні показники розвитку мікроклонів винограду підщепного сорту Кречунел 2 на двошаровому поживному середовищі Варіант МС (контроль) МС+агроперліт 5 10 15 20 Висота Кількість Кількість стебла, см листків, шт. коренів, шт. 12,5 14,1 8,5 10,3 10,0 15,3 Середня довжина кореня, см 6,7 10,6 Маса вологою приросту, г 0,82 1,34 Маса вологих коренів, г 0,69 0,40 У контрольному варіанті рослини добре розвивались, висота стебла у середньому дорівнювала 12,5 см, кількість листків - 8,5 шт., кількість коренів з середньою довжиною 6,7 см 10,0 шт. Маса вологого приросту становила 0,82 г, а маса вологих коренів - 0,69 г. Висота стебла рослин на двошаровому поживному середовищі була більша, ніж у контрольних мікроклонів на 1,6 см або 11,3 %. Корені формувалися активніше, їх кількість була більшою у 1,5 рази, з середньою довжиною одного кореня 10,6 см. Волога маса приросту дорівнювала 1,34 г, при цьому волога маса коренів зменшувалась у порівнянні з контролем. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 1. Спосіб введення, культивування та розмноження винограду in vitro, який включає введення ініціальних експлантів у культуру in vitro, проліферацію бруньок та індукцію росту пагонів, укорінення і розмноження рослин в умовах in vitro, який відрізняється тим, що для введення у культуру in vitro ініціальних експлантів їх стерилізують від фітопатогенів у розчині препарату дезавіт 5,0 % або дезефект 3,8 % протягом 20 хв., проліферуючі пагони та мікрочубуки укорінюють на безгормональному базовому поживному середовищі Мурасіге і Скуга (МС), обробляючи їх базальну частину ауксиновмісною пудрою, у передадаптаційний період мікрочубуки висаджують на двошарове поживне середовище із агроперлітом. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що ауксиновмісна пудра виготовлена на основі тальку. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що ауксиновмісна пудра містить індолілоцтову кислоту (ІОК) 12,5 мг/мл. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4