Спосіб створення фузаріозостійкого вихідного матеріалу пасльонових овочевих рослин (томат, баклажан, перець)

Реферат: Спосіб створення фузаріозостійкого вихідного матеріалу пасльонових овочевих рослин (томат, баклажан, перець) методами фітоімунології та клітинної селекції включає оцінку рослин в умовах штучного фону в культурі in vivo, добір від стійких генотипів і культивування калюсних клітин, створення в культурі in vitro селективного фону (КФ), добір стійких калюсних клонів, контроль ознаки стійкості у рослин-регенерантів. Штучний фон створюють шляхом суміші культуральних фільтратів 4-х видів грибів (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, F. solani, F. culmorum, F. oxysporum f.sp. vasinfectum) у співвідношенні 2:1:1:1, яке відповідає природній їх участі у патогенезі цієї хвороби. У стерильну культуру вводять лише насіння зразків із високим рівнем прояву стійкості в культурі in vivo. Оцінку рівня стійкості і добір калюсів в культурі in vitro проводять при першому і третьому пасажах шляхом додавання до поживного середовища MS. Половину відібраних та адаптованих рослин-регенерантів висаджують у плівкову теплицю для оцінки за комплексом інших ознак, другу половину паралельно рослин додатково оцінюють в лабораторних умовах експрес-методом. UA 89518 U (12) UA 89518 U UA 89518 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі біотехнології, фітоімунології та сільського господарства і може бути використана у селекції овочевих рослин. На сьогодні в усьому світі найбільш економічно обґрунтованим, актуальним, перш за все через зростаючі сучасні вимоги до охорони навколишнього середовища та здоров'я людини, та ефективним методом захисту більшості сільськогосподарських культур від хвороб різної етіології визнано впровадження у виробництво сортів і гібридів із ознакою тривалої стійкості до найпоширеніших хвороб [1, 2]. При цьому одним зі найбільш дійових шляхів створення вихідного матеріалу, який відповідатиме таким вимогам, є клітинна селекція, методи якої полягають у доборі на штучному інфекційному фоні певного збудника клітинних популяцій, стійких до селективного фактора добору, із подальшою регенерацією в умовах in vitro із відібраних калюсів рослин - регенерантів, дорощуванням їх до рослин, із яких можна отримати повноцінне насіння [4]. За останні десять років у науковій літературі опублікована низка експериментальних робіт, в яких практично доведена ефективність використання при оцінках і доборі стійких форм сільськогосподарських рослин в культурі in vitro різнобічних штучних (лабораторних) методів зараження. Об'єднуючим цих методів є те, що всі вони базуються на визначенні загальної та специфічної реакції калюсних ліній, рослин-регенерантів на штучне їх інфікування фітопатогенами у контрольованих дослідником умовах [3, 4, 8]. В останні роки однією із найбільш шкідливих хвороб пасльонових овочевих рослин (томат, баклажан, перець) на Україні є хвороба в'янення, основними збудниками якого в умовах Лісостепової зони є некротрофні (токсиноутворюючі) патогени - гриби роду Fusarium Link. Нині оцінку стійкості томата до фузаріозного в'янення проводять методами штучного зараження інокулюмом сіянців, окремих пагонів (15-денна жива культура гриба Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) або дорослих рослин, які вирощуються на інфекційному фоні (шляхом внесення інокулюму гриба у ґрунт). Ступінь ураження рослин хворобою вираховують через 30 і 60 діб. Зведена характеристика рівня стійкості зразка при цьому отримується після 23 років досліджень [5]. Недоліком цього способу є те, що для його здійснення потрібний значний об'єм інфекційного матеріалу, тривалий період прояву симптомів і повного розвитку хвороби, ризик втрати генотипів, сприйнятливих до фузаріозу, але тих, що мають інші цінні ознаки, тривалий термін проведення досліджень. Крім цього оцінку рівня стійкості томатів до фузаріозного в'янення можна визначати і в лабораторних умовах за ростом пилкових трубок на селективному середовищі. Відомий спосіб, коли на пилок діють токсичним агентом - фузарієвою кислотою шляхом додавання її до поживного середовища, а оцінку стійкості мікрогаметофітів (пилкових зерен) проводять протягом 24 години за абсолютним показником зменшення росту (мкм) довжини пилкових трубок нестійких генотипів шляхом порівнянні із їх ростом у контрольному варіанті (оптимальне середовище) [7]. Недоліком цього способу є те, що він дозволяє проводити оцінку стійкості тільки на рівні мікрогаметофітів (констатувати лише факт наявності/відсутності стійкості). При цьому потрібно враховувати термін придатності об'єкта для проведення аналізу (термін життєздатності пилку, рівень фертильності), мати спеціальне обладнання та кваліфікованих спеціалістів. Відомий спосіб підвищення стійкості рослин люцерні до фузаріозу [9], який полягає у наступному: 1) генеративні органи рослини люцерні із початкових етапів розвитку (від початку утворення чоловічого і жіночого археоспорія) до формування мікро- і макроспор піддають впливу розчину культурального фільтрату (КФ) збудника фузаріозу (або чистих його токсинів, або їх синтетичних аналогів) за допомогою вакуумної інфільтрації; 2) після розвитку із бутонів зрілих квіток їх піддають штучному самозапиленню, отримане насіння пророщують на середовищі із КФ збудника (або чистими його токсинами, або їх синтетичними аналогами); 3) стійкі паростки висаджують у ґрунт, вирощують до фази цвітіння, самозапилюють, а отримане насіння із кожної рослини пророщують окремо на середовищі із КФ збудника або його чистими токсинами; 4) рослини, у яких у насіннєвому потомстві є самий високий відсоток виживших проростків зберігається як елітний, а їх насіння висівають на ділянки для польових досліджень на стійкість до фузаріозу і оцінки важливих господарсько-цінних ознак. Найбільш близьким аналогом до корисної моделі є спосіб створення стійких до альтернаріозу вихідних селекційних форм томата [10], який полягає у наступному: 1 UA 89518 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. Насіння томату вихідних форм вводять у стерильну культуру та культивують на безгормональному середовищі для одержання проростків. 2. Як селективний агент добору використовують 40-відсотковий КФ, отриманий шляхом культивування високо вірулентних штамів гриба Alternaria solani Sorauer, на рідкому поживному середовищі Чапека. 3. Клітинну селекцію проводять за наступною схемою. Сім'ядольні листки 7-10-денних проростків томата висаджують на індукційне селективне середовище MS, модифіковане фітогормонами (ІОцК та БАП) із додаванням до нього КФ гриба (перший пасаж). Отримані органогенні експланти культивують протягом 1 місяця (другий пасаж) на безгормональному середовищі MS, після чого їх повторно висаджують на селективне середовище із додавання до нього КФ (третій пасаж). 4. Дібрані в умовах in vitro та адаптовані до нестерильних умов рослини висаджують у плівкову теплицю в умови in vivo для подальшої інокуляції міцеліально-споровою суспензією A. solani, оцінки їх стійкості та проведення індивідуальних відборів насіння. Наведений спосіб (аналог) клітинної селекції томата на стійкість проти ранньої сухої плямистості в культурі in vitro має наступні недоліки: цей спосіб потребує - залучення у дослідження в культурі in vivo значного об'єму інфекційного матеріалу, ізольованої ділянки (теплиці) для контролю поширення інфекції, тривалого інкубаційного періоду від початку інокуляції рослини до появи на ній симптомів ураження (20-40 діб). В основу корисної моделі поставлена задача розширення арсеналу методів і засобів для прискорення процесу зі створення стійкого вихідного матеріалу, зокрема пасльонових овочевих культур - до фузаріозного в'янення, шляхом застосування багаторазового добору в умовах in vivo та in vitro, збільшення його ефективності за рахунок підвищення точності визначення рівня тривалої стійкості, скорочення терміну отримання стійкого вихідного матеріалу, його збереження та прискореного розмноження стійких ген-типів. Спосіб здійснюється за наступною методичною схемою. І ЕТАП: 1. Відібрані чисті колонії видів грибів збудників фузаріозного в'янення пасльонових рослин, що найбільш зустрічаються (F. oxysporum f. sp. lycopersici, F. solani, F. culmorum, F. oxysporum f.sp. vasinfectum), вирощують окремо у півлітрових колбах на рідкому середовищі Чапека у термостаті за температури 20-22 °C протягом 20 діб. Для отримання чистого (нативного) КФ колонії цих грибів відділяють від культуральної рідини дворазовим фільтруванням. Отриману чисту культуральну рідину (КФ) цих грибів змішують у пропорції 2:1:1:1 та розводять дистильованою водою у співвідношенні 1:1. 2. Інфекційний фон створюють шляхом занурення коренів розсади баклажана, перця, детермінантних зразків томата (фаза 3-4 справжніх листків) у розведений КФ на 48 годин. Оцінку стійкості генотипів томату індетермінантного типу проводять шляхом занурення у КФ свіже відібраних з другого ярусу рослин пасинків. Контролем у дослідах слугують 10-15 рослини (пасинків) кожного зразка, які занурюються у дистильовану воду. Після цього у пробах проводять оцінку і добір стійких генотипів за імунологічною реакцією - швидкістю втрати рослинами тургору протягом 48 годин. II ЕТАП: 3. За результатами оцінки стійкості в умовах штучного фону для введення в стерильну культуру добираються генотипи з різним рівнем її прояву. Насіння цих зразків вводять у стерильну культуру шляхом послідовної стерилізації у 96-відсотковому етанолі (3 хвилини), надалі - у 30-відсотковому розчині гіпохлориду натрію (20 хвилин). Потім насіння промивають не менше п'яти разів стерильною дистильованою водою у стерильних умовах (ламінарний бокс). 4. Простерилізовані насінини для ініціації їх проростання розміщують на твердому безгормональному поживному середовищі за прописом MS. Культивування проводять за освітлення 2000 лк при температурі 23-25 °C. 5. Клітинна селекція здійснюється за двоступінчастою схемою, шляхом культивування сім'ядолей семиденних проростків на базовому середовищі MS, модифікованому регуляторами росту (ІОцК і БАП). Як селективний агент добору до нього (в залежності від видової належності рослин) додають від 20 до 50 % суміші КФ основних збудників фузаріозного в'янення (див. п. 1). Контролем слугує базове поживне середовище без додавання до нього КФ. Культивування калюсних клітин проводять при 16-годинному фотоперіоді за температури +22…+24 °C при освітленні у 2 тис. люкс. 6. Рівень селективної дії КФ на розвиток експлантатів в культурі in vitro та першу диференціацію зразків за її проявом на калюси проводять на 16 день культивування. Вплив комплексу токсинів КФ на ріст і розвиток калюсів оцінюють візуально за наступною 2 UA 89518 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 оригінальною 5-баловою шкалою: бал 0 - високостійкий, розвиток тканин не відрізняється від культивування на контрольному варіанті; бал 1 - стійкий, хлорозних тканин до 25 %, наростання калюсів інтенсивне; бал 2 - середньостійкий, хлорозних тканин - до 50 %, наростання калюсів середнє; бал 3 - сприйнятливий, хлорозних тканин - до 75 %, наростання калюсів пригнічене; бал 4 - високосприйнятливий, хлорозних тканин більше 75 %, наростання калюсів відсутнє. Другий пасаж проводять на базовому середовищі MS без додавання селективного агента добору. 7. У третьому пасажі рослини-регенеранти повторно культивують на базовому середовищі MS з додаванням до нього культурального фільтрату, і повторно проводять в культурі in vitro їх диференціацію за рівнем фузаріозо-стійкості (див. п. 5). 8. Отримані у результаті двоступінчастого добору рослини-регенеранти розмножують, підрощують, укорінюють і адаптують до нестерильних умов за загальновідомими методиками. III ЕТАП: 9. Для підтвердження стійкості до фузаріозного в'янення дібраного методами клітинної селекції пробіркового матеріалу проводять його додаткову оцінку лабораторним методом. Для контрольного тестування беруть не менше 20 шт. рослин кожного мікрокліну. Коріння регенерантів відмивають проточною водою від субстрату, розміщують у скляних ємностях об'ємом 100 мм, витримують у 50-відсотковому розчині КФ комплексу грибів - збудників фузаріозного в'янення протягом 48 годин. Вплив комплексу токсинів КФ на ріст і розвиток рослин-регенерантів оцінюють візуально за наступною 6-баловою шкалою: бал 0 - ознаки в'янення відсутні; бал 1 - ознаки в'янення рослин проявляються на рослинах після 48 годин дії культурального фільтрату; бал 2 - ознаки проявляються після 36 годин; бал 3 - ознаки проявляються після 24 годин; бал 4 - ознаки проявляються після 12 годин; бал 5 - ознаки проявляються після 6 годин. Для подальшого селекційного використання як вихідний стійкий матеріал залучають зразки (або рослини), які залишились без візуальних симптомів в'янення під дією КФ протягом всього терміну проведення тесту - 48 годин. 10. Для оцінки відібраних генотипів за комплексом інших ознак і отримання насіння адаптовані до нестерильних умов рослини-регенеранти висаджують у плівкову теплицю. Надалі оцінку рівня прояву різних ознак проводять згідно з "Методикою проведення експертизи сортів на відмітність, однорідність і стабільність (ВОС)" [6]. Джерело інформації: 1. Основи селекції польових культур на стійкість до шкідливих організмів: навчальний посібник, за ред. В.В. Кириченка та В.П. Петренкової. НА-АН, Ін-т рослинництва ім. В.Я. Юр'єва. - X.: Ін-т рослинництва ім. В.Я. Юр'єва, 2012. - 320 с. 2. Плотникова Л.Я. Иммунитет растений и селекция на устойчивость к болезням и вредителям / Л.Я. Плотникова. - М.: КолосС, 2007. - 351 с. 3. Калашникова Е.А. Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням: дис. … д-ра биол. наук: 03.00.23 / Калашникова Елена Анатолиевна. - М., 2003. - 279 с. 4. Биология клеток растений in vitro и биотехнология: сб. научн. тр. ІХ-ой междунар. конф., 8-12 сентября 2008 г. / ИФР им. К.А. Тимирязева, МГУ им. М.В. Ломоносова. - М.: ООО "ИД ФБК-ПРЕСС", 2008. - С. 156, 410. 5. Методические указания по селекции сортов и гибридов томата для открытого и защищенного грунта. - М.: ВАСХНИЛ, 1986. - С. 54-57. 6. Охорона прав на сорти рослин. Методика проведения экспертизи сортів на відмітність, однорідність і стабільність (ВОС). - К.: Алефа, 2004. - 242 с. 7. Пат. 3848 Беларусь, С1 А01Р1/00, А01Н1/04. Способ оценки устойчивости томатов к фузариозному увяданию / Анохина B.C., Пискун С.Г., Поликсенова В.Д., Тимошенко М.К.; заявитель и патентообладатель Белорусский государственный университет. - № 970208, заявл. 15.04.1997; опубл. 03.06.2001. 8. Пат. 94034770 Российская Федерация, МПК 6 А01Н1/04, A01G7/00. Способ отбора растений, устойчивых к фитопатогену / Веденеева М.Л., Тихонова Т.В., Маркелова Т.С., Кириллова Т.В.; заявитель и патентообладатель Поволжский научно-исследовательский институт животноводства и биотехнологии. - № 94034770/13, заявл. 20.09.1994; опубл. 27.05.1997. 9. Пат. 2278508 Российская Федерация, МПК 6 А01Н1/04. Способ повышения устойчивости растений люцерны к фузариозу / Соложенцев П.Д., Соложенцева Л.Ф., Агафодорова М.Н.; заявитель и патентообладатель ГНУ "Всероссийский НИИ кормов им. В.Р. Вильямса". - № 2004116667/13, заявл. 02.06.2004; опубл. 27.06.2006. Бюл. № 18. 3 UA 89518 U 10. Пат. 62592 Україна, МПК А01Р1/04 (2006.01). Спосіб створення стійких проти альтернаріозу вихідних форм томата / Мірошниченко В.П., Івченко Т.В., Черненко В.Л., Черненко К.М.; заявник і патентовласник Інститут овочівництва і баштанництва НААН. - № u201014200; заявл. 29.11.2010 p.; опубл. 12.09.2011 р. Бюл. № 17. 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 Спосіб створення фузаріозостійкого вихідного матеріалу пасльонових овочевих рослин (томат, баклажан, перець) методами фітоімунології та клітинної селекції, що включає оцінку рослин в умовах штучного фону в культурі in vivo, добір від стійких генотипів і культивування калюсних клітин, створення в культурі in vitro селективного фону (КФ), добір стійких калюсних клонів, контроль ознаки стійкості у рослин-регенерантів, який відрізняється тим, що штучний фон створюють шляхом суміші культуральних фільтратів 4-х видів грибів (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, F. solani, F. culmorum, F. oxysporum f.sp. vasinfectum) у співвідношенні 2:1:1:1, яке відповідає природній їх участі у патогенезі цієї хвороби; у стерильну культуру вводять лише насіння зразків із високим рівнем прояву стійкості в культурі in vivo; оцінку рівня стійкості і добір калюсів в культурі in vitro проводять (в залежності від видової належності рослин) при першому і третьому пасажах шляхом додавання до поживного середовища MS, модифікованого регуляторами росту ІОцК і БАП, від 20 до 50 % суміші КФ основних збудників фузаріозного в'янення пасльонових; половину відібраних та адаптованих рослин-регенерантів висаджують у плівкову теплицю для оцінки за комплексом інших ознак, другу половину паралельно рослин додатково оцінюють в лабораторних умовах експрес-методом, шляхом 48-годинної інкубації рослин у 50-відсотковому розчині суміші КФ. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4