Спосіб розмноження in vitro metasequoia glyptostroboides hu et cheng

Реферат: Спосіб розмноження in vitro Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng включає ініціацію, намноження та вкорінення. Для продукування садивного матеріалу метасеквої китайської застосовані наступні модифікації твердих живильних середовищ: для ініціації органогенезу MS, доповнене 0,5 mg/1 NAA+0,3 mg/1 2,4-D+0,5 mg/1 6-BA; для намноження ініційованих експлантів - LM, доповнене 0,5 mg/1 NAA+0,5 mg/1 2,4-D+1,0 mg/1 6-BA; для укорінення мікроживців - 0,5 LM, доповнене 0,25 mg/1 2,4-D. UA 90219 U (12) UA 90219 U UA 90219 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі біотехнології і лісового господарства та може застосовуватися для масового продукування садивного матеріалу Metasequoia glyptostroboides Нu et Cheng розмноженням in vitro. Аналіз стану питання щодо відтворення потенціалу цього деревного виду показав, що дослідники спробували ввести в культуру тканин Metasequoia glyptostroboides Нu et Cheng. Найкращі результати отримали Слюсар СІ. та Кузнецов С.І. (найближчий аналог пропонованого способу) [4-5]. Первинні експланти деконтамінували в декілька етапів: тричі промивали проточною водою з милом, 15-20 хвилин - проточною водою, дистильованою водою, 30 сек. обробляли 70 % водним розчином етанолу і 15 хв. - 30 % водним розчином гіпохлориду натрію. Найкращий результат індукції органогенезу та намноження отримано із відібраних на початку вегетаційного періоду стерилізованих бруньок 2-3-річних сіянців на двох модифікаціях живильних середовищ відповідно: MS+0,5 mg/1 6-BA+0,5 mg/1 IAA та MS+0,3 mg/1 2,4D. Отримали пагони в 17,7-61,2 % та придаткові бруньки - в 10,8-49,0 % експлантів. Слід зазначити про відсутність інформації щодо частки отриманих деконтамінованих експлантів, укорінених та адаптованих до ґрунтових умов регенерантів. На нашу думку, розроблена методика не є достатньо ефективною для масового отримання садивного матеріалу із цінними генотипами. В основу корисної моделі поставлено задачу підвищити частку ініційованих і намножених експлантів, збільшити коефіцієнти намноження адвентивних пагонів та отримати високу частку вкорінених регенерантів, що дасть змогу прискорити терміни і підвищити ефективність продукування садивного матеріалу in vitro. Експерименти з розмноження in vitro Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng проводили протягом 2009-2013 pp. у лабораторії культури тканин кафедри лісових культур і лісової селекції ЯЛТУ України за загальноприйнятими методиками в шість етапів: вибір рослини-донора та заготівля експлантів, стерилізація вихідного рослинного матеріалу, ініціація і намноження експлантів, укорінення та адаптація отриманих рослин-регенерантів до ґрунтових умов [3]. Джерелом експлантів слугували вирощені із насіння в умовах відкритого ґрунту на території декоративного розсадника Державного ботанічного саду НЛТУ України 5-6 річні рослини Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng. Як експланти використали розібрані вегетативні бруньки із заготовлених у лютому-березні живців. Деконтамінацію вихідних експлантів проводили наступним чином: 96 %-им водним розчином етанолу протягом 15 сек.; протічною Н2О з детергентом - 16 год.; 50 %-им водним розчин NaCIO-10 хв.; 0,2 %-им водним розчином AgNO3-10 хв. Після кожного реактиву розібрані бруньки тричі промивали дистильованою водою. Отримали 80,4 % деконтамінованих експлантів. Поставлена задача вирішується тим, що у культивуванні Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng на модифікованих твердих живильних середовищах Murashige and Skoog (MS) (для ініціації) та Litvay (LM) (для намноження та укорінення) [1-2]. Модифікація середовища MS для ініціації експлантів Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng полягала у його доповненні 0,5 mg/1 NAA+0,3 mg/1 2,4-D+0,5 mg/1 6-BA. Після 40 діб культивування отримано 78 % ініційованих експлантів (Фіг. 1-2). Намноження ініційованих експлантів проводили на твердому живильному середовищі LM, доповнененому 0,5 mg/1 NAA+0,5 mg/1 2,4-D+1,0 mg/1 6-BA. За цих умов отримали 96,3 % експлантів, які утворили адвентивні мікропагони; 6,9 нових мікропагонів на експлант і 3,0 нових сегментів на мікропагін (Фіг. 3). Мікроживці розміром більше 3,0 см пасажували на середовище для ризогенезу. Для вкорінення застосовували середовище LM зі зменшеною вдвічі концентрацією компонентів і модифіковане додаванням 0,25 mg/1 2,4-D. Через 30 діб культивування отримали 82,1 % укорінених регенерантів (Фіг. 4-5). Експланти вирощували за таких умов: температура повітря 20-22 °C, відносна вологість повітря 30-35 % та 16-годинний фотоперіод з інтенсивністю 3 klx. Протягом всього циклу розмноження регенеранти кожних два тижні переносили на свіже поживне середовище. Для адаптації вкорінені регенеранти виймали з пробірок, змивали залишки агару дистильованою водою та висаджували у завчасно приготовлений простерилізований субстрат: дерновий ґрунт з піском та торфом (1:1:1). В умовах культуральної кімнати отримали 80,2 % життєздатних рослин (Фіг. 6). Після 60 діб адаптації регенеранти висаджували у відкритий ґрунт. Дослідження показали, що застосування запропонованого способу мікроклонування дає змогу отримати регенеранти Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng за короткі терміни, підвищує показники розмноження, а тому є ефективнішим порівняно з аналогами (табл.). 1 UA 90219 U Таблиця Показники розмноження in vitro метасеквої китайської запропонованим способом Отримано експлантів (регенерантів), % Запропонований спосіб Найближчий аналог [4-5] Деконтамінація 80,4 інформація відсутня Ініціація 78,0 (SH=6,9 шт.; SE-3,0 шт.) 61,2 Намноження 96,3 49,0 Вкорінення 82,1 інформація відсутня Адаптація 82,0 інформація відсутня Примітка: SH - кількість нових адвентивних мікропагонів на експлант; SE - кількість нових сегментів на мікропагін Етапи клонування 5 10 15 20 Це дає підстави для використання запропонованого способу розмноження in vitro для масового продукування садивного матеріалу Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng. Джерела інформації: 1. Litvay J.D. Influence of a loblolly pine (Pinus taeda L.). Culture medium and its components on growth and somatic embryogenesis of the wild carrot (Daucus carota L.) [Text]/ John D. Litvay, Devi C. Verma, Morris A. Johnson// Plant cell reports. - Springer Verlag, 1985. - Volume 4, Issue 6. - Pp. 325-328. -ISSN 0721-7714. 2. Murashige T.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures [Text]/ T. Murashige, F. Skoog// Physiol. PI. - Copenhagen, 1962. - № 15. - P. 493-497. 3. Мельничук М.Д. Біотехнологія рослин [Текст]: підр. [для студ ВНЗ]/ М.Д. Мельничук, Т.В. Новак, В.А. Кунах. -К.: ПоліграфКонсалтинг, 2003. - 520 с - ISBN 966-8440-03-Х. 4. Слюсар С.І. Біологічні особливості видів родини Taxodiaceae F.W. Neger у зв'язку з інтродукцією в Лісостепу України [Текст]: автореф. дис… канд. біол. наук: 03.00.05/ Станіслав Ігорович Слюсар; НАН України. Нац. ботан. сад ім. М.М. Гришка. -К.: 2005. - 18 [1] с, включ, обкл.: іл. - Бібліогр.: с. 14-15. 5. Слюсар С.І. Інтродукція таксодієвих (Taxodiaceae F.W. Neger) в Лісостепу України [Текст]/ С.І. Слюсар, С.І. Кузнецов; за ред. проф. М.А. Кохна. -К.: Видавничий центр НАУ, 2008. - с 154. ISBN 966-8006-14-3. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб розмноження in vitro Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng, який включає ініціацію, намноження та вкорінення, який відрізняється тим, що для продукування садивного матеріалу метасеквої китайської застосовують наступні модифікації твердих живильних середовищ: для ініціації органогенезу - MS, доповнене 0,5 mg/1 NAA+0,3 mg/1 2,4-D+0,5 mg/1 6-BA; для намноження ініційованих експлантів - LM, доповнене 0,5 mg/1 NAA+0,5 mg/1 2,4-D+1,0 mg/1 6BA; для укорінення мікроживців - 0,5 LM, доповнене 0,25 mg/1 2,4-D. 2 UA 90219 U 3 UA 90219 U Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4