Спосіб розмноження in vitro липи серцелистої (tilia cordata mill.)
Формула / Реферат
Спосіб розмноження липи серцелистої in vitro, який охоплює ініціацію, намноження (мультиплікацію), вкорінення (ризогенез) та адаптацію до ґрунтових умов, який відрізняється тим, що у продукуванні садивного матеріалу липи серцелистої застосоване модифіковане тверде поживне середовище Р24 для листяних деревних рослин із експериментально підібраними оптимальним вмістом і концентрацією регуляторів росту та рН середовища: KNO3 - 253 мг/л, Ca(NO3)2×2H2O - 661 мг/л, K2SO4 - 436 мг/л, KН2РО4 - 408 мг/л, Mg(NO3)2´6H2O - 192 мг/л, NH4H2PO4 - 144 мг/л, myo-inositol - 100 мг/л, arginin-HCl - 400 мг/л, NaCl - 5,8 мг/л, Н3ВО3 - 7,44 мг/л, MnSO4xH2O - 3,38 мг/л, ZnSO4´7H2O - 11,5 мг/л, K1 - 0,6 мг/л, Na2MoO4 - 0,0425 мг/л, CuSO4´5H2O - 2,5 мг/л, СоС12´6Н2О - 0,05 мг/л, NiCl2´6H2O - 0,0476 мг/л, FeNaEDTA - 42,35 мг/л, FeCl3 - 8,1 мг/л, agar - 7 г/л, szacharoz - 30 г/л; для ініціації модифікація поживного середовища Р24 (рН = 5,8) полягала у підвищенні вмісту вітамінів: thiamin-HCl - до 0,3 мг/л, nicotinic acid - до 1,0 мг/л, piridoxin-HCl - до 1,0 мг/л; додатковому залученні 0,5 мг/л 6-ВА, 0,2 мг/л NAA, 2,0 мг/л glycin; для намноження модифікація поживного середовища Р24 (рН = 6,2) полягала у підвищенні вмісту вітамінів: thiamin-HCl - до 0,4 мг/л, nicotinic acid - до 1,0 мг/л, piridoxin-HCl - до 1,0 мг/л; додатковому залученні 0,5 мг/л 6-ВА і 2,0 мг/л glycin; для вкорінення тверде поживне середовище Р24 (рН = 6,2) модифікували зменшенням вдвічі вмісту компонентів і додатковим залученням 0,1 мг/л NAA, 2,0 мг/л ІВА та 2,0 мг/л glycin.
Текст
Реферат: Спосіб розмноження липи серцелистої in vitro, який охоплює ініціацію, намноження (мультиплікацію), вкорінення (ризогенез) та адаптацію до ґрунтових умов. У продукуванні садивного матеріалу липи серцелистої застосоване модифіковане тверде поживне середовище Р24 для листяних деревних рослин із експериментально підібраними оптимальним вмістом і концентрацією регуляторів росту та рН середовища: KNO3-253 мг/л, Ca(NO3)2×2H2O - 661 мг/л, K2SO4 - 436 мг/л, KН2РО4 - 408 мг/л, Mg(NO3)26H2O - 192 мг/л, NH4H2PO4 - 144 мг/л, myo-inositol - 100 мг/л, arginin-HCl - 400 мг/л, NaCl - 5,8 мг/л, Н3ВО3 - 7,44 мг/л, MnSO4xH2O - 3,38 мг/л, ZnSO47H2O - 11,5 мг/л, Kl - 0,6 мг/л, Na2MoO4 - 0,0425 мг/л, CuSO45H2O - 2,5 мг/л, СоСl26Н2О - 0,05 мг/л, NiCl26H2O - 0,0476 мг/л, FeNaEDTA-42,35 мг/л, FeCl3 - 8,1 мг/л, agar - 7 г/л, szacharoz - 30 г/л. Для ініціації модифікація поживного середовища Р24 (рН = 5,8) полягала у підвищенні вмісту вітамінів: thiamin-HCl - до 0,3 мг/л, nicotinic acid - до 1,0 мг/л, piridoxin-HCl - до 1,0 мг/л; додатковому залученні 0,5 мг/л 6-ВА, 0,2 мг/л NAA, 2,0 мг/л glycin. Для намноження модифікація поживного середовища Р24 (рН = 6,2) полягала у підвищенні вмісту вітамінів: thiamin-HCl - до 0,4 мг/л, nicotinic acid - до 1,0 мг/л, piridoxin-HCl - до 1,0 мг/л; додатковому залученні 0,5 мг/л 6ВА і 2,0 мг/л glycin. Для вкорінення тверде поживне середовище Р24 (рН = 6,2) модифікували зменшенням вдвічі вмісту компонентів і додатковим залученням 0,1 мг/л NAA, 2,0 мг/л ІВА та 2,0 мг/л glycin. UA 78975 U (54) СПОСІБ РОЗМНОЖЕННЯ IN VITRO ЛИПИ СЕРЦЕЛИСТОЇ (TILIA CORDATA MILL.) UA 78975 U UA 78975 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до галузі біотехнології і лісового господарства та може застосовуватися для масового продукування садивного матеріалу липи серцелистої (Тiliа cordata Mill.) із цінними генотипами розмноженням in vitro. Аналіз стану питання щодо відтворення липи серцелистої показав, що розроблення ефективних технологій розмноження липи in vitro є актуальною проблемою [1-20]. Вибір як джерел експлантів зрілих дерев репродуктивного віку зумовлений достовірним визначенням фенотипу материнської рослини. При відборі як джерел експлантів таких дерев найкращі результати (найбільш близький прототип пропонованого способу) отримали Y. Youn, К. Ishii, A. Saito, K. Ohba [20]. Найвища частка ініціації експлантів становила 91,3 % (середовище WPM, доповнене 5,0 мг/л 6-ВА), намноження - отримали 5,2 адвентивних пагонів на експлант (SN) за 4 тижні (середовище WPM, доповнене 0,2 мг/л 6-ВА), вкорінення регенерантів - 63,6 %(середовище ½ IS, доповнене 3,0 мг/л IB А і 0,1 мг/л NAA). На нашу думку, отримана методика не є достатньо ефективною для масового отримання садивного матеріалу липи серцелистої із цінними генотипами. Тому в основу корисної моделі поставлено задачу підвищити частку ініційованих і вкорінених рослин та збільшити коефіцієнт намноження адвентивних пагонів, що дасть змогу прискорити терміни і підвищити ефективність продукування регенерантів in vitro. Апробацію запропонованого способу розмноження здійснювали в лабораторії культури тканин Національного лісотехнічного університету України (м. Львів). Джерелами експлантів слугували дерева липи серцелистої репродуктивного віку. Суть способу полягає у культивуванні експлантів липи серцелистої на модифікованому твердому поживному середовищі Р24 [15] для листяних деревних рослин. Пагони відбирали на початку літа - протягом їх найактивнішого приросту. Для отримання конусів наростання як експланти використовували бруньки розміром більше 5 мм. Бруньки розбирали до конусів наростання з листковими зачатками, деконтамінували та асептично переносили на тверде поживне середовище Р24 без фітогормонів. Після отримання стерильних експлантів їх пасажували (вертикально) на модифіковане поживне середовище Р24 для ініціації органогенезу. Модифікація середовища Р24 полягала у введенні в його склад 2,0 мг/л гліцину; 30 г/л цукрози; підвищенні вмісту вітаміну В6 до 1,0 мг/л (на етапах ініціації та намноження), вітаміну В1 до 0,3 мг/л (на етапі ініціації) та 0,4 мг/л (на етапі намноження); нікотинової кислоти до 1,0 мг/л (на етапах ініціації та намноження). Для ризогенезу середовище Р24 модифікували зменшенням вдвічі концентрації компонентів (½ Р24), доповненням 2,0 мг/л гліцину і 30 г/л цукрози. Середовище для кожного етапу готували з додаванням 0,7 г/л агару. Десятинний логарифм концентрації водневих іонів рH середовища перед автоклавуванням доводили до 5,8 (на етапі ініціації) та 6,2 (на етапах намноження та вкорінення). На кожному етапі культивування у середовище долучали регулятори росту 6-ВА (6-бензиламінопурин), NAA (-нафтил оцтову кислоту) та ІВА (-індоліл-3-масляну кислоту) у відповідних концентраціях (табл. 1). Експланти вирощували за температури 24 °C вдень і 21 °C вночі, вологості повітря 65 % і тривалості світлового періоду 12 год. Освітлення здійснювали вночі флуоресцентними лампами (ЛБ) з інтенсивністю світла 2400-2500 1 х. Протягом всього циклу розмноження регенеранти кожних два тижні переносили на свіже поживне середовище. Активацію меристем зафіксовано на 13-14-ту добу культивування (фіг. 1). Після 28 дня Ініціації регенеранти переносили на середовище для намноження. Субкультивування здійснювали 4-6 разів, кожне - по 28 днів (фіг. 2). У кінці кожного нового субкультивування вираховували кількість регенерованих мікропагонів на експлант (SN). Мікроживці розміром більше 2,0 см пасажували на середовище для ризогенезу (фіг. 3). 1 UA 78975 U Таблиця 1 Склад модифікованого поживного середовища Р24 Компоненти KNO3 Ca(NO3)22Н2О K2SO4 KН2РО4 Mg(NO3)26Н2О NH4H2PO4 Myo-inositol Thiamin-HCl Nicotinic acid Piridoxin-HCl Arginin-HCl NaCl H3BO3 MnSO4H2O ZnSO47H2O Kl Na2MoO4 CuSO45H2O CoCl26H2O NiCl26H2O FeNaEDTA FeCl3 Glycin 6-BA NAA IBA Agar Szacharoz 5 10 Концентрація [Teasdale (1992)], мг/л 253 661 436 408 192 144 100 0,1 0,5 0,5 400 5,8 7,44 3,38 11,5 0,6 0,0425 2,5 0,05 0,0476 42,35 8,1 R. Концентрації на етапах намноження, ініціації, мг/л вкорінення, мг/л мг/л 253 253 126,5 661 661 330,5 436 436 218 408 408 204 192 192 96 144 144 72 100 100 50 0,3 0,4 0,05 1,0 1,0 0,25 1,0 1,0 0,25 400 400 200 5,8 5,8 2,9 7,44 7,44 3,72 3,38 3,38 1,69 11,5 11,5 5,75 0,6 0,6 0,3 0,0425 0,0425 0,02125 2,5 2,5 1,25 0,05 0,05 0,025 0,0476 0,0476 0,0238 42,35 42,35 21,175 8,1 8,1 4,05 2,0 2,0 2,0 0,5 0,5 0,2 0,1 мг/л 2,0 мг/л 7000,0 7000,0 7000,0 30000,0 30000,0 30000,0 Укорінені регенеранти відмивали від середовища і переносили для адаптації в ґрунтових умовах у стерильний субстрат міні-теплиці лабораторії. Субстрат складався з дезінфікованого легкосуглинкового ґрунту, торфу та агроперліту у пропорції 3:1:1 (фіг. 4). Після адаптації в умовах підвищеної вологості міні-теплиці регенеранти висаджували у відкритий ґрунт. Дослідження засвідчили (табл. 2), що запропонований спосіб розмноження дає змогу отримати регенеранти липи серцелистої за короткі терміни, підвищує частку ініційованих і вкорінених рослин відповідно до 93,9 та 98,4 %, збільшує намноження адвентивних пагонів до 6,3 шт. на експлант, а тому є ефективнішим у порівнянні з аналогами. Таблиця 2 Регенерація липи серцелистої in vitro запропонованим способом розмноження Етапи клонування Ініціація Намноження Вкорінення Вихід регенерованих рослин Запропонований спосіб Прототип [20] 93,9 % 91,3 % SN=6,3 SN=5,2 98,4 % 63,6 % 2 UA 78975 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Це дає підстави для використання запропонованого способу розмноження in vitro для масового продукування садивного матеріалу липи серцелистої із цінними генотипами. ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ: 1. Chalupa V. Effect of benzylamlnopurine and thidiazuron on in vitro shoot proliferation of Tilia cordata Mill., Sorbus aucuparia L. and Robinia]pseudoacacia L. / V. Chalupa // Biologia Plantarum. Springer Science+Busiriess Media B.V., Formerly Kluwer Academic Publishers B.V., 1987. - Vol. 29, № 6. - Pp. 425-429. - ISSN 0006-3134. 2. Chalupa V. In vitro propagation of Oak (Quercus robur L.) and Linden (Tilia cordata Mill.) / V. Chalupa // Biologia Plantarum. - Springer Science+Business Media B.V., Formerly Kluwer Academic Publishers B.V., 1984. - Vol. 26, № 5. - Pp. 374-377.-ISSN 0006-3134. 3. Chalupa V. Indukce somatickych embryi u lipy maloliste {Tilia cordata МІН.) а jejich konverze v rostliny: Sbornik konference CZU "Reprodukce genovych zdroju lesnich dfevin metodami in vitro", 11.12.2001 / V. Chalupa, A. Brezinova. - Praha: Ceska zemedelska univerzita v Praze, 2001. - S. 2-3ISBN 80-213-0864-8. 4. Chalupa V. Plant regeneration by somatic embryogenesis from cultured immature embryos of oak (Quercus robur L.) and linden (Tilia cordata Mill.) / V. Chalupa // Plant cell reports. - Springer Verlag, 1990. - Vol. 9, № 7, - Pp. 398-401. -ISSN 0721-7714. 5. Chalupa V. Rozmnozovani lipy (Tilia cordata Mill.), akatu (Robinia pseudoacacia L.) a jerabu {Sorbus aucuparia L.) in vitro a rust stromu vypestovanych in vitro I V. Chalupa // Lesnictvi. - PrahaZbraslav (CSFR): Ceskoslovenska Akademie Zemedelska Ustav Vedeckotechnickych Informaci pro Zemedelstvi, 1988. -Vol. 34. - Pp. 705-720. - ISSN 0024-1105. 6. Chalupa V. Somatic embryogenesis in linden {Tilia spp.) / V. Chalupa // Somatic embryogenesis in woody plants / S.M. Jain, P.K. Gupta, R.J. Newton (eds). - London: Kluwer Academic Publishers, 1999. - Vol. 5. - Pp. 31-43. - ISBN 0-7923-5553-9. 7. Chalupa V. Somaticka embryogeneze a regenerace rostlin u smrku (Picea abies Ih.l Karst.) a u lipy (Tilia cordata Mill.) / V. Chalupa // Lesnictvi. - Praha-Zbraslav (CSFR): Ceskoslovenska Akademie Zemedelska Ustav Vedeckotechnickych Informaci pro Zemedelstvi, 1991. - Vol. 37, № 12. - Pp. 10251033. - ISSN 0024-1105. 8. Chalupa V. Uslechtilych listnacu a jejich rozmnozovani metodami in vitro / V. Chalupa // Lesnicka prace. - Praha: Lesnicka prace, s. r. o., 2001. - T. 80, № 12. - S. 555-557.-ISSN 0322-9254. 9. Chalupa V. Vegetativni mnozeni dubu (Quercus robur L.), lipy (Tilia cordata Mill.) a jerabu (Sorbus aucuparia L.) in vitro I V. Chalupa // Lesnictvi. - Praha-Zbraslav (CSFR): Ceskoslovenska Akademie Zemedelska Ustav Vedeckotechnickych Informaci pro Zemedelstvi, 1984. - Vol. 30. - Pp. 1019-1028. - ISSN 0024-1105. 10. Chalupa V. Vegetativni rozmnozovani dubu (Quercus robur L.), buku (Fagus sylvativa L.) a lipy (Tilia cordata Mill.) rizky a explantatovymi kulturami / V. Chalupa // Lesnictvi. - Praha-Zbraslav (CSFR): Ceskoslovenska Akademie Zemedelska Ustav Vedeckotechnickych Informaci pro Zemedelstvi, 1990. - Vol. 36, № 7. - Pp. 589-598. -ISSN 0024-1105. 11. Hayrynen R, Metsalehmus ja sen mikrolisays [Sahkoinen resurssi] / Rauli Hayrynen // Ammatti. - Lepaa, 2011.-33 s. - Kayttotavasta: https://publications.theseus.f^itstream/handle/l 0024/27018/Hayrynen_Rauli.pdf?seq uence=1. 12. Karkonen A. Anatomical study of zygotic and somatic embryos of Tilia cordata /Anna Karkonen // Plant cell, tissue and organ culture. - Kluwer Academic Publishers (Netherlands), 2000. Vol. 61. -P. 205-214. - ISSN 0167-6857. 13. Karkonen A. Plant tissue cultures as models for tree physiology: somatic embryogenesis of Tilia cordata and lignin biosynthesis in Picea abies suspension cultures as case studies [Electronic resource] /Anna Karkonen. - Helsinki: University of Helsinki, 2001.-89 p, - Mode of access http:// ethesis.helsinki.fi. - ISBN 952-10-0272-7 (PDF).: 14. Kunneman B.P.A.M., Albers M.RJ. Linden trees (Tilia spp.)/ B.P.A.M. Kunneman, M.RJ. Albers // Biotechnology in Agriculture and Forestry. - Ed by Y.P.S. Bajaj. - Berlin-Heidelberg: SpringerVerlag.-1991.- Trees III, Vol. 16. - P. 152-163. - ISBN 978-3-540-52576-9. 15. Patent № Europe 92902531.0. Formulation of plant culture media and applications therefore [Текст] / R. Teasdale; International publication № WO 92/07460; Filing Date 04.11.1991; Publication Date 14.05.1992. - Queensland, Australia: Forbio Pty Ltd., 1992.-10 P. 16. Pinker I. Rooting and acclimatization of in vitro propagated shoots of Tilia cordata 'Wega' / I. Pinker, H.-H. Jesch, A. Klausch // Gartenbauwissenschaft. - Deutsch: Organ of the Reichsarbeitsgemeinschaft Garten-und Weinbau, 1995. - Vol. 60, № 6. - Pp. 253-258. - ISSN 0016478X. 3 UA 78975 U 5 10 15 17. Pinker I. Einfluss der temperatur auf die vermehrung und sprossentwicklung in vitro von Prunus glandulosa und Tilia cordata 11. Pinker // Gartenbauwissenschaft. -Stuttgart: Verlag Eugen Ulmer GmbH & Co., 2002. - № 67 (5). - S. 182-189. - ISSN 0016-478X. 18. Salonen M. Micropropagation of Tilia cordata Miller [Text] / M. Salonen, S. Salonen, S. Vahhakoski // Physiologia Plantarum (Conference 17. Congress of the Scandinavian Society for Plant Physiology, Elsinore (Denmark), 7-12 Aug. 1994),1994.-Vol. 91, № 3.-P. All.-ISSN 0031-9317. 19. Sarvasovd I. In vitro regeneration of European linden /1. Sarvasova, J. Durkovic // Biologia Plantarum. - Springer Science+Business Media B.V., Formerly Kluwer Academic Publishers B.V., 2002. - Volume 45, Number 1. - Pp. 149-152. - ISSN 0006-3134. 20. Youn Y. In vitro plantlet regeneration from axillary buds of mature trees of Tilia cordata I Y. Youn, K. Ishii, A. Saito, K. Ohba // Journal of the Japanese Forestry Society. - Tokyo: Japanese Forestry Society, 1988. - Vol. 70, № 7-Pp. 315-317. -ISSN 0021-485X. 21. Олексійченко КО. Особливості введення в культуру in vitro липи серцелистої (Tilia cordata Mill.) [Електронний ресурс] / Н.О. Олексійченко, А.А. Клюваденко, О.Ю. Чорнобров, М.О. Остапчук // Науковий вісник НУБІП України.-2010. - Вип. 152, ч. 2. - Режим доступу до журн.: http://www.nbuv.gov.ua/portal/chemJMol/nvnau/2010_152_2/zmist.html. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 35 Спосіб розмноження липи серцелистої in vitro, який охоплює ініціацію, намноження (мультиплікацію), вкорінення (ризогенез) та адаптацію до ґрунтових умов, який відрізняється тим, що у продукуванні садивного матеріалу липи серцелистої застосоване модифіковане тверде поживне середовище Р24 для листяних деревних рослин із експериментально підібраними оптимальним вмістом і концентрацією регуляторів росту та рН середовища: KNO3 253 мг/л, Ca(NO3)2×2H2O - 661 мг/л, K2SO4 - 436 мг/л, KН2РО4 - 408 мг/л, Mg(NO3)26H2O - 192 мг/л, NH4H2PO4 - 144 мг/л, myo-inositol - 100 мг/л, arginin-HCl - 400 мг/л, NaCl - 5,8 мг/л, Н3ВО3 7,44 мг/л, MnSO4H2O - 3,38 мг/л, ZnSO47H2O - 11,5 мг/л, Kl - 0,6 мг/л, Na2MoO4 - 0,0425 мг/л, CuSO45H2O - 2,5 мг/л, СоСl26Н2О - 0,05 мг/л, NiCl26H2O - 0,0476 мг/л, FeNaEDTA - 42,35 мг/л, FeCl3 - 8,1 мг/л, agar - 7 г/л, szacharoz - 30 г/л; для ініціації модифікація поживного середовища Р24 (рН = 5,8) полягала у підвищенні вмісту вітамінів: thiamin-HCl - до 0,3 мг/л, nicotinic acid - до 1,0 мг/л, piridoxin-HCl - до 1,0 мг/л; додатковому залученні 0,5 мг/л 6-ВА, 0,2 мг/л NAA, 2,0 мг/л glycin; для намноження модифікація поживного середовища Р24 (рН = 6,2) полягала у підвищенні вмісту вітамінів: thiamin-HCl - до 0,4 мг/л, nicotinic acid - до 1,0 мг/л, piridoxin-HCl - до 1,0 мг/л; додатковому залученні 0,5 мг/л 6-ВА і 2,0 мг/л glycin; для вкорінення тверде поживне середовище Р24 (рН = 6,2) модифікували зменшенням вдвічі вмісту компонентів і додатковим залученням 0,1 мг/л NAA, 2,0 мг/л ІВА та 2,0 мг/л glycin. 40 4 UA 78975 U 5 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethod for propagating small-leaved lime (tilia cordata mill.) in vitro
Автори англійськоюHrechanyk Ruslan Marianovych
Назва патенту російськоюСпособ размножения in vitro липы сердцелистной (tilia cordata mill.)
Автори російськоюГречаник Руслан Марьянович
МПК / Мітки
МПК: A01H 4/00
Мітки: спосіб, mill, розмноження, vitro, cordata, липи, тіліа, серцелистої
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/7-78975-sposib-rozmnozhennya-in-vitro-lipi-sercelisto-tilia-cordata-mill.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб розмноження in vitro липи серцелистої (tilia cordata mill.)</a>
Попередній патент: Спосіб сушіння деревини
Наступний патент: Підставка для карамельок “ялинка”
Випадковий патент: Макролідні похідні, спосіб їх одержання та їх терапевтичне застосуваня