Спосіб індукції окислювальної деструкції барвника methyl orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета pleurotus eryngii (dc.) quel. p-er

Реферат: UA 91406 U UA 91406 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі екології, біотехнології та мікології і може бути використана для деструкції відходів різних галузей промисловості і сільського господарства. Останнім часом, через високі темпи росту промислового виробництва, утворюється велика кількість високо- та низькотоксичних відходів, що мають слабку біодоступність. Це ксенобіотики - чужорідні для живих організмів хімічні речовини, що природно не входять до біотичного кругообігу. Серед таких речовин значна кількість представлена фенольними сполуками. Наприклад, метилоранж Methyl Orange (CAS 547-58-0) - поширений органічний барвник, широко використовуваний в промисловості [6]. Отже, одна з найбільш актуальних проблем сьогодення - раціональне природокористування, зокрема, утилізація промислових відходів. Базидіальні ксилотрофи - еволюційно найбільш молоде угрупування грибів з надзвичайно потужним ферментним комплексом, здатним до руйнування складного та хімічно стійкого лігноцелюлозного комплексу деревини. Робота цих ферментів тісно взаємопов'язана з функціонуванням прооксидантно-антиоксидантної системи ксилотрофів. Остання генерує активовані форми кисню, зокрема ліпоперекисні радикали, які є модуляторами процесів біодеградації [1, 8]. Отже, є перспективним залучення ксилотрофних базидіоміцетів до процесів біоремедіації забруднених середовищ і розкладання нових промислово утворених речовин [1, 4]. Відомий спосіб індукції перекисного окиснення ліпідів штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod., що включає культивування при 27,5 °C на глюкозо-пептонному середовищі та визначення рівня перекисного окиснення ліпідів в міцелії та культуральному фільтраті, який відрізняється тим, що штам 167 культивують на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі з сахарозою [2]. В способі не розроблені методи індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом, не надається даних щодо можливості використання високоактивного продуценту екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів - штаму дереворуйнівного базидіоміцета P. eryngii P-er. Відомий спосіб індукції лігнолітичних ферментів, наприклад, лакази, за яким можуть застосовуватися різноманітні сполуки [7]. В способі не розроблені методи індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange, не надається даних щодо можливості використання високоактивного продуценту екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів штаму дереворуйнівного базидіоміцета P. eryngii P-er. Найбільш близький за технічною суттю і досягуваним результатом є інтродукований штам Per гриба Pleurotus eryngii (DC.) Quél., який має високу інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів в культуральній рідині при глибинному культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 25,0 °C протягом 6-ти діб на лабораторній качалці [3]. Штам P-er їстівного базидіального гриба Pleurotus eryngii (DC.) Quél. є високоактивним продуцентом екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів і може бути використаний для деструкції відходів різних галузей промисловості і сільського господарства. Для штаму розроблено спосіб глибинного культивування, не розроблені методи індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом. В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange культуральним фільтратом штаму Pleurotus eryngii (DC.) Quél. P-er, в якому визначається ефективність окислювальної деструкції модельної сполуки барвника Methyl Orange культуральним фільтратом цього базидіоміцету, який культивували на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі, за рахунок чого досягається підвищення ефективності окислювальної деструкції барвника Methyl Orange, що може бути використано в екології, біотехнології та мікології. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Pleurotus eryngii (DC.) Quél. P-er включає культивування глибинним методом на глюкозо-пептонному середовищі при 25,0 °C протягом 6-ти діб на лабораторній качалці, згідно з корисною моделлю, штам культивується на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі, яке містить у наступні компоненти: лігносульфонат - 5,0 г; Твін-80-1,0 г; розчин мінеральних елементів Кірка - 70 мл; пептон - 4,0 г; глюкоза - 7,5 г; KН2РО4-0,6 г; K2НРО4-0,4 г; дистильована вода - до 1 літра. Це дозволяє здійснити індукцію окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом P. eryngii P-er в 16,1 разу. Запропонований спосіб індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange культуральним фільтратом базидіоміцетів є новим тому, що він є невідомим з об'єкта дослідження та складу живильного середовища. Приклад конкретного виконання. В цьому прикладі описується культивування штаму P. eryngii P-er на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі (ГПС) і визначення ростових 1 UA 91406 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 показників та ефективності окислювальної деструкції барвника Methyl Orange культуральним фільтратом (ЕД) цього штаму. Для визначення ростових показників та ЕД, штам культивують глибинним методом на модифікованому ГПС об'ємом 50 мл. Готують модифіковане ГПС наступного складу: лігносульфонат 5,0 г Твін-80 1,0 г розчин мінеральних 70 мл елементів Кірка [9] пептон 4,0 г глюкоза 7,5 г KН2РО4 0,6 г K2НРО4 0,4 г дистильована вода до 1 літра. Водневий показник середовища становить 6,70 од. Підготовлене живильне середовище розливають по 50 мл в колби з шилоподібними відбійниками ємністю 250 мл та стерилізують в автоклаві при 126±2 °C протягом 45 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації складає 6,62. Після охолодження середовище інокулюють у стерильних умовах шматочком міцелію розміром 5×5 мм з робочої культури. Інокулюмом є чиста культура штаму Р-er, яка росла 7-10 діб на 4° за Баллінгом агаризованому незахміленому пивному суслі або на картопляноглюкозному агарі [5]. Культивування здійснюється глибинним методом при оптимальній температурі для росту P. eryngii Р-er-25 °C на лабораторній качалці зі зворотно-поступальним рухом з частотою 120 коливань за хвилину протягом 7-ми діб. Оптимальний режим роботи лабораторної качалки визначено експериментально для встановлених умов і мети ферментації. Проводять контроль чистоти інокулюму за допомогою світлового мікроскопа, наприклад XS5520 MICROmed. Невелику кількість культуральної рідини асептично вилучають з колби, переносять на предметне скло, висушують, фіксують та забарвлюють розчином метиленового синього, промивають, сушать та мікроскопують при збільшенні 16×100. Розглядають септований міцелій, виявляють пряжки, характерні для базидіоміцетів; констатують відсутність бактеріальних клітин. Для здійснення основної стадії культивування P. eryngii P-er використовують колби без відбійників ємністю 250 мл зі стерильним ГПС об'ємом 50 мл. Готують, розливають та стерилізують ГПС аналогічно до першої стадії культивування. У культиваційні колби асептично вносять 5 мл інокулюму за допомогою стерильної піпетки з бавовняним фільтром. Термін культивування глибинним методом складає 6 діб при 25 °C на лабораторній качалці зі зворотно-поступальним рухом з частотою 120 коливань за хвилину. Наприкінці ферментації міцелій P. eryngii P-er має вигляд пелет сферичної форми. Їх розмір становить 3-6 мм. Поверхня пелет рівна, колір - білий. Міцелій відділяють від культуральної рідини, отримуючи таким чином культуральний фільтрат (КФ). Міцелій промивають дистильованою водою, визначають концентрацію біомаси ваговим методом. Для цього визначений об'єм посівного матеріалу (5-10 мл) поміщають на щільну капронову тканину, промивають дистильованою водою, висушують у відкаліброваних бюксах при 105 °C до постійної маси та зважують. Для визначення ефективності окислювальної деструкції речовин вибрано модельну сполуку - широко використовуваний барвник Methyl Orange, що належить до класу азобарвників. Визначену кількість КФ (дослід) чи живильного середовища (контроль) додають до 0,001 % розчину Methyl Orange в натрій-ацетатному буфері. Водневий показник реакційної суміші становить 4,4 од. Проби інкубують при +40 °C протягом 48 годин. Після цього встановлюють рН реакційної суміші на рівні 3,1 од. за допомогою натрій-ацетатного буферу. Вимірюють оптичну густину розчину при довжині хвилі 506 нм. Ефективність деструкції розраховують за формулою: Е  Ед ЕД   100 % Е , де Ек, Ед - оптична густина контрольної і дослідної проби відповідно. Досліди проводять у трикратній повторності. Отримані експериментальні дані обробляють з використанням Microsoft Excel та пакету програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Результати індукції окислювальної деструкції барвника 2 UA 91406 U Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Pleurotus eryngii (DC.) Quél. P-er представлено в таблиці. Таблиця Ефективність окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Pleurotus eryngii (DC.) Quél. P-er на різних за складом живильних середовищах Середовище ГПС [3] Модифіковане ГПС 5 10 15 20 25 30 35 ЕД, % 2,72±1,91 43,84±1,25 АСБ, г/ л 3,65±0,22 4,95±0,22 Таким чином, завдяки модифікації складу ГПС спостерігається індукція окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Pleurotus eryngii (DC.) Quél. P-er, яка була в 16,1 разу вищою за цей показник на стандартному ГПС. Запропонований спосіб індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Pleurotus eryngii (DC.) Quél. P-er не потребує дорогих живильних середовищ, є новим у виконанні, доступним і легко здійснюваним. Джерело інформації: 1. Капич А.Н. Сопряжение перекисного окисления липидов с деградацией лигнина у дереворазрушающих базидиомицетов / А.Н. Капич // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр. - 2011. - Т. 3. - С. 316-335. 2. Пат. 66659 України. Спосіб індукції перекисного окиснення ліпідів штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod / Федотов О.В. Чайка О.В., Фоменок Д.В., Гербутова А.В. Заявка № u201108067, від 29.06.2011, МПК (2011.01), кл. A01G7/00, А01Н15/00 Бюл. № 1, від 10.01.2012. 3. Пат. 78482 України. Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета Pleurotus eryngii (Dc.) Quél. P-er - продуцент екзопродуктів перекисного окиснення ліпідів / Чайка О.В., Федотов О.В. Заявка № u201208872, від 18.07.2012, МПК (2006.01), кл. A01G 1/04 Бюл. № 6, від 25.03.2013 (прототип). 4. Рабинович М.Л. Разложение природных ароматических структур и ксенобиотиков грибами (обзор) / М.Л. Рабинович, А.В. Болобова, Л.Г. Васильченко // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - 40, № 1. - С. 5-23. 5. Соломко Е.Ф. Ріст окремих видів лікарських макроміцетів на поживних середовищах різного складу / Е.Ф. Соломко, М.Л. Ломберг, Н.Ю. Митропольська, О.В. Чоловська // Укр. ботан. журн. - 2000. - Т. 57, № 2. - С. 119-125. 6. Федотов О.В. Вплив бензопірену на інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів штаму Pleurotus ostreatus P-107 / О.В. Федотов, О.В. Чайка, О.Г. Метрусенко // Проблеми екології та охорони природи техногенного регіону. - Донецьк, ДонНУ, 2012. - № 1 (12). - С. 252257. 7. Eggert C. The Ligninolytic System of the White Rot Fungus Pycnoporus cinnabarinus: Purification and Characterization of the Laccase / C. Eggert, U. Temp, K.L Eriksson. // Applied and Environmental Microbiology. - 1996. - 62 (4). - P. 1151-1158. 8. Hammel K.E. Reactive oxygen species as agents of wood decay by fungi / K.E. Hammel, A.N. Kapich, K.A.Jr. Jensen, Z.C. Ryan // Enzyme and Microbial Technology. - 2002. - 30. - P. 445-453. 9. Kirk K.T. Production of multiple ligninases by Phanerochaete chrysosporium, effect of selected growth conditions and the use of a mutant strain / K.T. Kirk, S. Croan, M. Tien, K.E. Murtagh, R.L. Farrell // Enzyme Microbiol Technol.-1986.-8. - P. 27-32. 40 3 UA 91406 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Pleurotus eryngii (DC.) Quél. P-er, що включає культивування глибинним методом на глюкозо-пептонному середовищі при 25,0 °C протягом 6-ти діб на лабораторній качалці, який відрізняється тим, що штам культивують на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі, яке містить наступні компоненти: лігносульфонат 5,0 г Твін-80 1,0 г розчин мінеральних елементів 70 мл Кірка пептон 4,0 г глюкоза 7,5 г KН2РО4 0,6 г K2НРО4 0,4 г дистильована вода до 1 літра. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4