Спосіб деструкції анілінового барвника (с.і. 27950) з використанням базидіоміцету agrocybe cylindracea

Реферат: Спосіб деструкції анілінового барвника (С.І. 27950) з використанням базидіоміцету Agrocybe cylindracea включає культивування штамів мікроорганізмів та внесення біопрепарату у водний розчин полютанту. Культивують штам Agrocybe cylindracea 167 на середовищі з додаванням анілінового барвника (С.І. 27950) в кількості 0,2865 г/л, 0,1433 г/л, 0,0573 г/л, 0,0287 г/л або вносять в водний розчин анілінового барвника (С.І. 27950) в кількості 0,0287 г/л та міцелію в кількості від 1 до 3 г/л в перерахунку на абсолютно суху масу. UA 82087 U (54) СПОСІБ ДЕСТРУКЦІЇ АНІЛІНОВОГО БАРВНИКА (С.І. 27950) З ВИКОРИСТАННЯМ БАЗИДІОМІЦЕТУ AGROCYBE CYLINDRACEA UA 82087 U UA 82087 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікології і біотехнології та може бути використана у різних галузях промисловості з метою очищення стічних вод, що містять анілінові барвники. Наявність в стічних водах підприємств різних галузей промисловості хімічних забруднювачів у високих концентраціях створює значні труднощі при їх очищенні та є серйозною екологічною проблемою. Мікроорганізми активного мулу біологічних очисних споруд продуктивні в процесах переробки господарсько-побутових стоків, але є малоефективними при знешкодженні інших ксенобіотиків [8]. Перспективним способом вирішення цієї проблеми є використання організмів (зокрема і мікологічних), що характеризуються стійкістю до дії ксенобіотиків та здатністю до їх деструкції. Одним з основних типів забруднювачів у текстильній і харчовій галузях промисловості та медицині є високотоксичні анілінові синтетичні барвники, що застосовуються для фарбування виробів та тканин. Дослідження показали, що анілін є субстратом ферменту пероксидази, яка здатна окислювати його до нітробензолу, який, в свою чергу, легко піддається повній детоксикації [4]. Базидіальний гриб Agrocybe cylindracea є малодослідженим та перспективним у біотехнології отримання комерційних плодових тіл [Ломберг]. Скринінгові дослідження показали можливість використання штаму 167 їстівного базидіального гриба Agrocybe cylindracea (Brig.) Fayod. як високоактивного продуцента екзо- і ендопероксидаз у біотехнології отримання ферменту пероксидази мікологічного походження [1]. Відомий спосіб біологічного очищення стічних вод від фенолу. Очищення здійснюють шляхом спільного і одночасного окиснення фенолів активним мулом та пероксидом водню. Не наводиться даних щодо очищення стічних вод від анілінових барвників та використання в очисних спорудах базидіальних грибів [7]. Відомий спосіб очищення стічних вод від барвників та/або органічних речовин, що містять сульфогрупи. Стічні води обробляють при рН 9,5-11,5 водорозчинною сіллю дво- або тривалентного металу в масовому співвідношенні з інгредієнтами 4:1-15:1, нейтралізують до рН 6,5-8,5 та піддають механічному очищенню з подальшим ультрафільтраційним розділенням. Не наводиться даних щодо очищення стічних вод від анілінових барвників та використання в очисних спорудах базидіальних грибів [6]. Найбільш близький за технічною суттю і досяжності результату є спосіб очищення об'єктів довкілля від нафтопродуктів. Використовуються нові штами бактерій - деструкторів нафтопродуктів, здатних рости в широкому діапазоні температур і рН середовища, а також при підвищених температурах на середовищах, що містять як джерело вуглецю н-парафіни широкої фракції, дизельне паливо, сиру нафту, мазут, масла, ароматичні вуглеводні. Штами можуть бути використані для очищення від нафтозабруднень різних ємностей, водних поверхонь, ґрунтів, стічних вод нафтопереробної, металургійної, машинобудівної, харчової промисловості, при виробництві мила, фарб, парфумерно-косметичних засобів. Суть застосування: отримання біопрепаратів на основі штамів Acinetobacter valentis subspecies paraffinicum; МКПМ-В-6727 Н-1; МКПМ-В-6728 G-1; МКПМ-В-6726 С-2, зростаючих при температурі 10-50 °C, в широкому 1 діапазоні рН 5,5-8,5 при швидкості протоку середовища D=0,25-0,33 год.- . Не надаються дані щодо очищення стічних вод від анілінових барвників та використання в очисних спорудах базидіальних грибів [5]. В основу корисної моделі поставлено задачу розробки способу деструкції анілінового барвника (С.І. 27950) з використанням базидіоміцети Agrocybe cylindracea, який відрізняється від прототипу природою забруднювача та видовою приналежністю організму-деструктора, який є новим за організмом-деструктором, дешевим та доступним за технологією при використанні в очисних спорудах промислових підприємств, відходи яких містять цей барвник. Поставлене задача вирішується тим, що спосіб деструкції анілінового барвника (С.І. 27950) з використанням базидіоміцету Agrocybe cylindracea, який включає культивування штамів мікроорганізмів та внесення біопрепарату у водний розчин полютанту, який відрізняється тим, що культивують штам Agrocybe cylindracea 167 на середовищі з додаванням анілінового барвника (С.І. 27950) в кількості 0,2865 г/л, 0,1433 г/л, 0,0573 г/л, 0,0287 г/л або вносять в водний розчин анілінового барвника (С.І. 27950) в кількості 0,0287 г/л та міцелію в кількості від 1 до 3 г/л в перерахунку на абсолютно суху масу. Приклад конкретного виконання 1. Деструкція анілінового барвника (С.І. 27950) з використанням базидіоміцету Agrocybe cylindracea. Штам 167 культивують поверхнево в колбах Ерленмейєра ємністю 250 мл на глюкозопептонному середовищі (ГПС - контроль) об'ємом 50 мл протягом 12 діб при 27,5 °C. Готують ГПС наступного складу, г/ л [3]: 1 UA 82087 U 5 10 15 20 25 глюкоза 10,0; пептон 3,0; КН2РО4 0,6; К2НРО4 0,4; 0,5; MgSO47H2O СаСl2 0,05; 0,001; ZnSO47H2O дистильована вода до 1 літра. Співвідношення C:N дорівнює 13:1. рН становить 6,5±0,2. Як інокулюм використовують 10-денні міцеліальні культури штаму 167 на сусло-агарі. Стічні води текстильної промисловості до обробки містять аніліновий барвник (С.І. 27950) у концентрації 0,2865 г/л [8]. Виходячи з цього, до стандартного глюкозо-пептонного живильного середовища додають аніліновий барвник (С.І. 27950) у наступних концентраціях: 0,2865 г/л, 0,1433 г/л, 0,0573 г/л, 0,0287 г/л, тобто розведення основної концентрації у 2, 5 та 10 разів. Барвник додають до середовища до початку культивування. Термін культивування складає 12 діб. Строк та температуру ферментації вибрано, виходячи з результатів попередніх досліджень, в яких виявлено, що максимуми ПА припадають на період експоненціального росту культури при 27,5 °C. Вибраний термін росту, також, пояснюється недоцільністю довгострокового культивування продуцентів. Абсолютно суху біомасу (АСБ) міцелію визначають ваговим методом [2]. Визначення ферментативної активності у міцелії (на одиницю маси, г) та культуральному фільтраті (на одиницю об'єму, мл) проводять на 12-ту добу культивування. Матеріалами для досліджень є гомогенізований міцелій (МГ) та культуральний фільтрат (КФ), які готують наступним чином. Міцелій при 5±1 °C відділяли від культуральної рідини шляхом фільтрування. Отриманий міцелій додатково підсушували на фільтрувальному папері і охолоджували до 1±0,5 °C. Підготовлений міцелій гомогенізували шляхом розтирання у охолодженій ступці, а потім розводили дистильованою водою у співвідношенні 1 до 10 та центрифугували протягом 10 хвилин. Пероксидазну активність у водній витяжці гомогенату міцелію та культуральному фільтраті визначають за методом, який базується на вимірі за допомогою фотоелектроколориметра КФК2, при довжині хвилі 460 нм в кюветі 10 мм, інтенсивності забарвлення продукту окиснення одіанізидину перекисом водню, який утворюється при дії пероксидази. Одиниця активності пероксидази відповідає кількості ферменту, що окиснює 1 мкм о-діанізидину за 1 хвилину. Розрахунки проводять за формулою [9]: X E  V1 p , E1  K  V2  t 30 35 де: X - пероксидазна активність (ум. од.), E - екстинкція, V1 - об'єм забарвленої проби (мл), V2 - об'єм МГ або КФ (г, мл), E 1 - коефіцієнт мікромолярної екстинкції (0,0128), K - коефіцієнт для перерахунку у літри (1000), t - час інкубації (5 хв.), p - коефіцієнт розведення. За показник ступеня деструкції вибрано ефективність знебарвлення (Е зн.) барвника, який розраховують за формулою [10]: E зн.  40 45 С 0  Сі  100 % , С0 де: С 0 - концентрація барвника до деструкції, С і - концентрація барвника після деструкції. Визначення концентрації барвника проводять наступним чином. Готують стандартні розчини барвника з концентраціями від 0,01 до 1,0 г/л, вимірюють їх оптичну щільність за допомогою фотоелектроколориметра за помаранчевим світлофільтром (довжина хвилі 595-625 нм) та будують калібрувальний графік, за допомогою якого визначають концентрацію барвника після деструкції з урахуванням оптичної щільності живильного середовища без барвника. Дослідження проводять у трикратній повторності. Статистичну обробку проводять з використанням програм статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Дані щодо росту, пероксидазної активності та ефективності знебарвлення барвника штамом Agrocybe cylindracea 167 надані у таблиці 1. Зазначається концентрація полютанту, 2 UA 82087 U накопичення АСБ, вихідне (рН0) та наприкінці (рН12) ферментації рН культуральної рідини, рівень ПА та ефективність знебарвлення. Таблиця 1 Пероксидазна активність та ефективність знебарвлення анілінового барвника (С.І. 27950) штаму Agrocybe cylindracea 167 Концентрація анілінового барвника, г/л 0,2865 0,1433 0,0573 0,0287 0 (Контроль) 5 10 15 20 25 2 рН0 рН12 АСБ, г/л 6,02 6,95 6,76 6,68 6,50 5,91 6,54 6,42 6,16 6,46 2,14±0,07 2,11±0,06 3,28±0,10 1,38±0,03 3,22±0,09 ПА10- , ум. од. МГ 21,25±0,71 14,38±0,54 25,00±0,82 25,00±0,65 9,44±0,12 7,06±0,52 9,06±0,60 6,50±0,41 5,31±0,44 7,82±0,46 Езн. % КФ 40,31±1,02 48,09±0,84 58,24±1,56 87,12±2,07 Вивчення пероксидазної активності та ефективності знебарвлення анілінового барвника (С.І. 27950) штаму Agrocybe cylindracea 167 показало, що аніліновий барвник у всіх концентраціях пригнічує швидкість накопичення біомаси шт. Agrocybe cylindracea 167. Виключенням є концентрація 0,0573 г/л, при якій АСБ вірогідно не відрізняється від контролю. Пероксидазна активність міцелію підвищується за дії анілінового барвника (С.І. 27950) у всіх концентраціях порівняно з контролем. Максимальну ПА МГ зафіксовано при концентрації барвника 0,0287 г/л та 0,0573 г/л, що у 2,65 разів перевищує ПА МГ без додавання барвника. Пероксидазна активність культурального фільтрату знижується при додаванні у поживне середовище анілінового барвника (С.І. 27950) у концентраціях 0,0573 г/л та 0,0287 г/л, в 1,16 разу підвищується при концентрації 0,1433 г/л, та вірогідно не змінюється при 0,2865 г/л. Ефективність знебарвлення анілінового барвника (С.І. 27950) є максимальною при найнижчій концентрації барвника у середовищі та дорівнює 87,12 %. З підвищенням концентрації спостерігається зниження ефективності знебарвлення. Крім того, максимуми ефективності знебарвлення та ПА МГ співпадають та відповідають найнижчій концентрації анілінового барвника у поживному середовищі (0,0287 г/л). Приклад конкретного виконання 2. Деструкція анілінового барвника (С.І. 27950) у водному розчині з використанням біомаси базидіоміцету Agrocybe cylindracea. Готують водний розчин анілінового барвника (С.І. 27950) у концентрації 0,0287 г/л концентрація відповідає найвищому рівню ефективності знебарвлення. Вносять до нього міцелій штаму Agrocybe cylindracea 167 у різних кількостях: 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 та 3,0 г/л в перерахунку на АСБ. Інкубують протягом 1, 2 та 3 діб та визначають Е зн за методом прикладу конкретного виконання 1. Результати деструкції анілінового барвника (С.І. 27950) у водному розчині з використанням біомаси базидіоміцету Agrocybe cylindracea представлені в таблиці 2. 30 Таблиця 2 Ефективність знебарвлення анілінового барвника (С.І. 27950) у концентрації 0,0287 г/л міцелієм штаму Agrocybe cylindracea 167 в залежності від часу експозиції міцелію Кількість міцелію, г АСБ/л 1,0 1,5 2,0 Експозиція, год. Езн., % 24 48 72 24 48 72 24 48 72 21,19±0,62 24,02±0,68 30,34±0,78 28,87±0,72 34,16±0,81 44,65±0,86 38,68±0,92 44,40±0,89 47,88±1,02 3 UA 82087 U Продовження таблиці 2 Кількість міцелію, г АСБ/л 2,5 3,0 5 10 15 20 25 30 35 40 Експозиція, год. Езн., % 24 48 72 24 48 72 46,55±1,16 58,19±1,28 64,28±1,04 61,83±1,27 67,28±1,30 72,84±1,48 Вивчення ефективності знебарвлення анілінового барвника (С.І. 27950) у концентрації 0,0287 г/л при внесенні до водного його розчину міцелію штаму Agrocybe cylindracea 167, показало, що максимальна ефективність знебарвлення (72,84 %) відповідає максимальній кількості внесеного міцелію та максимальному часу експозиції - 3,0 г/л міцелію протягом 72 годин. Отже, при внесенні міцелію до водного розчину анілінового барвника спостерігається значний рівень ефективності знебарвлення, що є перспективним для використання в очисних спорудах. Таким чином, запропонований спосіб деструкції анілінового барвника (С.І. 27950) з використанням базидіоміцету Agrocybe cylindracea є новим за організмом-деструктором, дешевим та доступним за технологією при використанні в очисних спорудах промислових підприємств, відходи яких містять аніліновий барвник (С.І. 27950). Джерела інформації:, які використані при укладанні заявки 1. Волошко Т.Є. Скринінг штамів базидіоміцетів за активністю антиоксидантних оксидоредуктаз / Т.Є. Волошко, О.В. Федотов // Мікробіологія і біотехнологія. - Одеса: ОНУ ім. І.І. Мечнікова, 2011. - №. 4(16). - С. 69-81. 2. Государственная Фармакопея СССР. - XI изд. - Вып. 1. - М.: Медицина, 1987.-336 с. 3. Дудка И.А. Методы экспериментальной микологии. Справочник / И.А. Дудка, С.П. Вассер, И.А. Элланская. - К.: Наук, думка, 1982.-550 с. 4. Куликова Н.А. Использование базидиальных грибов в технологиях переработки и утилизации техногенных отходов: фундаментальные и прикладные аспекты (обзор) / Н.А. Куликова, О.И. Кляйн, Е.В. Степанова, О.В. Королева // Прикладная биохимия и микробиология.-2011. - Т. 47,. № 6. - С. 619-634. 5. Патент 2053204 Российской Федерации. Способ очистки объектов окружающей среды от нефтепродуктов / Б.Г. Мурзаков, Г.Н. Морщакова, Л.Н. Капотина. Заявка № 94013001/13, от 12.04.1994, кл. C02F3/34, Е02В15/04, Бюл. № 11 от 27.01.1996. (прототип) 6. Патент 2083509 Российской Федерации. Способ очистки сточных вод от красителей и/или органических веществ, содержащих сульфогруппы / Ю.П. Осадчий, Е.Н. Афанасьева. Заявка № 93001656/25, от 11.01.1993, кл. С 02 1/44, Бюл. № 12 от 20.03.93. 7. Патент 2188164 Российской Федерации. Способ биологической очистки сточных вод от фенола / В.В. Сафронов, А.Е. Кузнецов. Заявка № 2000127572/12, от 03.11.2000, кл. C02F3/02, C02F3/02, C02F101:30, C02F 103:36, Бюл. № 8 от 27.08.2002. 8. Полетаева М.А. Разработка технологии очистки сточных вод от анилина: дис. канд. техн. наук: 25.00.36 / РАН; Алтайский государственный технический университет им. Ползунова. Барнаул, 2003.-110 с. 9. Рогожин В.В. Физиолого-биохимические механизмы прорастания зерновок пшеницы / В.В. Рогожин, Т.В. Рогожина // Вестник Алтайского государственного аграрного университета.-2011. № 8 (82). - С. 17-21. 10. Шалбуев Д.В. Методы очистки сточных вод после процесса крашения. Методическое указание к выполнению лабораторных работ / Д.В. Шалбуев. - Улан-Удэ: ВСГТУ, 2001.-23 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 Спосіб деструкції анілінового барвника (С.І. 27950) з використанням базидіоміцету Agrocybe cylindracea, що включає культивування штамів мікроорганізмів та внесення біопрепарату у водний розчин полютанту, який відрізняється тим, що культивують штам Agrocybe cylindracea 167 на середовищі з додаванням анілінового барвника (С.І. 27950) в кількості 0,2865 г/л, 0,1433 г/л, 0,0573 г/л, 0,0287 г/л або вносять в водний розчин анілінового барвника (С.І. 27950) в кількості 0,0287 г/л та міцелію в кількості від 1 до 3 г/л в перерахунку на абсолютно суху масу. 4 UA 82087 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5