Спосіб індукції окислювальної деструкції барвника methyl orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета flammulina velutipes (curtis) singer f-1105

Реферат: Спосіб індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-1105 включає культивування глибинним методом на глюкозо-пептонному середовищі при 25,0 °C протягом 6 діб на лабораторній качалці. Штам культивується на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі, яке містить лігносульфонат, твін-80, розчин мінеральних елементів Кірка, пептон, глюкозу, KН2РО4, K2НРО4, дистильовану воду. UA 91404 U (54) СПОСІБ ІНДУКЦІЇ ОКИСЛЮВАЛЬНОЇ ДЕСТРУКЦІЇ БАРВНИКА METHYL ORANGE ШТАМОМ ДЕРЕВОРУЙНІВНОГО БАЗИДІОМІЦЕТА FLAMMULINA VELUTIPES (CURTIS) SINGER F-1105 UA 91404 U UA 91404 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до екології, біотехнології та мікології і може бути використана для деструкції відходів різних галузей промисловості і сільського господарства. Останнім часом, через високі темпи росту промислового виробництва, утворюється велика кількість високо- та низькотоксичних відходів, що мають слабку біодоступність. Це ксенобіотики - чужорідні для живих організмів хімічні речовини, що природно не входять до біотичного кругообігу. Серед таких речовин значна кількість представлена фенольними сполуками. Наприклад, метилоранж Methyl Orange (CAS 547-58-0) - поширений органічний барвник, широко використовуваний в промисловості [6]. Отже, одна з найбільш актуальних проблем сьогодення - раціональне природокористування, зокрема утилізація промислових відходів. Базидіальні ксилотрофи - еволюційно найбільш молоде угрупування грибів з надзвичайно потужним ферментним комплексом, здатним до руйнування складного та хімічно стійкого лігноцелюлозного комплексу деревини. Робота цих ферментів тісно взаємопов'язана з функціонуванням прооксидантно-антиоксидантної системи ксилотрофів. Остання генерує активовані форми кисню, зокрема ліпоперекисні радикали, які є модуляторами процесів біодеградації [1, 8]. Отже, є перспективним залучення ксилотрофних базидіоміцетів до процесів біоремедіації забруднених середовищ і розкладання нових промислово утворених речовин [1, 4]. Відомий спосіб індукції перекисного окиснення ліпідів штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod. включає культивування при 27,5 °C на глюкозо-пептонному середовищі та визначення рівня перекисного окиснення ліпідів в міцелії та культуральному фільтраті. Штам 167 культивують на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі з сахарозою [3]. В способі не розроблені методи індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом, не надається даних щодо можливості використання високоактивного продуцента екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів - штаму дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-1105. Відомий спосіб індукції лігнолітичних ферментів, наприклад, лакази, за яким можуть застосовуватися різноманітні сполуки [7]. В способі не розроблені методи індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange, не надається даних щодо можливості використання високоактивного продуцента екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів штаму дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-l 105. Найбільш близький за технічною суттю і досяжністю результату є інтродукований штам F1105 гриба Flammulina velutipes (Curtis) Singer, який має високу інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів в культуральній рідині при глибинному культивуванні на глюкозопептонному середовищі при 25,0 °C протягом 6 діб на лабораторній качалці [2]. Штам F-1105 їстівного базидіального гриба Flammulina velutipes (Curtis) Singer є високоактивним продуцентом екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів і може бути використаний для деструкції відходів різних галузей промисловості і сільського господарства. Для штаму розроблено спосіб глибинного культивування, не розроблені методи індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом. В основу корисної моделі поставлено задачу розробки способу індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange культуральним фільтратом штаму Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-1105, в якому визначається ефективність окислювальної деструкції модельної сполуки - барвника Methyl Orange культуральним фільтратом цього базидіоміцету, який культивували на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі, за рахунок чого досягають підвищення ефективності окислювальної деструкції барвника Methyl Orange, що може бути використано в екології, біотехнології та мікології. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F1105 включає культивування глибинним методом на глюкозо-пептонному середовищі при 25,0 °C протягом 6-ти діб на лабораторній качалці, згідно корисної моделі, штам культивується на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі, яке містить наступні компоненти: лігносульфонат - 3,5 г; твін-80-1,0 г; розчин мінеральних елементів Кірка - 70 мл; пептон - 3,0 г; глюкоза - 7,5 г; KН2РО4-0,6 г; K2НРО4-0,4 г; дистильована вода - до 1 літра. Це дозволяє здійснити індукцію окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом F. velutipes F-1105 в 10,5 разів. Запропонований спосіб індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange культуральним фільтратом базидіоміцетів є новим тому, що він є невідомим з об'єкту дослідження та складу живильного середовища. Приклад конкретного виконання 1 UA 91404 U 5 В цьому прикладі описується культивування штаму F. velutipes F-1105 на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі (ГПС) і визначення ростових показників та ефективності окислювальної деструкції барвника Methyl Orange культуральним фільтратом (ЕД) цього штаму. Для визначення ростових показників та ЕД, штам культивують глибинним методом на модифікованому ГПС об'ємом 50 мл. Готують модифіковане ГПС наступного складу: лігносульфонат твін-80 розчин мінеральних елементів Кірка [9] пептон глюкоза КН2РО4 K2НРО4 дистильована вода 10 15 20 25 30 35 40 45 50 3,5 г 1,0 г 70 мл 3,0 г 7,5 г 0,6 г 0,4 г до 1 літра. Водневий показник середовища становить 6,70 од. Підготовлене живильне середовище розливають по 50 мл в колби з шилоподібними відбійниками ємністю 250 мл та стерилізують в автоклаві при 126±2 °C протягом 45 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації складає 6,62. Після охолодження середовище інокулюють у стерильних умовах шматочком міцелію розміром 5×5 мм з робочої культури. Інокулюмом є чиста культура штаму F-1105, яка росла 710 діб на 4° за Баллінгом на агаризованому незахміленому пивному суслі або на картопляноглюкозному агарі [5]. Культивування здійснюється глибинним методом при оптимальній температурі для росту F. velutipes F-1105-25 °C на лабораторній качалці зі зворотно-поступальним рухом з частотою 120 коливань за хвилину протягом 7 діб. Оптимальний режим роботи лабораторної качалки визначено експериментально для встановлених умов і мети ферментації. Проводять контроль чистоти інокулюму за допомогою світлового мікроскопу, наприклад XS5520 MICROmed. Невелику кількість культуральної рідини асептично вилучають з колби, переносять на предметне скло, висушують, фіксують та забарвлюють розчином метиленового синього, промивають, сушать та мікроскопують при збільшенні 16×100. Розглядають септований міцелій, виявляють пряжки, характерні для базидіоміцетів; констатують відсутність бактеріальних клітин. Для здійснення основної стадії культивування F. velutipes F-1105 використовують колби без відбійників ємністю 250 мл зі стерильним ГПС об'ємом 50 мл. Готують, розливають та стерилізують ГПС аналогічно до першої стадії культивування. У культиваційні колби асептично вносять 5 мл інокулюму за допомогою стерильної піпетки з бавовняним фільтром. Термін культивування глибинним методом складає 6 діб при 25 °C на лабораторній качалці зі зворотно-поступальним рухом з частотою 120 коливань за хвилину. Наприкінці ферментації міцелій F. velutipes F-1105 має вигляд пелет сферичної форми жовтувато-білого кольору діаметром 1-4 мм з міцеліальними радіальними тяжами різного розміру по краю. Окрім пелет, в незначній кількості трапляються також вільні філаменти та невеликі шматочки міцелію неправильної форми. Міцелій відділяють від культуральної рідини, отримуючи таким чином культуральний фільтрат (КФ). Міцелій промивають дистильованою водою, визначають концентрацію біомаси ваговим методом. Для цього визначений об'єм посівного матеріалу (5-10 мл) поміщають на щільну капронову тканину, промивають дистильованою водою, висушують у відкаліброваних бюксах при 105 °C до постійної маси та зважують. З метою визначення ефективності окислювальної деструкції речовин обрано модельну сполуку - широко використовуваний барвник Methyl Orange, що відноситься до класу азобарвників. Визначену кількість КФ (дослід) чи живильного середовища (контроль) додають до 0,001 % розчину Methyl Orange в натрій-ацетатному буфері. Водневий показник реакційної суміші становить 4,4 од. Проби інкубують при +40 °C протягом 48 годин. Після цього встановлюють рН реакційної суміші на рівні 3,1 од. за допомогою натрій-ацетатного буферу. Вимірюють оптичну густину розчину при довжині хвилі 506 нм. Ефективність деструкції розраховують за формулою: 2 UA 91404 U 5 E  E ЕД  к  100%, Eк де Eк ,E  - оптична густина контрольної і дослідної проби відповідно. Досліди проводять у трикратній повторності. Отримані експериментальні дані обробляють з використанням Microsoft Excel та пакету програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Результати індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F1105 представлено в таблиці. Таблиця Ефективність окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-1105 на різних за складом живильних середовищах Середовище ГПС [2] Модифіковане ГПС 10 15 20 25 30 35 40 ЕД, % 2,35±1,35 24,60±1,46 АСБ, г/ л 2,58±0,16 3,53±0,17 Таким чином, завдяки модифікації складу ГПС спостерігається індукція окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-1105, яка була в 10,5 рази вищою за цей показник на стандартному ГПС. Запропонований спосіб індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-1105 не потребує дорогих живильних середовищ, є новим у виконанні, доступним і легко здійснюваним. Джерела інформації: 1. Капич А.Н. Сопряжение перекисного окисления липидов с деградацией лигнина у дереворазрушающих базидиомицетов / А.Н. Капич // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр. - 2011. - Т. 3. - С. 316-335. 2. Пат. 76863 України. Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-1105 - продуцент екзопродуктів перекисного окиснення ліпідів / Чайка О.В., Федотов О.В. Заявка № u201204305, від 06.04.2012, МПК (2013.01), кл. C12N 1/00 Бюл. № 2, від 25.01.2013 (прототип). 3. Пат. 66659 України. Спосіб індукції перекисного окиснення ліпідів штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod / Федотов О.В. Чайка О.В., Фоменок Д. В., Гербутова А.В. Заявка № u201108067, від 29.06.2011, МПК (2011.01), кл. A01G 7/00, А01Н 15/00 Бюл. № 1, від 10.01.2012. 4. Рабинович М.Л. Разложение природных ароматических структур и ксенобиотиков грибами (обзор) / М.Л. Рабинович, А.В. Болобова, Л.Г. Васильченко // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - 40, № 1. - С. 5-23. 5. Соломко Е.Ф. Ріст окремих видів лікарських макроміцетів на поживних середовищах різного складу / Е.Ф. Соломко, М.Л. Ломберг, Н.Ю. Митропольська, О.В. Чоловська // Укр. ботан. журн. - 2000. - Т. 57, № 2. - С. 119-125. 6. Федотов О.В. Вплив бензопірену на інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів штаму Pleurotus ostreatus P-107 / О.В. Федотов, О.В. Чайка, О.Г. Метрусенко // Проблеми екології та охорони природи техногенного регіону. - Донецьк, ДонНУ, 2012. - № 1 (12). - С. 252257. 7. Eggert C. The Ligninolytic System of the White Rot Fungus Pycnoporus cinnabarinus: Purification and Characterization of the Laccase / С. Eggert, U. Temp, K.L Eriksson.// Applied and Environmental Microbiology.-1996.-62 (4).-P. 1151-1158. 8. Hammel K.E. Reactive oxygen species as agents of wood decay by fungi / K.E. Hammel, A.N. Kapich, K.A.Jr. Jensen, Z.C. Ryan // Enzyme and Microbial Technology.-2002.-30. - P. 445-453. 9. Kirk K.T. Production of multiple ligninases by Phanerochaete chrysosporium, effect of selected growth conditions and the use of a mutant strain / K.T. Kirk, S. Croan, M. Tien, K.E. Murtagh, R.L. Farrell // Enzyme Microbiol Technol.-1986.-8. - P. 27-32. 45 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб індукції окислювальної деструкції барвника Methyl Orange штамом дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-1105, що включає культивування глибинним 3 UA 91404 U методом на глюкозо-пептонному середовищі при 25,0 °C протягом 6 діб на лабораторній качалці, який відрізняється тим, що штам культивується на модифікованому глюкозопептонному середовищі, яке містить наступні компоненти: лігносульфонат 3,5 г твін-80 1,0 г розчин мінеральних елементів Кірка 70 мл пептон 3,0 г глюкоза 7,5 г KН2РО4 0,6 г K2НРО4 0,4 г дистильована вода до 1 літра. Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4