Спосіб одержання екзополісахариду

Реферат: UA 92015 U UA 92015 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнології, а саме, до способу одержання мікробних екзополісахаридів (ЕПС), які можуть використовуватись у нафтовидобувній, хімічній, парфумерній, харчовій та ін. промисловості, сільському господарстві, медицині. Відомі способи одержання екзополісахаридів, продуцентами яких є Xanthomonas campestris 8162 [А.с. № 595379, СРСР, Опубл. 28.02.78, Бюл. № 8], Xanthomonas campestris NRLL В-12075 та NRLL В-12074 [патент № 4400467, США, опубл. 23.08.83], Xanthomonas campestris ATCC 31601 [патент № 4418145, США, опубл. 29.11.83]. Однак штами Xanthomonas campestris є фітопатогенними, деякі з них генетично нестабільні, оскільки дисоціюють на мукоїдні і немукоїдні форми, що спричиняє нестабільність якості синтезованих полісахаридів. Вказані негативні особливості штамів-продуцентів завдають шкоду довкіллю, а також обмежують використання препаратів. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ЕПС [патент України на винахід № 97910, С12Р19/04. Спосіб одержання екзополісахариду /Пирог Т.П., Савчук О.М. Опубл. 26.03.2012, Бюл. № 6], який передбачає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ацетату натрію і меляси, мінеральні солі і ростові фактори, причому у процесі культивування штаму IMB В-7005 здійснюють періодичну (кожні 18-20 год.) нейтралізацію культуральної рідини розчинами водорозчинних органічних кислот (оцтової, лимонної, бурштинової, щавлевої). Недоліком цього способу є невисока в'язкість розчинів ЕПС за присутності одновалентних 2+ катіонів і у системі Сu -гліцин, а саме ці реологічні властивості визначають практичну значущість цього полісахариду. В основу корисної моделі поставлена задача створення нового способу одержання екзопол і сахариду, який покращує його реологічні властивості і підвищує показники синтезу. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання екзополісахариду включає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить джерело вуглецевого живлення, мінеральні солі і ростові фактори з внесенням на початку стаціонарної фази росту глюкози. Згідно з корисною моделлю як джерело вуглецю використовують соняшникову олію (0,9-1,1 %, об'ємна частка), концентрація глюкози становить 0,07-0,09 % (масова частка), а інокулят вирощують на середовищі з фумаратом. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як джерела вуглецевого живлення соняшникової олії (0,9-1,1 %, об'ємна частка), внесення на початку стаціонарної фази росту глюкози у концентрації 0,07-0,09 % (масова частка) і використання інокуляту, вирощеного на фумараті, дає змогу збільшити в'язкість 0,1 % розчинів ЕПС за присутності 0,1 М KСl у 10-11 разів і підвищити на 20-30 % ЕПС-синтезувальну здатність. Спосіб здійснюється таким чином. Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л): KН2РО4 - 6,8; KОН - 0,9; NH4NO3 - 0,4; MgSO4 × 7H2O - 0,4; СаСl2 × 2Н2О 0,1; FeSO4 × 7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують соняшникову олію (1,0 %, об'ємна частка). На початку стаціонарної фази росту (72 год.) у середовище вносять 0,08 % (масова частка) глюкози. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить фумарат натрію (0,5 %, масова частка) як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу збільшити в'язкість 0,1 % розчинів ЕПС за присутності 0,1 М KСl у 10-11 разів і підвищити на 20-30 % ЕПС-синтезувальну здатність. Приклад 1. Залежність синтезу ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 від моменту внесення глюкози у середовище з соняшниковою олією Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л): КН2РО4-6,8; КОН - 0,9; NH4NO3-0,4; MgSO4 × 7H2O-0,4; СаС12 × 2Н2О - 0,1; FeSO4 × 7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують соняшникову олію (1 %, об'ємна частка). На початку процесу (лаг-фаза), в експоненційній (48 год.) і стаціонарній фазі росту (72 год.) у середовище вносять 0,05 і 0,1 % (масова частка) глюкози. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (24 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить соняшникову олію (0,5 %, об'ємна частка) як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування 1 UA 92015 U 5 10 здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 30 °С упродовж 120 год. Концентрацію біомаси визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу клітин (АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. Ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС оцінюють за такими показниками: кількість синтезованих ЕПС і ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезованого екзополісахариду встановлюють ваговим методом: ЕПС осаджують з культуральної рідини ізопропанолом, осад промивають у чистому ізопропанолі і висушують при кімнатній температурі упродовж доби. ЕПС-синтезувальну здатність розраховують як відношення кількості синтезованого ЕПС до біомаси та виражають у г ЕПС/ г АСБ. Як видно з наведених у таблиці 1 даних, у разі внесення 0,1 % глюкози у стаціонарній фазі росту показники синтезу є вищими, ніж за використання нижчої концентрації вуглеводу. Таблиця 1 Показники синтезу ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 за додавання екзогенного глюкози у середовище із соняшниковою олією Концентрація глюкози, % (масова частка) 0,05 0,1 Середовище 1 ЕПС-синтезувальна здатність ЕПС (г/л), % від (г ЕПС/г АСБ), % від контролю контролю 95±5 94±5 123±6 124±6 135±7 140±7 110±5 110±5 130±6 135±6 145±7 150±8 Момент внесення глюкози (фаза росту) Лаг-фаза Експоненційна Стаціонарна Лаг-фаза Експоненційна Стаціонарна Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ЕПС на середовищі без глюкози. 15 20 Приклад 2. Синтез ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 на середовищі з соняшниковою олією залежно від концентрації глюкози Культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 здійснюють як описано у прикладі 1. На початку стаціонарної фази росту (72 год.) у середовище вносять 0,06-0,11 % (масова частка) глюкози. Показники синтезу ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 2 даних, у разі внесення 0,07-0,09 % глюкози у середовище з олією показники синтезу ЕПС є найвищими. Приклад 3. Синтез ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 залежно від концентрації олії у середовищі культивування і природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту Таблиця 2 Вплив концентрації глюкози на синтез ЕПС за умов росту Acinetobacter sp. IMB В-7005 на соняшниковій олії Концентрація глюкози, % 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11 ЕПС (г/л), % від контролю 135±7 160±8 165±8 160±8 145±7 140±7 ЕПС-синтезувальна здатність (гЕПС/гАСБ), % від контролю 140±7 165±8 170±8 160±8 150±8 140±7 Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ЕПС на середовищі без глюкози. 25 Культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 здійснюють як описано у прикладі 1. Як джерело вуглецю використовують соняшникову олію у концентрації 0,8-1,2 % (об'ємна частка). На початку стаціонарної фази росту (72 год.) у середовище вносять 0,08 % (масова частка) 2 UA 92015 U 5 глюкози. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить соняшникову олію (0,5 % об'ємна частка) і фумарат (0,5 %, масова частка). Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Показники синтезу ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 3 даних, використання посівного матеріалу, вирощеного на фумараті, дає змогу суттєвіше підвищити показники синтезу ЕПС порівняно із застосуванням інокуляту, вирощеного на середовищі з соняшниковою олією. 10 Таблиця 3 Вплив концентрації соняшникової олії на синтез ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 Джерело вуглецю у середовищі для одержання інокуляту Соняшникова олія Фумарат Концентрація соняшникової олії, % 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 ЕПС (г/л), % від контролю 155±7 165±8 170±8 170±8 150±7 170±8 180±9 185±9 180±9 170±8 Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ЕПС на середовищі без глюкози. 15 20 25 Приклад 4. Порівняння показників синтезу і реологічних властивостей ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 згідно прототипу і запропонованого способу Культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 здійснюють як описано у прикладі 1. Як джерело вуглецю використовують соняшникову олію у концентрації 1,0 % (об'ємна частка). На початку стаціонарної фази росту (72 год.) у середовище вносять 0,08 % (масова частка) глюкози. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить фумарат натрію (0,5 %, масова частка). Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Показники синтезу ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Кінематичну в'язкість 0,1 %-них розчинів ЕПС вимірюють на скляному віскозиметрі Оствальда ВПЖ-4 при температурі 20 °C. Властивості розчинів ЕПС оцінюють за зміною їх кінематичної в'язкості за присутності 0,1 М KСl. Для порівняння властивостей розчинів ЕПС як критерій оцінки використовують відносне збільшення в'язкості його розчинів, яке визначають за формулою:   o Відносне збільшення в' язкості  1  100 % , o де: 1 - в'язкість розчину ЕПС у досліджуваних умовах (за присутності 0,1 М KСl); o в'язкість розчину ЕПС у дистильованій воді. 30 3 UA 92015 U Таблиця 4 Синтез ЕПС за різних умов культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 Умови культивування Згідно прототипу Згідно запропонованого способу 5 Відносне збільшення кінематичної в'язкості (%) за присутності 0,1 М KСl 46,2±2,3 490,0±24 ЕПС-синтезувальна здатність (г ЕПС/г АСБ), % від контролю 6,9±0,34 8,8±0,44 Як свідчать дані, наведені у таблиці 4, використання запропонованого способу дає змогу збільшити в'язкість 0,1 % розчинів ЕПС за присутності 0,1 М KСl у 10-11 разів і підвищити на 2030 % ЕПС-синтезувальну здатність порівняно з прототипом. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Спосіб одержання екзополісахариду, що включає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить джерело вуглецевого живлення, мінеральні солі, ростові фактори, з внесенням на початку стаціонарної фази росту глюкози, який відрізняється тим, що як джерело вуглецю використовують соняшникову олію (0,9-1,1 %, об'ємна частка), концентрація глюкози становить 0,07-0,09 % (масова частка), а інокулят вирощують на середовищі з фумаратом. 15 Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4