Спосіб одержання екзополісахариду

Реферат: Винахід належить до способу одержання екзополісахариду, що включає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ацетату натрію і меляси, мінеральні солі і ростові фактори, причому у процесі культивування здійснюють періодичну, кожні 18-20 годин, нейтралізацію культуральної рідини розчинами водорозчинних органічних кислот, таких як оцтова, лимонна, бурштинова, щавлева. Спосіб дає змогу збільшити в'язкість 0,1 % розчину екзополісахариду, синтезованого на суміші ацетату натрію і меляси і таким чином покращити реологічні характеристики синтезованого екзополісахариду, а також підвищити на 18-35 % кількість синтезованого ЕПС і ЕПСсинтезувальну здатність. UA 97910 C2 (12) UA 97910 C2 UA 97910 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнології, а саме, до способу одержання мікробних екзополісахаридів (ЕПС), які можуть використовуватись у нафтовидобувній, хімічній, парфумерній, харчовій та ін. промисловості, сільському господарстві, медицині. Відомі способи одержання екзополісахаридів, продуцентами яких є Xanthomonas campestris 8162 [А.с. № 595379, СРСР, Опубл. 28.02.78, Бюл. № 8], Xanthomonas campestris NRLL В-12075 та NRLL В-12074 [патент № 4400467, США, опубл. 23.08.83], Xanthomonas campestris ATCC 31601 [патент № 4418145, США, опубл. 29.11.83]. Однак штами Xanthomonas campestris є фітопатогенними, деякі з них генетично нестабільні, оскільки дисоціюють на мукоїдні і немукоїдні форми, що спричиняє нестабільність якості синтезованих полісахаридів. Вказані негативні особливості штамів-продуцентів завдають шкоду довкіллю, а також обмежують використання препаратів. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання 7 ЕПС [патент України № 52817 МПК С12Р 19/00. Спосіб одержання екзополісахариду / Пирог Т.П., Савчук О.М. Опубл. 10.09.2010, Бюл. № 17], який передбачає культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ростових субстратів, мінеральні солі і ростові фактори. Згідно винаходу як джерело вуглецевого живлення використовують суміш ацетату натрію і меляси масовою часткою 1,1 і 1,5 % відповідно. Недоліком цього способу є невисока в'язкість розчинів ЕПС за присутності одновалентних 2+ катіонів, за низьких значень рН і у системі Сu -гліцин, а саме ці реологічні властивості визначають практичну значущість цього полісахариду. В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання екзополісахариду, який покращує його реологічні властивості і підвищує показники синтезу ЕПС. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання екзополісахариду включає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ацетату натрію і меляси, мінеральні солі і ростові фактори. Згідно винаходу у процесі культивування штаму IMB В-7005 здійснюють періодичну (кожні 18-20 год.) нейтралізацію культуральної рідини розчинами водорозчинних органічних кислот (оцтової, лимонної, бурштинової, щавлевої). Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Періодична (кожні 18-20 год.) нейтралізація культуральної рідини розчинами водорозчинних органічних кислот (оцтової, лимонної, бурштинової, щавлевої) у процесі культивування штаму Acinetobacter sp. IMB В-7005 на суміші ацетату натрію і меляси 2+ дає змогу збільшити в'язкість 0,1 % його розчинів за присутності 0,1 М КСl і у системі Сu -гліцин у 5-9 і 2,8-7,3 разів відповідно, а також підвищити на 18-35 % кількість синтезованого ЕПС і ЕПС-синтезувальну здатність. Спосіб здійснюється таким чином. Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л): КН2РО4-2,0; MgSO4×7H2O-0,4; СаСl2×+2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш ацетату натрію (1,1 %, масова частка) і меляси (1,5 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить суміш ацетату натрію (0,25 %, масова частка) і меляси (0,25 %, масова частка) як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 30 °C упродовж 80 год. Кожні 18-20 год. здійснюють підкислення культуральної рідини до рН 7,0-7,2 6 %-ним розчином бурштинової, 8 %-ним розчином щавлевої, 20 %-ним розчином лимонної та 9 %-ним розчином оцтової кислот. Використання нового способу дає змогу збільшити в'язкість 0,1 % його розчинів за 2+ присутності 0,1 М КСl і у системі Сu -гліцин у 5-9 і 2,8-7,3 разів відповідно, а також підвищити на 18-35 % кількість синтезованого ЕПС і ЕПС-синтезувальну здатність. Приклад 1. Вплив рН середовища на реологічні властивості розчинів ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л): КН 2РО42,0; MgSO4×7Н2О - 0,4; СаСl2×+ 2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш ацетату натрію (1,1 %, масова частка) і меляси (1,5 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить суміш ацетату натрію (0,25 %, масова частка) і меляси (0,25 %, масова частка) як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 1 UA 97910 C2 5 10 об/хв…) при 30 °C упродовж 80 год. В одному з варіантів кожні 18-20 год. здійснюють підкислення культуральної рідини до рН 7,0-7,2 10 %-ним розчином соляної кислоти. ЕПС осаджували з культуральної рідини ізопропанолом, осад промивали у чистому ізопропанолі і висушували при кімнатній температурі упродовж доби. Кінематичну в'язкість 0,1 %-них розчинів ЕПС вимірювали на скляному віскозиметрі Оствальда ВПЖ-4 при температурі 20 °C. Властивості розчинів ЕПС оцінювали за зміною їх кінематичної в'язкості за присутності 0,1 М 2+ 2+ КСl та у системі Сu -гліцин. Для вивчення поведінки розчинів ЕПС в системі Сu -гліцин до його розчину додавали 0,003 М CuSO4×5H2O та 0,015 М гліцину; розчин нагрівали до 80 °C і витримували при цій температурі 5 хв., після чого охолоджували. Для порівняння властивостей розчинів ЕПСС як критерій оцінки використовували відносне збільшення в'язкості його розчинів, яке визначали за формулою: Відносне збільшення в'язкості  1  o  100 % , o 15 20 25 30 де: 1 - в'язкість розчину ЕПС у досліджуваних умовах (за присутності 0,1 М КСl і системі 2+ Сu -гліцин); o - в'язкість розчину ЕПС у дистильованій воді. ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 складається з ацильованого (містить С10-С18-жирні кислоти) і неацильованого компонентів, ідентичних за моносахаридним складом, вмістом глюкуронової і піровиноградної кислот. Завдяки наявності жирних кислот розчинам ЕПС притаманна здатність до емульгування, підвищення в'язкості за присутності катіонів, за низьких 2+ значень рН, у системі Сu -гліцин, що зумовлює практичне використання цього екзополісахариду у нафтовидобувній, хімічній, харчовій промисловості, сільському господарстві. Як видно з наведених у табл. 1 даних, розчини ЕПС, синтезованого під час культивування штаму IMB В-7005 на суміші ацетату і меляси з періодичною нейтралізацією культуральної 2+ рідини, характеризуються вищою в'язкістю за присутності 0,1 М КСl і у системі Сu -гліцин порівняно з ЕПС, одержаним у процесі без регуляції рН. Невисокі реологічні властивості ЕПС, синтезованого за умов росту Acinetobacter sp. IMB В7005 без регуляції рН, можна пояснити високим значенням рН культуральної рідини (9,0-9,5) до кінця культивування бактерій на середовищі з ацетатом і мелясою, зумовленим транспортом ацетату у клітини симпортом з протоном. За таких значень рН може відбуватися дезацилювання ЕПС, що й призводить до зниження реологічних характеристик його розчинів. Таблиця 1 Відносне збільшення в'язкості 0,1 %-них розчинів ЕПС, синтезованих на суміші ацетату натрію і меляси Умови культивування Без регуляції рН Регуляція рН соляною кислотою 35 40 45 Відносне збільшення кінематичної в'язкості (%) за присутності 2+ 0,1 М КСl Сu -гліцин 5,1±0,2 158±7 10,0±0,5 285±14 Разом з тим підкислення розчином соляної кислоти у процесі культивування штаму IMB В7005 призводить до накопичення у культуральній рідині NaCl і необхідності подальшого діалізу для очищення екзополісахариду. У зв'язку з цим припустили, що підкислення можна здійснювати внесенням у середовище водорозчинних органічних кислот циклу трикарбонових кислот (ЦТК) - лимонної, бурштинової тощо. У цьому разі можна очікувати не тільки регуляції рН до оптимального для синтезу ЕПС рівня, а й підвищення його синтезу за рахунок залучення цих органічних кислот до гліоксилатного циклу (лимонна) і глюконеогенезу (бурштинова) і використання їх як додаткового джерела вуглецю. Приклад 2. Вплив органічних кислот на синтез екзополісахариду Acinetobacter sp. IMB В7005 на суміші ацетату і меляси. Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують в умовах, описаних у прикладі 1. Упродовж культивування (кожні 18-20 год.) здійснюють підкислення культуральної рідини до рН 7,0-7,2 6 %-ним розчином бурштинової, 8 %-ним розчином щавлевої, 20 %-ним розчином лимонної та 9 %-ним розчином оцтової кислот. Концентрацію біомаси визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу клітин (АСБ) у відповідності з калібрувальним 2 UA 97910 C2 5 10 графіком. Ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС оцінюють за такими показниками: кількість синтезованих ЕПС і ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезованого екзополісахариду встановлюють ваговим методом. ЕПС-синтезувальну здатність розраховують як відношення кількості синтезованого ЕПС до біомаси та виражають у г ЕПС/г АСБ. Як видно з наведених у табл. 2 даних, використання органічних кислот для нейтралізації культуральної рідини під час росту штаму ІMB В-7005 на суміші ацетату і меляси дає змогу підвищити кількість синтезованих ЕПС і ЕПС-синтезувальну здатність на 18-35 % порівняно з показниками процесу без регуляції рН. Зазначимо, що за внесення органічних кислот не спостерігається підвищення синтезу біомаси. Таблиця 2 Синтез ЕПС на суміші ацетату і меляси за регуляції рН культуральної рідини органічними кислотами Кислота для регуляції рН Лимонна Бурштинова Щавлева Оцтова ЕПС, % від контролю 118±3 126±5 128±5 135±6 г ЕПС/г АСБ, % від контролю 119±4 124±5 126±5 134±6 Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ЕПС у процесі без регуляції рН 15 20 25 Експериментальні дослідження і розрахунки дають змогу встановити, що кількість додатково внесеного у вигляді розчинів органічних кислот вуглецю становить близько 0,1 г. Цієї кількості вуглецю недостатньо для підвищення синтезу ЕПС на 18-35 % (див. табл. 2). Отже, збільшення кількості синтезованого за присутності органічних кислот ЕПС може бути зумовлене двома причинами: встановленням оптимального для синтезу значення рН і/або посиленням за таких умов глюконеогенезу. Приклад 3. Вплив органічних кислот на реологічні властивості екзополісахариду Acinetobacter sp. ІMB В-7005, синтезованого на суміші ацетату і меляси Acinetobacter sp. ІMB В7005 вирощують в умовах, описаних у прикладі 1 і 2. Реологічні властивості ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 3 даних, розчини ЕПС, синтезованих під час культивування штаму ІMB В-7005 на суміші ацетату і меляси з періодичною нейтралізацією культуральної 2+ рідини, характеризуються вищою в'язкістю за присутності 0,1 М КСl і у системі Сu -гліцин порівняно з ЕПС, одержаним у процесі без регуляції рН. Таблиця 3 Відносне збільшення в'язкості 0,1 %-них розчинів ЕПС, синтезованих на суміші ацетату натрію і меляси Кислота для регуляції рН Без регуляції рН Соляна Оцтова Щавлева Бурштинова Лимонна 30 Відносне збільшення кінематичної в'язкості (%) за присутності 2+ 0,1 М КСІ Сu -гліцин 5,1±0,2 158±7 10,0±0,5 285±14 25,7±1,2 450±22 46,2±2,3 1156±57 30,8±1,5 845±42 26,0±1,2 536±26 Причому використання органічних кислот для регуляції рН супроводжується синтезом ЕПС з покращеними реологічними характеристиками. Так, відносне збільшення в'язкості за 2+ присутності 0,1 М КСl і у системі Сu -гліцин розчинів ЕПС, синтезованого у процесі з нейтралізацією культуральної рідини щавлевою кислотою становить 46,2 і 1156 % відповідно, що у 7-9 разів вище порівняно з в'язкістю розчинів ЕПС, одержаного у процесі без регуляції рН і у 4 рази вище, ніж у разі використання для регуляції рН соляної кислоти (табл. 3). 3 UA 97910 C2 Таким чином, використання водорозчинних органічних кислот для нейтралізації культуральної рідини у процесі культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на суміші ацетату натрію і меляси дає змогу покращити реологічні характеристики синтезованого ЕПС і підвищити на 18-35 % його кількість і ЕПС-синтезувальну здатність. 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 Спосіб одержання екзополісахариду, що включає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ацетату натрію і меляси, мінеральні солі і ростові фактори, який відрізняється тим, що у процесі культивування здійснюють періодичну, кожні 1820 годин, нейтралізацію культуральної рідини розчинами водорозчинних органічних кислот, таких як оцтова, лимонна, бурштинова, щавлева. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4