Спосіб одержання екзополісахариду

Спосіб одержання екзополісахариду, що включає культивування Acinetobacter sp. ІMB В7005 на поживному середовищі, що містить суміш ацетату натрію і меляси, мінеральні солі і ростові фактори, який відрізняється тим, що у процесі культивування здійснюють періодичну (кожні 18-20 год.) нейтралізацію культуральної рідини розчинами водорозчинних органічних кислот (оцтової, лимонної, бурштинової, щавлевої). Корисна модель належить до біотехнології, а саме до способу одержання мікробних екзополісахаридів (ЕПС), які можуть використовуватись у нафтовидобувній, хімічній, парфумерній, харчовій та інших галузях промисловості, сільському господарстві, медицині. Відомі способи одержання ЕПС, продуцентами яких є Xanthomonas campestris 8162 [А.с. № 595379, СРСР, опубл. 28.02.78, бюл. № 8], Xanthomonas campestris NRLL В-12075 та NRLL В12074 [патент № 4400467, США, опубл. 23.08.83], Xanthomonas campestris ATCC 31601 [патент № 4418145, США, опубл. 29.11.83]. Однак штами Xanthomonas campestris є фітопатогенними, деякі з них генетично нестабільні, оскільки дисоціюють на мукоїдні і немукоїдні форми, що спричиняє нестабільність якості синтезованих полісахаридів. Вказані негативні особливості штамів-продуцентів завдають шкоду довкіллю, а також обмежують використання препаратів. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ЕПС 7 [патент України № 52817 МПК С12Р19/00. Спосіб одержання екзополісахариду / Пирог Т.П., Савчук О.М. Опубл. 10.09.2010, бюл. № 17], який передбачає культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ростових субстратів, мінеральні солі і ростові фактори. Згідно з корисною моделлю, як джерело вуглецевого живлення використовують суміш ацетату натрію і меляси масовою часткою 1,1 і 1,5 % відповідно. Недоліком цього способу є невисока в'язкість розчинів ЕПС за присутності одновалентних катіо нів, за низьких значень рН і у системі Сu -гліцин, а саме ці реологічні властивості визначають практичну значущість цього полісахариду. В основу корисної моделі поставлено задачу створення нового способу одержання екзополісахариду, який покращує його реологічні властивості і підвищує показники синтезу ЕПС. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання екзополісахариду включає культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ацетату натрію і меляси, мінеральні солі і ростові фактори. Згідно з корисною моделлю, у процесі культивування штаму IMB В-7005 здійснюють періодичну (кожні 18-20 год.) нейтралізацію культуральної рідини розчинами водорозчинних органічних кислот (оцтової, лимонної, бурштинової, щавлевої). Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає в наступному. Періодична (кожні 18-20 год.) нейтралізація культуральної рідини розчинами водорозчинних органічних кислот (оцтової, лимонної, бурштинової, щавлевої) у процесі культивування штаму Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на суміші ацетату натрію і меляси дає змогу збільшити в'язкість 0,1 % його розчинів за присутності 2+ 0,1 М КСl і у системі Сu -гліцин у 5-9 і 2,8-7,3 разів відповідно, а також підвищити на 18-35 % кількість синтезованого ЕПС і ЕПС-синтезувальну здатність. Спосіб здійснюється таким чином. Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л): КН2РО4 - 2,0; MgSO4×7Н2О - 0,4; СаСl2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О (19) UA (11) 65950 (13) U 2+ 3 65950 - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш ацетату натрію (1,1 %, масова частка) і меляси (1,5 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить суміш ацетату натрію (0,25 %, масова частка) і меляси (0,25 %, масова частка) як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв.) при 30 °С упродовж 80 год. Кожні 18-20 год здійснюють підкислення культуральної рідини до рН 7,0-7,2 6 %-ним розчином бурштинової, 8 %ним розчином щавлевої, 20 %-ним розчином лимонної та 9 %-ним розчином оцтової кислот. Використання нового способу дає змогу збільшити в'язкість 0,1 % його розчинів за присутнос2+ ті 0,1 М КСl і у системі Сu -гліцин у 5-9 і 2,8-7,3 разів відповідно, а також підвищити на 18-35 % кількість синтезованого ЕПС і ЕПС-синтезувальну здатність. Приклад 1. Вплив рН середовища на реологічні властивості розчинів ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л): КН2РО4 - 2,0; MgSO4×7Н2О - 0,4; СаСl2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш ацетату натрію (1,1 %, масова частка) і меляси (1,5 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить суміш ацетату натрію (0,25 %, масова частка) і меляси (0,25 %, масова частка) як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв.) при 30 °С упродовж 80 год. В одному з варіантів кожні 18-20 год. здійснюють підкислення культуральної рідини до рН 7,0-7,2 10 %-ним розчином соляної кислоти. ЕПС осаджували з культуральної рідини ізопропанолом, осад промивали у чистому ізопропанолі і висушували при кімнатній температурі упродовж доби. 4 Кінематичну в'язкість 0,1 %-них розчинів ЕПС вимірювали на скляному віскозиметрі Оствальда ВПЖ-4 при температурі 20 °С. Властивості розчинів ЕПС оцінювали за зміною їх кінематичної в'язкості за присутності 0,1 М 2+ КСl та у системі Сu -гліцин. Для вивчення поведі2+ нки розчинів ЕПС в системі Сu -гліцин до його розчину додавали 0,003 М CuSO4×5H2O та 0,015 М гліцину; розчин нагрівали до 80 °С і витримували при цій температурі 5 хв., після чого охолоджували. Для порівняння властивостей розчинів ЕПСС як критерій оцінки використовували відносне збільшення в'язкості його розчинів, яке визначали за формулою:   0 Відносне збільшення в'язкості= 1 ×100 0 %, де 1 - в'язкість розчину ЕПС у досліджуваних 2+ умовах (за присутності 0,1 М КСl і у системі Сu гліцин);  0 - в'язкість розчину ЕПС у дистильованій воді. ЕПС Acinetobacter sp. ІMB В-7005 складається з ацильованого (містить С10-С18-жирні кислоти) і неацильованого компонентів, ідентичних за моносахаридним складом, вмістом глюкуронової і піровиноградної кислот. Завдяки наявності жирних кислот розчинам ЕПС притаманна здатність до емульгування, підвищення в'язкості за присутності 2+ катіонів, за низьких значень рН, у системі Сu гліцин, що зумовлює практичне використання цього екзополісахариду у нафтовидобувній, хімічній, харчовій промисловості, сільському господарстві. Як видно з наведених у табл. 1 даних, розчини ЕПС, синтезованого під час культивування штаму IMB В-7005 на суміші ацетату і меляси з періодичною нейтралізацією культуральної рідини, характеризуються вищою в'язкістю за присутності 0,1 М 2+ КСІ і у системі Сu -гліцин порівняно з ЕПС, одержаним у процесі без регуляції рН. Невисокі реологічні властивості ЕПС, синтезованого за умов росту Acinetobacter sp. IMB В-7005 без регуляції рН, можна пояснити високим значенням рН культуральної рідини (9,0-9,5) до кінця культивування бактерій на середовищі з ацетатом і мелясою, зумовленим транспортом ацетату у клітини симпортом з протоном. За таких значень рН може відбуватися дезацилювання ЕПС, що й призводить до зниження реологічних характеристик його розчинів. Таблиця 1 Відносне збільшення в'язкості 0,1 %-них розчинів ЕПС, синтезованих на суміші ацетату натрію і меляси Умови культивування Без регуляції рН Регуляція рН соляною кислотою Відносне збільшення кінематичної в'язкості (%) за присутності 2+ 0,1 М КСІ Сu -гліцин 5,1±0,2 158±7 10,0±0,5 285±14. 5 65950 Разом з тим, підкислення розчином соляної кислоти у процесі культивування штаму IMB В7005 призводить до накопичення у культуральній рідині NaCl і необхідності подальшого діалізу для очищення екзополісахариду. У зв'язку з цим припустили, що підкислення можна здійснювати внесенням у середовище водорозчинних органічних кислот циклу трикарбонових кислот (ЦТК) - лимонної, бурштинової тощо. У цьому разі можна очікувати не тільки регуляції рН до оптимального для синтезу ЕПС рівня, а й підвищення його синтезу за рахунок залучення цих органічних кислот до гліоксилатного циклу (лимонна) і глюконеогенезу (бурштинова) і використання їх як додаткового джерела вуглецю. Приклад 2. Вплив органічних кислот на синтез екзополісахариду Acinetobacter sp. IMB В-7005 на суміші ацетату і меляси. Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують в умовах, описаних у прикладі 1. Упродовж культивування (кожні 18-20 год.) здійснюють підкислення культуральної рідини до рН 7,0-7,2 6 %-ним розчином бурштинової, 8 %-ним розчином щавлевої, 20 6 %-ним розчином лимонної та 9 %-ним розчином оцтової кислот. Концентрацію біомаси визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу клітин (АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. Ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС оцінюють за такими показниками: кількість синтезованих ЕПС і ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезованого екзополісахариду встановлюють ваговим методом. ЕПС-синтезувальну здатність розраховують як відношення кількості синтезованого ЕПС до біомаси та виражають у г ЕПС/г АСБ. Як видно з наведених у табл. 2 даних, використання органічних кислот для нейтралізації культуральної рідини під час росту штаму IMB В-7005 на суміші ацетату і меляси дає змогу підвищити кількість синтезованих ЕПС і ЕПС-синтезувальну здатність на 18-35 % порівняно з показниками процесу без регуляції рН. Зазначимо, що за внесення органічних кислот не спостерігається підвищення синтезу біомаси. Таблиця 2 Синтез ЕПС на суміші ацетату і меляси за регуляції рН культуральної рідини органічними кислотами Кислота для регуляції рН Лимонна Бурштинова Щавлева Оцтова ЕПС, % від контролю 118±3 126±5 128±5 135±6 Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ЕПС у процесі без регуляції рН. Експериментальні дослідження і розрахунки дають змогу встановити, що кількість додатково внесеного у вигляді розчинів органічних кислот вуглецю становить близько 0,1 г. Цієї кількості вуглецю недостатньо для підвищення синтезу ЕПС на 18-35 % (див. табл. 2). Отже, збільшення кількості синтезованого за присутності органічних кислот ЕПС може бути зумовлене двома причинами: встановленням оптимального для синтезу значення рН і/або посиленням за таких умов глюконеогенезу. Г ЕПС/г АСБ, % від контролю 119±4 124±5 126±5 134±6. Приклад 3. Вплив органічних кислот на реологічні властивості екзополісахариду Acinetobacter sp. IMB В-7005, синтезованого на суміші ацетату і меляси Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують в умовах, описаних у прикладі 1 і 2. Реологічні властивості ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 3 даних, розчини ЕПС, синтезованих під час культивування штаму IMB В-7005 на суміші ацетату і меляси з періодичною нейтралізацією культуральної рідини, характеризуються вищою в'язкістю за присутності 0,1 М 2+ КСІ і у системі Сu -гліцин порівняно з ЕПС, одержаним у процесі без регуляції рН. Таблиця 3 Відносне збільшення в'язкості 0,1 %-них розчинів ЕПС, синтезованих на суміші ацетату натрію і меляси Кислота для регуляції рН Без регуляції рН Соляна Оцтова Щавлева Бурштинова Лимонна Відносне збільшення кінематичної в'язкості (%) за присутності 2+ 0,1 М КСІ Сu -гліцин 5,1±0,2 158±7 10,0±0,5 285±14 25,7±1,2 450±22 46,2±2,3 1156±57 30,8±1,5 845±42 26,0±1,2 536±26. 7 Причому використання органічних кислот для регуляції рН супроводжується синтезом ЕПС з покращеними реологічними характеристиками. Так, відносне збільшення в'язкості за присутності 2+ 0,1 М КСІ і у системі Сu - гліцин розчинів ЕПС, синтезованого у процесі з нейтралізацією культуральної рідини щавлевою кислотою становить 46,2 і 1156 % відповідно, що у 7-9 разів вище порівняно з в'язкістю розчинів ЕПС, одержаного у процесі без регуляції рН і у 4 рази вище, ніж у разі Комп’ютерна верстка Л. Купенко 65950 8 використання для регуляції рН соляної кислоти (табл. 3). Таким чином, використання водорозчинних органічних кислот для нейтралізації культуральної рідини у процесі культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на суміші ацетату натрію і меляси дає змогу покращити реологічні характеристики синтезованого ЕПС і підвищити на 18-35 % його кількість і ЕПС-синтезувальну здатність. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601