Спосіб отримання антигену для діагностики паратуберкульозу у реакції зв’язування комплементу

Реферат: Спосіб отримання антигену для діагностики паратуберкульозу у реакції зв'язування комплементу включає культивування Mycobacterium avium sp. paratuberculosis, штам "Деметра", на синтетичному середовищі, інактивацію збудника автоклавуванням, відділення бактеріальної маси фільтруванням. Як антиген використовують протеїн як кінцевий продукт метаболізму і лізису Mycobacterium avium sp. paratuberculosis. Осадження протеїну із культурального фільтрату проводять трихлороцтовою кислотою (ТХО), відмивання протеїну проводять дистильованою водою, розчинення протеїну проводять 10 % NaOH, видаляють клітинні уламки центрифугуванням, консервують фенолом. UA 98403 U (12) UA 98403 U UA 98403 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології, імунології та біотехнології, а саме до способів одержання антигенів для серологічної діагностики паратуберкульозу великої рогатої худоби (ВРХ). Спосіб призначений для отримання антигену, який являє собою очищену білкову фракцію продуктів метаболізму і лізису Mycobacterium avium sp. Paratuberculosis, штам "Деметра", вирощеного на синтетичному живильному середовищі та інактивованого термічно. Існує спосіб одержання антигену з штаму Mycobacterium paratuberculosis ВГНКИ "КА"-ДЕП. Штам культивують на середовищі Ватсона-Рейда протягом 28-35 діб. Вирощену бактеріальну масу відмивають дистильованою водою, суспендують у фізіологічному розчині до концентрації З 70-90 мг/см і дезінтегрують ультразвуком за 22 кГц протягом 15-16 хв. Відокремлюють клітинний детрит центрифугуванням за 16-20 тис. об./хв. протягом 50 хв. Супернатант концентрують тіомерсалом з розрахунку 1:10000 [Тырина B.C., Попова Г.Г. Способ получения антигена для серологической диагностики паратуберкулеза у жвачных животных (Патент RU 2118538)]. Недоліком цього способу є низька специфічність антигену у реакції зв’язування комплементу (РЗК). Відомий також спосіб отримання антигену для серологічної діагностики паратуберкульозу (РЗК) у жуйних тварин, що включає отримання бактеріальної маси з штамів мікобактерій паратуберкульозу II-V N106 і Teps N 105 (Вейбріджська колекція штамів мікроорганізмів), шляхом вирощування їх на середовищі Рейда протягом 45-60 діб, фільтрацію, відмивання від залишків середовища дистильованою водою, концентрацію шляхом центрифугування при 20003000 об./хв. протягом 15 хв., обробку ацетоном, діаліз, консервування мертіолятом 1:5000, подальшу дезінтеграцію ультразвуком протягом 30 хв., осадження клітинного детриту шляхом центрифугування при 5000 об./хв. протягом 30 хв., відділення супернатанту з вмістом 3,5-7 3 мг/см протеїну і ліофільне висушування цільового продукту [Патент Румынии № 81670, кл. А61К 39/02, 1983 г.]. Недоліком даного способу є невисока чутливість одержуваного антигену, а також його низька специфічність (до 50 % реакцій у тварин є хибнопозитивними (неспецифічними). Крім цього даний спосіб є трудомістким в отриманні цільового продукту. Найбільш близьким за технічною суттю до способу, що заявляється, є спосіб одержання антигену за методом Боке-Негре (Bouquet, Negre) для використання у реакції зв'язування комплементу (РЗК), що включає вирощування збудника паратуберкульозу, інактивацію автоклавуванням, екстрагування бактеріальної маси ацетоном та метиловим спиртом впродовж 1-3 місяців [М.П. Новикова. Методика изготовления антигена для РЗК при диагностике паратуберкулезного энтерита рогатого скота // Сб. науч. работ СибНИВИ. - 1959. - Вып. VIII. - С. 153-157]. За цим способом виготовляють комерційний паратуберкульозний антиген (Росія) з робочим титром 1:100. Недоліками антигену, виготовленого за цим методом, є низька специфічність, використання отруйних речовин (ацетон, метанол), тривалий процес виготовлення антигену. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб одержання антигену для діагностики паратуберкульозу у РЗК, що включає культивування Mycobacterium avium sp. paratuberculosis на синтетичному середовищі, інактивацію збудника автоклавуванням, відділення бактеріальної маси фільтруванням, шляхом використання штаму "Деметра" для культивування Mycobacterium avium sp. Paratuberculosis, осадження протеїну із культурального фільтрату трихлороцтовою кислотою (ТХО), відмивання протеїну дистильованою водою, розчинення протеїну 10 % NaOH, видалення клітинних уламків центрифугуванням, консервування фенолом, використання як антигену протеїну як кінцевого продукту метаболізму і лізису, щоб забезпечити ефективність способу. Концентрований антиген зберігають у сухому темному місці при температурі 2-8 °С. Заявлений спосіб одержання антигену для діагностики паратуберкульозу у РЗК відрізняється від прототипу тим, що використовується очищена білкова фракція продуктів метаболізму і лізису Mycobacterium avium sp. Paratuberculosis, штам "Деметра", не використовуються токсичні речовини, процес виготовлення антигену займає 2 доби. Спосіб виконується таким чином. Культуру збудника паратуберкульозу Mycobacterium avium sp. Paratuberculosis, штам "Деметра" вирощують на синтетичному середовищі впродовж 10 тижнів. Після інактивації (120 °C - 60 хв.) бактеріальну масу відділяють фільтруванням. Вимірюють об'єм культурального фільтрату. Протеїн із культуральної рідини осаджують 40 % ТХО до 4 % кінцевої концентрації. Через 18 годин надосадову рідину зливають, білок 3-кратно відмивають від залишків середовища і ТХО. Вимірюють вагу білка в заздалегідь зваженому центрифужному стакані, білок ресуспендують і розчиняють, доводячи рН до 6,7-6,9, клітинні уламки видаляють центрифугуванням, консервують фенолом. Антиген стандартизують титруванням та визначають специфічність. 1 UA 98403 U 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 РЗК проводять у пробірках по 0,2 см кожного компоненту: контрольні сироватки, антиген, 3 3 комплемент і 0,4 см гемолітичної системи, загальний об'єм становить - 1,0 см . Робочі розведення всіх компонентів для РЗК готують перед постановкою реакції. Для дослідження використовують компоненти, які не мають антикомплементарних або гемотоксичних властивостей. Результати РЗК враховують за схемою: ++++ (4 знаки) - відсутність гемолізу, прозора надосадова рідина; +++ (3 знаки) - 25 % гемолізу еритроцитів; ++ (2 знаки) - 50 % гемолізу еритроцитів; + (1 знак) - 75 % гемолізу еритроцитів; - (знак "мінус") - повний гемоліз, відсутність осаду еритроцитів, рідина забарвлена гемоглобіном. Приклад 1. Культуру збудника паратуберкульозу Mycobacterium avium sp. Paratuberculosis, штам "Деметра" вирощували на синтетичному середовищі Рейда впродовж 10 тижнів. Після інактивації (120 °C - 60 хв.) бактеріальну масу відділяли фільтруванням. Вимірювали об'єм культурального фільтрату. Протеїн із культуральної рідини осаджували 40 % ТХО до 4 % кінцевої концентрації. Через 18 годин надосадову рідину зливали, а осад центрифугували 2500 об./хв. - 15 хв. Отриманий осад триразово промивали дистильованою водою з вмістом 5 % NaCl + 0,5 % фенолу. Після останнього центрифугування визначали вагу осаду в заздалегідь зваженому центрифужному стакані. Осад ресуспендували і розчиняли у 1,8 % Na2HPO4 2Н2О 3 (рН 11) із розрахунку 2,5 см /1,0 г протеїну, доводячи рН препарату до 9,7. Препарат центрифугували при 2500 об. протягом 10 хв., надосадову рідину змішували з рівним об'ємом фосфатного буфера (1,5 % КН2 РО4 + 3 % Na2HPO4 2Н2О), що містить 19,4 % глюкози і 0,5 % фенолу. Кінцева рН препарату повинна бути 6,7-6,9. Приклад 2. Культивування та осадження протеїну з культурального фільтрату проводили аналогічно прикладу № 1, але далі осаджений ТХО протеїн триразово промивали центрифугуванням у стерильному фізіологічному розчині та ресуспендували у стерильному 3 карболізованому фізіологічному розчині з вмістом 0,25 % фенолу із розрахунку 2,5 см на 1,0 г білку. Далі суспензію протеїну розчиняли 10 % NaOH, доводячи рН до 6,7-6,9. Не розчинені елементи видаляли центрифугуванням при 2500 об. протягом 10 хв., надосадову рідину змішували з рівним об'ємом карболізованого фізіологічного розчину. Приклад 3. Визначали активність (чутливість) антигену титруванням по квадратній схемі з контрольними негативною (в розведенні 1:10) та позитивною (в розведеннях 1: 5, 1:10 і 1:20) сироватками крові ВРХ (табл. 1). Повний гемоліз еритроцитів зі всіма розведеннями антигену без сироватки і з негативною сироваткою вказував на відсутність самозатримуючих властивостей антигену. Робочим титром антигену вважали подвоєну його кількість, яка давала повну затримку гемолізу з позитивною контрольною сироваткою в розведенні 1:10, при наявності гемолізу з контрольною негативною сироваткою (1:10). Приклад 4. Визначали специфічність з антигеном-прототипом з гомологічними та гетерологічними сироватками крові від різних видів тварин за списком: 1. Від кролика інфікованого референтним штамом МАР. 2. Від кролика імунізованого референтним штамом МАР. 3. Від кролика імунізованого епізоотичною культурою МАР №5809. 4. Від кролика інфікованого епізоотичною культурою МАР № 6651. 5. Від барана імунізованого референтним штамом МАР. 6. Від ВРХ № 9849 інфікованої M.bovis. 7. Від ВРХ № 9850 інфікованої M.bovis. 8. Від ВРХ № 9210 інфікованої M.bovis. 9. Від ВРХ імунізованої М. intracellulare. 10. Від ВРХ імунізованої M.kansasii. 11. Від ВРХ імунізованої M.fortuitum. 12. Від ВРХ імунізованої BCG. 13. Від кролика інфікованого M.scrofulaceum. 14. Від кролика імунізованого BCG. 15. Від курки інфікованої M.avium. 16. Від курки імунізованої M.avium. 17. Від барана інфікованого M.avium. 18. Бруцельозна с.1, к. 1. 19. Монорецепторна О-аглютинуюча сальмонельозна ФГУП "Краснодарская биофабрика" с. 295, к.295. 20. РІД позитивна на лейкоз ВРХ. Діагностичним показником вважали розведення сироватки 1:10, розведення 1:5 та 1:20 контрольні показники. Результати порівняльної специфічності наведені у табл. 2. 2 UA 98403 U 5 10 15 Як видно з табл. 1, антиген, виготовлений по прикладу 1, був більш активніше, ніж антиген, виготовлений по прикладу 2. Так кінцеве розведення антигену, виготовленого по прикладу 1, при якому спостерігали повну затримку гемолізу еритроцитів (#) при розведенні позитивної сироватки 1:10 складало 1:2000, при розведенні 1:20-1:1400. Антиген, виготовлений по прикладу 2, був менш чутливий, максимальне його розведення при відсутності гемолізу у позитивної сироватки (1:10) складало 1:1400, при розведенні сироватки 1:20-1:800. Однак, за даними табл. 2 при порівняльному визначенні специфічності антигенів (у робочих титрах) з гомологічними і гетерологічними сироватками крові, встановлено, що тільки антиген, виготовлений за прикладом 2, був специфічним, тобто виявляв антитіла в сироватках МАРінфікованих та імунізованих тварин і не реагував з сироватками як проти гетерологічних мікобактеріальних антигенів, так і інших видів бактеріальних і вірусних збудників (сальмонельозу, бруцельозу та лейкозу). Антиген, виготовлений за прикладом 1, та комерційний антиген (прототип) давали перехресні реакції з сироватками хворої на туберкульоз худоби, а також з кролячими сироватками проти M.scrofulaceum та BCG. Крім цього, комерційний антиген реагував з сироваткою імунізованої М. intracellulare BPX. Отже, заявлений спосіб одержання антигену для діагностики паратуберкульозу у РЗК дозволяє отримати активний і специфічний діагностичний препарат, який виявляє антитіла проти збудника паратуберкульозу та не дає хибно-позитивних реакцій з сироватками крові проти інших видів бактеріальних і вірусних збудників. 20 Таблиця 1 Спосіб отримання антигену для діагностики паратуберкульозу у реакції зв'язування комплементу S 1:5 1:10 1:20 АГ без S S (1:10) + АГ 1:400 # # # 1:5 1:10 1:20 АГ без S S (1:10) + АГ # # # Приклад 1 Розведення антигену 1:800 1:1000 1:1400 1:1800 1:2000 # # # # # # # # # # # # # ++ ++ Приклад 2 (заявлений спосіб) # # # # # # # # +++ ++ # +++ ++ ++ + + 1:2200 # +++ ++ # ++ Примітки: АГ - антиген; S - контрольна негативна сироватка крові; + S - контрольна позитивна сироватка; # - відсутність гемолізу, прозора надосадова рідина; +++ - 25 % гемолізу еритроцитів; ++ - 50 % гемолізу еритроцитів; + - 75 % гемолізу еритроцитів; - - повний гемоліз, відсутність осаду еритроцитів, рідина забарвлена гемоглобіном. 3 S без АГ UA 98403 U Таблиця 2 Спосіб отримання антигену для діагностики паратуберкульозу у реакції зв'язування комплементу Сироватки крові Приклад 1 (1:1000) 1:5 # # # # +++ # # # # # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 S (1:10) з АГ S (1:10) бeз АГ + S (1:10) з АГ + S (1:10) без АГ АГ без S Без S, без АГ 1:10 # # # # +++ # +++ ++ +++ ++ Приклад 2 (1:700) 1:20 # # # # ++ # ++ + 1:5 # # # # +++ # ++ Контроль # 1:10 # # # # +++ + 1:20 # # # # ++ Прототип АГ (р. т. 1:100), с.2, к.2 1:5 1:10 1:20 # # # # # # # # # # # # +++ +++ ++ # # # # +++ +++ # +++ +++ # # +++ # +++ +++ # # # # + Примітки: S - сироватка негативна; S - сироватка позитивна; АГ - антиген; # - відсутність гемолізу, прозора надосадова рідина; +++ - 25 % гемолізу еритроцитів; ++ - 50 % гемолізу еритроцитів; + - 75 % гемолізу еритроцитів; - - повний гемоліз, відсутність осаду еритроцитів, рідина забарвлена гемоглобіном. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб отримання антигену для діагностики паратуберкульозу у реакції зв'язування комплементу, що включає культивування Mycobacterium avium sp. paratuberculosis на синтетичному середовищі, інактивацію збудника автоклавуванням, відділення бактеріальної маси фільтруванням, який відрізняється тим, що використовують для культивування Mycobacterium avium sp. paratuberculosis, штам "Деметра", як антиген використовують протеїн як кінцевий продукт метаболізму і лізису Mycobacterium avium sp. paratuberculosis, осадження протеїну із культурального фільтрату проводять трихлороцтовою кислотою (ТХО), відмивання протеїну проводять дистильованою водою, розчинення протеїну проводять 10 % NaOH, видаляють клітинні уламки центрифугуванням, консервують фенолом. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4