Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить способу одержання поверхнево-активних речовин, який включає культивування Rhodococcus erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії, причому як джерело вуглецевого живлення використовують олієвмісні промислові відходи, а на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2 % чи мелясу масовою часткою 0,2-0,4 %. Спосіб дає змогу підвищити у 1,4-2 рази концентрацію синтезованих ПАР і здешевити процес біосинтезу. UA 98571 C2 (12) UA 98571 C2 UA 98571 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловостях. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UА, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4]. Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Rhodococcus erythropolis 1MB Ас-5017 [Пат. 92819 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Тарасенко Д.О., Яцук Д.В. Опубл. 10.12.2010, Бюл. № 23], який передбачає культивування R. erythropolis 1MB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Для підвищення концентрації ПАР та скорочення тривалості культивування продуцента на початку стаціонарної фази росту у середовище з етанолом чи гексадеканом вносять 0,2-0,25 % фумарату і 0,1-0,15 % цитрату. Недоліком цього способу є занадто висока вартість використовуваних джерел вуглецевого живлення, а також "нетехнологічність" водонерозчинного гідрофобного ростового субстрату гексадекану і недостатньо висока концентрація синтезованих поверхнево-активних речовин. В основу винаходу покладено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який здешевлює процес біосинтезу і підвищує концентрацію синтезованих ПАР. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування R. erythropolis 1MB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Згідно винаходу як джерело вуглецевого живлення використовують олієвмісні промислові відходи, а на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2 % чи мелясу масовою часткою 0,2-0,4 %. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як джерела вуглецевого живлення олієвмісних промислових відходів і внесення на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента глюкози масовою часткою 0,1-0,2 % чи меляси масовою часткою 0,2-0,4 % дає змогу підвищити у 1,4-2 рази концентрацію синтезованих ПАР і здешевити процес біосинтезу. Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування R. erythropolis IMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 -1,3; MgSO47H2O 0,1; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KH2PO4 - 0,14; FeSO47H2O - 0,001%; pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують відходи оліє-жирових виробництв (фузи) або використану (пересмажену) соняшникову олію у концентрації 2 % (об'ємна частка). На початку процесу або в середині експоненційної фази росту у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2 % чи мелясу масовою часткою 0,2-0,4 %. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 1,0 % олієвмісних відходів (фузи, пересмажена олія). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °С упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити у 1,4-2 рази концентрацію синтезованих ПАР і здешевити процес біосинтезу. Приклад 1. Синтез ПАР за умов росту R. erythropolis IMB Ас-5017 на промислових відходах Культивування штаму 1MB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 - 1,3; MgSO47H2O - 0,1; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KH2PO4 - 0,14; FeSO47H2O - 0,001%; pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують: відходи олієжирових виробництв (фузи), використану (пересмажену) соняшникову олію, гліцерин і рідкі парафіни у концентрації 0,5 і 1,0 % (об'ємна частка), гексадекан (контроль) у концентрації 2,0 % (об'ємна частка), а також мелясу масовою часткою 0,5 і 1,0 %. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % відповідного джерела вуглецю. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму 1 UA 98571 C2 5 10 15 20 середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв.) при 28 °С упродовж 120 год. Поверхневий натяг (s) визначають за допомогою напівавтоматичного тензіометра TD1C LAUDA (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовують показник «умовної концентрації ПАР» (ПАР*). Цей показник визначають як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності as від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР. У разі вирощування R. erythropolis EK-1 на субстратах, що можуть знижувати поверхневий натяг (гексадекан, рідкі парафіни, олія та відходи її виробництва) перед вимірюванням цього показника культуральну рідину звільняють від залишкового субстрату обробкою гексаном (якщо штам вирощують на середовищі з гексадеканом або рідкими парафінами) чи бензином (якщо культивування штаму здійснюють на олієвмісних середовищах). Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР за умов росту R. erythropolis EK-1 на відходах різних виробництв. Таблиця 1 Синтез ПАР за умов росту R. erythropolis IMB Ас-5017 на відходах промислових виробництв Концентрація субстрату, % 0,5 1,0 0,5 1,0 0,5 1,0 0,5 1,0 0,5 1,0 2,0 Субстрат Відходи оліє-жирових виробництв Використана (пересмажена) соняшникова олія Меляса Гліцерин Рідкі парафіни Гексадекан (контроль) 25 30 35 40 Показники синтезу ПАР рНкінцеве Е24, % ПАР* 7,9±0,2 38±2 4,3+0,21 7,9±0,2 40±2 5,0±0,25 8,5±0,3 20±1 2,0±0,10 7,7±0,2 65±3 4,8+0,24 8,9±0,3 37±1,5 2,0±0,10 9,0+0,3 40±2 3,3±0,16 7,0±0,2 37±1,5 2,1±0,10 7,1±0,2 47+2 3,2±0,16 7,0±0,2 39±2 4,3±0,21 7,1+0,2 47±2 4,6±0,23 7,0±0,2 40±2 4,8+0,24 Як видно з наведених у табл. 1 даних, показники синтезу ПАР у процесі культивування штаму ЕК-1 на олієвмісних середовищах (ПАР* 4,8-5,0) не відрізняються від таких на гексадекані і рідких парафінах (ПАР* 4,6-4,8). У подальших дослідженнях як субстрат для вирощування R. erythropolis 1MB Ас-5017 використовують пересмажену олію, оскільки вона у великій кількості накопичується у різних закладах громадського харчування. Приклад 2. Вплив глюкози на синтез ПАР за умов росту R. erythropolis 1MB Ас-5017 на олієвмісних середовищах Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують пересмажену олію у концентрації 2,0 % (об'ємна частка). На початку процесу культивування, у середині експоненційної (48 год.) і стаціонарній фазі (72 год.) у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,05-0,3 %. Вибір вуглеводів як додаткового субстрату був зумовлений тим, що ПАР R. erythropolis EK-1 за хімічною природою є гліколіпідами (трегалозоміколатами), а отже внесення глюкози за умов росту штаму IMB Ас5017 на олієвмісному середовищі може інтенсифікувати синтез ПАР за рахунок наявності майже готових блоків у середовищі культивування. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі з 1 % олії. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °С упродовж 120 год. 2 UA 98571 C2 5 10 15 20 25 30 Кількість синтезованих ПАР визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну воронку об'ємом 100 мл, додають5 мл 1 М НСl, воронку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 М НСl й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у воронці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1 М НСl й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Дані з впливу різних концентрацій глюкози і моменту її внесення у олієвмісне середовище на синтез ПАР штамом IMB Ас-5017 наведено у табл. 2. Як видно з наведених у табл. 2 даних, внесення в олієвмісне середовище на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента глюкози масовою часткою 0,1-0,2 % супроводжується підвищенням у 2-3 рази концентрації синтезованих ПАР порівняно з показниками на середовищі без вуглеводів і в 1,4-2 рази порівняно з прототипом. Приклад 3. Дослідження можливості заміни глюкози на мелясу за умов росту R. erythropolis IMB Ас-5017 на олієвмісних середовищах Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують пересмажену олію у концентрації 2,0 % (об'ємна частка). На початку процесу культивування і в середині експоненційної фази росту продуцента у середовище вносять мелясу масовою часткою 0,2 і 0,4 %. Показники синтезу поверхневоактивних речовин визначають як описано у прикладі 2. Як засвідчують дані, наведені у табл. 2 і 3, у разі використання меляси замість глюкози за умов росту R. erythropolis IMB Ас-5017 на олієвмісних середовищах концентрація синтезованих ПАР і індекс емульгування культуральної рідини практично не змінюються. Таким чином, культивування R. erythropolis IMB Ас-5017 на олієвмісних промислових відходах з внесенням на початку процесу або в експоненційній фазі росту глюкози масовою часткою 0,1-0,2 % або меляси масовою часткою 0,2-0,4 % дає змогу підвищити в 1,4-2 рази концентрацію синтезованих ПАР і здешевити процес біосинтезу порівняно з прототипом. 35 Таблиця 2 Залежність синтезу ПАР R. erythropolis IMB Ас-5017 на пересмаженій олії від моменту внесення і концентрації глюкози Момент внесення глюкози Концентрація глюкози, рН Е24, % Концентрація % ПАР, г/л 0,05 7,2 42±2,1 2,6±0,13 0,1 7,2 47±2,3 5,1±0,25 Лаг-фаза (0 год.) 0,2 7,2 45±2,2 3,6±0,18 0,3 7,2 39±2,0 2,1±0,10 0,05 7,0 42±2,1 2,5±0,12 0,1 7,0 42±2,1 3,6±0,18 Експоненційна фаза (48 год.) 0,2 7,0 43±2,1 4,5±0,22 0,3 7,1 40±2,0 3,1±0,15 0,05 7,1 38±1,9 2,8±0,14 0,1 7,1 38±1,9 2,8±0,14 Стаціонарна фаза (72 год.) 0,2 7,3 50±2,5 2,6±0,13 0,3 7,5 51±2,6 2,6±0,13 Контроль (без глюкози) 0 7,0 42±2,1 1,7±0,09 Прототип 0 9,3 45±2,2 2,5±0,12 Примітка. Умови культивування згідно прототипу: джерело вуглецю у середовищі гексадекан у концентрації 2 % (об'ємна частка), на початку стаціонарної фази росту у середовище вносять фумарат і цитрат натрію масовою часткою 0,2 і 0,1 % відповідно. 3 UA 98571 C2 Таблиця 3 Вплив меляси на синтез ПАР за умов R. erythropolis IMB Ас-5017 на пересмаженій олії Момент внесення меляси Лаг-фаза Експоненційна фаза 5 10 Концентрація меляси, % 0,2 0,4 0,2 0,4 рН Е24, % 7,2 7,2 7,0 7,0 47±2,3 45±2,2 42±2,1 43±2,1 Концентрація ПАР, г/л 5,0±0,25 3,5±0,18 3,3±0,17 4,4±0,22 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, який включає; культивування Rhodococcus erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії, який відрізняється тим, що як джерело вуглецевого живлення використовують олієвмісні промислові відходи, а на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2 % чи мелясу масовою часткою 0,2-0,4 %. Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання метаболітів з поверхнево-активними і емульгувальними властивостями, які можуть бути використані для очистки довкілля від нафти і нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 20 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, який включає культивування Rhodococcus erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії, який відрізняється тим, що як джерело вуглецевого живлення використовують олієвмісні промислові відходи, а на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2 % або мелясу масовою часткою 0,2-0,4 %. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4