Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до раку synchytrium endobioticum (schilb) perc. плр аналізом днк

Реферат: Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc включає зараження паростків картоплі літніми зооспорами збудника хвороби і їх аналіз. З вихідних батьківських форм картоплі, а також з гібридів, отриманих від комбінацій схрещування виділяють ДНК, проводять їх електрофорез в агарозному гелі і за виявленими продуктами ампліфікації ДНК ідентифікують сприйнятливі до раку зразки, що дозволяє відібрати вихідні батьківські форми картоплі для схрещування і отримати стійкі нащадки. UA 99352 U (12) UA 99352 U UA 99352 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, зокрема до захисту рослин від негативної дії шкідливих організмів та хвороб. В сільському господарстві відомий метод інфрачервоної мікроскопії для діагностики ушкодження і стійкості зернових до шкідників [1]. В картоплярстві відомі польові та лабораторні способи визначення стійкості сортів та гібридів картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. [2, 3, 4]. Польовий спосіб визначення стійкості картоплі до раку заснований на безпосередньому зараженні зразків картоплі зимовими зооспорами збудника раку у природних польових умовах [2]. Лабораторний спосіб включає в себе зараження паростків картоплі літніми зооспорами зі свіжих ракових наростів (найближчий аналог) [2]. Спосіб, що вирішується у найближчому аналозі, полягає в тому, що він включає зараження паростків картоплі літніми зооспорами зі свіжих ракових наростів за температури 11-13 °C. Після 21 дня проводився облік реакції рослин на дію зооспор з ракових наростів картоплі. У сприйнятливих сортів картоплі спостерігається деформація паростків картоплі та поява ракових наростів, а у стійких - поява поодиноких сорусів та некротичне відмирання тканини паростків картоплі. Згадані способи та спосіб-найближчий аналог мають такі недоліки: 1. Вони є трудомісткими. 2. Їх використання пов'язане із затратою часу, який займає цілий вегетаційний період розвитку рослин картоплі та патогена. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до збудника раку шляхом ПЛР аналізу ДНК вихідних батьківських форм, а також отриманих після схрещування гібридів картоплі. Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі шляхом виділення ДНК з вихідних батьківських форм картоплі, а також з отриманих після схрещування гібридів, з наступним конвенційним ПЛР аналізом ДНК у сприйнятливих до раку зразків картоплі виявляють продукти ампліфікації ДНК патогена з довжиною 472 пар нуклеотидів, а у стійких вони відсутні. Таким чином можна відібрати стійкі вихідні батьківські форми, отримати стійкі нащадки. 1. Запропонований спосіб дозволяє визначити успадкування стійкості картоплі до раку за значно коротший термін часу - дві доби (за найближчим аналогом - протягом 21 доби). 2. Суттєвою відмінністю нового способу є те, що шляхом ПЛР аналізу ДНК вдається відібрати стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі і отримати стійкі нащадки. Приклади здійснення способів Приклад 1 Зразки бульб сортів та гібридів картоплі, коли паростки досягали 1-2 мм, заражали літніми зооспорами зі свіжих ракових наростів. Для цього на верхівку бульби картоплі навколо паросткової частини приліплювали паперове кільце за допомогою суміші парафіну та вазеліну (1:1). В кільце проводили інокуляцію паростків картоплі спорами збудником раку в дистильованій воді. Зразки залишали у клімокамері з підвищеною вологістю і температурою 1113 °C. Час експозиції - 24 години. Інфекцію з паперовими кільцями знімали з бульб і зразки картоплі за температури 17-18 °C залишали протягом 20 діб. Реакцію паростків картоплі на зараження патогеном визначали під бінокулярною лупою за п'ятибальною шкалою: 1 - некротизована тканина паростка, поодинокі соруси (до 5); 2 - розсіяні соруси (якщо більше 5), 3 - щільні соруси без деформації паростка; 4 - щільні соруси з деформацією паростка, 5 - раковий наріст. В результаті проведених досліджень з вивчення стійкості до раку вихідних батьківських форм картоплі виявлено, що в комбінації схрещування сприйнятливий х стійкий до раку (Тетерів (♀) х Сантарка (♂) гібриди картоплі П10 4-3 та П10 4-4, як і їх материнська форма Тетерів отримали оцінку сприйнятливих до хвороби (4, 5 ступінь). Зразки картоплі П10 4-2, П10 4-5 та П10 4-6, як і батьківська форма Сантарка отримали оцінку стійких (1 ступінь). Дані представлені в таблиці 1 UA 99352 U Таблиця Реакція нащадків картоплі та їх батьківських форм на зараження збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc № п/п 1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Сорти, гібриди картоплі 2 Тетерів (♀) (сприйнятлива) П10 4-2 П10 4-3 П10 4-4 П10 4-5 П10 4-6 Сантарка (♂) (стійка) НІР ≤ 0,6 Ступінь ураження Ступінь ураження Кількість уражених Відсоток ураження бульб бульб контролю 3 4 5 5 5 100 5 5 92,4±0,56 1 0 97,6±0,77 4 5 94,9±0,54 1 0 97,6±0,77 1 0 94,4±0,66 1 0 97,3±0,33 1,8 Примітка. 1, 4, 5 - ступінь ураження зразків картоплі збудником раку 5 10 15 20 25 30 35 40 На фігурі зображено електрофорез продуктів ампліфікації ДНК заражених Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc.зразків вихідних батьківських форм та отриманих після схрещування гібридів картоплі, де 1, 16 - маркери молекулярних мас О" Gene Ruler 100 bp (Fermentas), 2 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК сприйнятливої до раку материнської форми картоплі Тетерів (♀), 3 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК стійкого до раку гібриду П10 4-2, 4 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК продуктів ампліфікації ДНК сприйнятливого до раку гібриду П10 4-3, 5 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК сприйнятливого до раку гібриду П10 4-4, 6 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК стійкого до раку гібриду П10 4-5, 7 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК стійкого до раку гібриду П10 4-6, 8 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК стійкої до раку батьківської форми картоплі Сантарка (♂) 9 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК патотипу 1 раку картоплі 10 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК патотипу 11 раку картоплі 11 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК патотипу 13 раку картоплі 12 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК патотипу 18 раку картоплі 13 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК патотипу 22 раку картоплі 14 - доріжка продуктів ампліфікації ДНК патотипу 1 раку картоплі 15 - негативний контроль Приклад 2 Виділення ДНК та ПЛР діагностику картоплі проводили для двох батьківських форм картоплі комбінації схрещування сприйнятливий х стійкий до раку (Тетерів х Сантарка) та п'ятьох гібридів отриманих після схрещування даної комбінації: П10 4-2, П10 4-3, П10 4-4, П10 4-5 та П10 4-6 після їх зараження зооспорами збудника раку. Виділення ДНК проводили за методом Gerhardt С [5] та Prem Das О. [6] і використовували набір реагентів Diatom™ DNA Prep 100: лізуючий буфер з гуанідінтіоціанатом, призначений для лізису нуклеїнових кислот, сольовий буфер для солюбілізації клітинного дебріса, а також для денатурації клітинних нуклеаз. Наважку 80 мг подрібнених заражених зразків картоплі перемішували з 40 мкл лізуючого агента. Проби термостатували за температури 65 °C протягом 30 хв. Після термостатування проби центрифугували 1 хв при 5000 g. Відбирали супернатант і в кожну пробу додавали 20 мкл NucleoS (перед використанням NucleoS інтенсивно перемішували) і знову центрифугували 1 хв при 5000 g. Обережно видалили супернатант і до осаду додали 200 мкл лізуючого буфера, ретельно перемішували на вортексі до повного гомогенного стану. У проби додавали по 1 мл сольового буферу, перемішували 5-10 разів і центрифугували 1 хв при 5000 g. Знову обережно видаляли супернатант і повторювали депротеїнізацію проб ДНК за допомогою сольового буферу. 2 UA 99352 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Осад проб просушили за температури 65 °C протягом 4-5 хв (візуально проконтролювали відсутність спирту в пробірках). У проби внесли 50 мкл ExtraGene E. Суспендували вміст проб на вортексі до отримання гомогенної суміші, потім термостатували 4-5 хв за 65 °C, ще раз перемішували і центрифугували 2 хв при 10000 g. Супернатант використовували для ампліфікації ДНК. Для ампліфікації проб ДНК використовували основний праймер SendolTS2F(5'TTTTTACGGTCACTTTTTTTAGAATGTT-3'). Полімеразну ланцюгову реакцію проводили на ампліфікаторі Mastercycler personal протягом 2 хв за 95 °C, 30 сек за 95 °C, 30 сек за 57 °C, 30 сек за 72 °C, 5 хв за 72 °C, швидко охолоджували до кімнатної температури. Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації проводили в 1,5 % агарозному гелі у рН 2 7,8, 0,2 М трис-боратному буфері протягом 16 годин при напрузі 5 В/см площини камери. Маркували зразки бромфеноловим синім, візуалізацію зразків проводили барвником бромистим етидієм 0,1 %. В якості маркера молекулярних мас використали О' Gene Ruler 100 bp (Fermentas). Гель досліджували в умовах ультрафіолетового випромінювання за довжини хвилі 312 нм. Для фотографування використовували цифрову фотосистему. В результаті ПЛР діагностики ДНК раку картоплі в досліджуваних 7 зразках картоплі виявлено продукти ампліфікації ДНК сприйнятливої вихідної материнської форми картоплі Тетерів (♀) та у сприйнятливих, отриманих після схрещування нащадків картоплі П10 4-3 та П10 4-4. При цьому виявлено продукт ампліфікації з довжиною 472 пар нуклеотидів (фігура, доріжка 2, 4 та 5). У стійкої вихідної батьківської форми Сантарка (♂) та у стійких до раку нащадків П10 4-2, П10 4-5 та П10 4-6 він відсутній (фігура, доріжка 3, 6, 7 та 8). Таким чином, ПЛР діагностика ДНК раку картоплі дозволяє ідентифікувати збудника на ранніх стадіях розвитку хвороби і може бути рекомендована в якості способу визначення стійкості картоплі до раку та її успадкування. Джерела інформації: 1. Вилкова Н.А. Использование инфракрасной микроскопии для диагностики повреждения и устойчивости зерновок к клопам / Н.А. Вилкова, И.Д. Шапиро, Т.А. Борщева // В сб. Методы исследований патологических изменений растений. - М: Колос, 1976. - С. 216-219. 2. Зеля А.Г. Методологія оцінки та відбору селекційного матеріалу картоплі стійкого до раку. /А.Г. Зеля, П.О. Мельник // Методичні рекомендації - Чернівці. - 2007. - 20 с. 3. Патент України на корисну модель № 10504 МКВ A01H3/00, G01 N33/00. A01C1/00. G01J3/28 від 15.11.2005 р. Спосіб визначення наслідування стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. / Зеля А.Г., Костишин С.С., Мельник П.О., Осипчук А.А., Підгаєцький А.А., Бондарчук А.А., Сидорчук В.I., Сологуб О.С. заявл. 05.05.2005 р., опубл. 15.11.2005 р. // Офіційний бюлетень. Промислова власність, Бюл. № 11. С. 56. 4. Патент України на корисну модель № 17048 МКВ А01С1/00 від 15.09.2006 р. Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. / Зеля А.Г., Костишин С С., Мельник П.О., Тома З.Г., Барбакар М.І. заявл. 16.02.2006 р., опубл. 15.09.2006 р. // Офіційний бюлетень. Промислова власність, Бюл. № 9. С. 78. 5. Gerhardt С. et. al. Isollrung von Pflanzen-DNA. // Theor. APPL. Genet. - 1988. - 78. - p. 65-75. 6. Prem Das O. Molecular methods for genetic analysis of Maise // Method Моl. and cel. Biology. 1990. V1. N5-6. p. 213-222. 7. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. / Э. Фрич, Дж. Сэмбрук // М.: Мир. - 1984. - С. 157-175, 344-350. 8. Маслов Ю.И. Статистическая обработка данных биохимических исследований / Ю.И. Маслов // Методы биохимического анализа растений. Л., 1978. - С. 163-178. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 55 Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc, що включає зараження паростків картоплі літніми зооспорами збудника хвороби і їх аналіз, який відрізняється тим, що з вихідних батьківських форм картоплі, а також з гібридів, отриманих від комбінацій схрещування виділяють ДНК, проводять їх електрофорез в агарозному гелі і за виявленими продуктами ампліфікації ДНК ідентифікують сприйнятливі до раку зразки, що дозволяє відібрати вихідні батьківські форми картоплі для схрещування і отримати стійкі нащадки. 3 UA 99352 U Комп’ютерна верстка М. Шамоніна Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4