Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до збудника раку synchytrium endobioticum (schilb) perc.

Реферат: Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до раку, що включає зараження паростків картоплі літніми зооспорангіями збудника хвороби і їх аналіз, причому з бульб сортів картоплі, а також з гібридів, отриманих від різних комбінацій схрещування, виділяють нуклеопротеїди, визначають їх вміст спектрофотометричним способом при 450 нм, підбирають стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі і отримують стійкі нащадки. UA 96248 U (12) UA 96248 U UA 96248 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, зокрема до захисту рослин від негативної дії шкідливих організмів та хвороб. В картоплярстві відомі польові та лабораторні способи визначення стійкості та її успадкування сортів та гібридів картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. Польовий спосіб визначення стійкості картоплі до раку, заснований на безпосередньому зараженні зразків картоплі зимовими зооспорами збудника раку у природних польових умовах [1]. Лабораторний спосіб включає в себе зараження паростків картоплі літніми зооспорами зі свіжих ракових наростів [прототип, 1]. Спосіб, що вирішується у прототипі, полягає в тому, що він включає з себе зараження паростків картоплі літніми зооспорами зі свіжих ракових наростів при 11-13 °C. Після 21 дня проводять облік реакції рослин на дію зооспор з ракових наростів картоплі. У сприйнятливих сортів картоплі спостерігається деформація паростків картоплі та поява ракових наростів, а у стійких - поява по одиночних сорусів та некротичне відмирання тканини паростків картоплі. Згадані способи та спосіб-прототип мають такі недоліки: 1. Вони є трудомісткими. 2. Їх використання пов'язане з затратою часу, який займає цілий вегетаційний період розвитку рослин картоплі та патогену. 3. Їх використання потребує зараження патогеном - збудником раку, який є карантинним організмом. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до збудника раку амінокислотним аналізом білків контрастних за стійкістю до раку вихідних батьківських форм картоплі. Поставлена задача досягається тим, що у запропонованому способі шляхом виділення білків з різних за стійкістю до раку сортів картоплі, з наступним амінокислотним аналізом вдається визначити характерні незамінні амінокислоти у стійких та у сприйнятливих до раку зразків картоплі і таким чином відібрати стійкі вихідні батьківські форми і отримати стійкі нащадки без використання збудника раку, який є карантинним організмом. 1. Для аналізу не використовується інфекційний матеріал (зооспори збудника раку), який є карантинним організмом. 2. Запропонований спосіб дозволяє визначити стійкість до раку за значно коротший термін часу - 1 доби (при прототипі - протягом 21 доби). 3. Суттєвою відмінністю нового способу є те, що шляхом аналізу амінокислот вдається відібрати стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі і отримати стійкі нащадки. Отже, спосіб, що заявляється, відповідає критерію "новизна" та "суттєві відміни". Приклади здійснення способів Приклад 1 Зразки бульб сортів картоплі, коли паростки досягають 1-2 мм, заражають літніми зооспорами зі свіжих ракових наростів протягом 24 годин при 11-13 °C. Для цього на верхівку бульби картоплі навколо паросткової частини приліплюють паперове кільце за допомогою суміші парафіну та вазеліну (1:1). В кільце наливають дистильовану воду, вміщують свіжі ракові нарости розміром 0,5 см 3, які вміщають літні зооспори збудника хвороби. Інокуляцію проводять у клімокамері з підвищеною вологістю і температурі 11-13 °C. Час експозиції 24 години. Інфекцію з паперовими кільцями знімають з бульб і залишають зразки картоплі при температурі 17-18 °C протягом 20 діб, після чого відзначають реакцію паростків картоплі на зараження патогеном. Для цього їх аналізують під бінокулярною лупою і відрізняють ступінь ураження: 1 - некротизована тканина паростка, одиничні соруси; 2 - розсіяні соруси (якщо більше 5), щільні соруси без деформації паростка; 3 - щільні соруси з деформацією паростка, раковий наріст. В аналізованих таким чином зразках картоплі (4 шт.) (Таблиця 1, додаток 1) ступінь ураження паростків картоплі збудником раку склала: 1-2 сорти картоплі: Божедар, Сантарка; 2-0 зразків; 3-2 сорти картоплі: Поліська рожева, Тетерів (додаток 1, таблиця 1). Приклад 2 Для досліджень використовували паросткову частину бульб сортів картоплі Божедар, Сантарка (стійкі) та Поліська рожева та Тетерів (сприйнятливі). Аналіз вмісту амінокислот проводили на амінокислотному аналізаторі JLC-6 фірми JEOL (Японія) за методом Плешкова А.В. [2]. 1 UA 96248 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Білки виділяли з паросткової частини бульб різних за стійкістю до раку сортів картоплі для визначення їх амінокислотного складу за допомогою 0,2 М трис-боратного буферу. Гідроліз білків проводили з 6 н НСl протягом 24 годин при 105 °C у співвідношенні кислоти до білка 100:1 в запаяних ампулах. Хроматографію амінокислот проводили, використовуючи 0,2 н Na-цитратний буфер рН 3,25, 0,25 н Na-цитратний буфер рН 4,25 і 0,35 н Na-цитратний буфер рН 5,28, фарбували нінгідриновим реактивом. Визначення триптофану проводили окремо, оскільки при кислотному гідролізі він руйнується. Зразки білків розчиняли в 0,2 н NaOH при слабкому нагріванні, додавали 23,7 н сірчану кислоту + 0,03 % парадиметиламінобензольдегід і заливали на 12 годин. Потім додають 0,1 мл 0,045 %-ного розчину азиду натрію і після 30 годин визначають оптичну щільність на спектрофотометрі СФ-26 при 600 нм. Для контролю брали воду [2]. Статистичну обробку даних проводили за Масловим Ю.І. [3]. В результаті оцінки амінокислотного складу білків сортів картоплі - вихідних батьківських форм стійких до раку Божедар та Сантарка і сприйнятливих до хвороби - Поліська рожева та Тетерів виявлена схожість по кількості двоосновних амінокислот - лізину (9,0 т%) гистидину (3,6 %) та аргиніну (10,3 %). З амінокислот, що вміщують сірку, було виявлено цистеїн та цистин (4,5-4,7 %). Кількість аліфатичних амінокислот (гліцину, аланіну) була майже однаковою у досліджених сортів картоплі. У складі даних білків відмічено присутність оксіамінокислот (треоніну і серину). Для цих сортів характерна велика кількість дикарбонових амінокислот: аспарагінової і глютамінової, а також аргініну. Їх кількість складає 9,0 % і 10,4 % у сорту Божедар і 8,9 % і 10,6 % у сорту Поліська рожева (додаток 2, таблиця 2, додаток 4, перелік фігур креслення, рисунок 1). У сортів картоплі Поліська рожева та Тетерів також зафіксовано присутність треоніну та серину (4,5 і 5,0 %), а вміст гліцину (4,8 %), аланіну (4,4 %) майже однакове у всіх досліджених сортах. Для них характерно підвищений вміст дикарбонових амінокислот: глютамінової (11,0 %) та аспарагінової (10,6 %). Сума незамінних амінокислот у стійких проти раку сортів картоплі (Божедар та Сантарка) склала 41,0-42 %, а сприйнятливих до хвороби сортів (Поліська рожева та Тетерів) - 43-44 %. Вміст незамінних амінокислот у сприйнятливих сортів картоплі збільшено за рахунок триптофану (1,9 %) і незначно - фенілаланіну, лізину, лейцину та ізолейцину (додаток 2, таблиця 2, додаток 3, таблиця 3, додаток 4, перелік фігур креслення, рисунок 1, додаток 5, перелік фігур креслення, рисунок 2). Таким чином, в результаті проведеної науково-дослідницької роботи встановлено, що амінокислотним аналізом білків картоплі вдається встановити відмінності незамінних амінокислот у контрастних за стійкістю до раку вихідних батьківських форм картоплі та у отриманих після їх схрещування гібридів. За такою ознакою можна відібрати стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі для схрещування і планувати отримання стійких нащадків. Літературні джерела 1. Мельник П.О. Етіологія раку картоплі, біоекологічне обґрунтування заходів його профілактики та обмеження розвитку. / П.О. Мельник. - Чернівці: Прут, 2003. - 284 с. 2. Мельник П.О. Методологія оцінки та відбору селекційного матеріалу картоплі стійкого до раку / П.О. Мельник, А.Г. Зеля (Методичні рекомендації) - Чернівці - 2007. - 20 с. 3. Плешков В.П. Практикум по биохимии растений - М.: Колос. - 1978. - 326 с. 4. Маслов Ю.И. Статистическая обработка данных биохимических исследований. //Методы биохимического анализа растений. Л., 1978. - С. 163-178. Таблиця 1 Реакція сортів картоплі на зараження літніми зооспорами збудника раку (2014 р.) № п/п 1. 2. 3. 4. Реакція сортів картоплі на зараження збудником раку + + Сорти картоплі Божедар Поліська рожева Сантарка Тетерів 2 UA 96248 U Таблиця 2 Амінокислотний склад білків контрастних за стійкістю до раку сортів картоплі Божедар та Поліська рожева (у %, 2014 р.) № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. Сорти картоплі Божедар Поліська рожева 8,2±0,7 8,3±0,6 3,1±0,4 3,0±0,5 4,0±0,5 3,0±0,4 10,0±0,8 10,4±0,9 9,0±0,7 8,9±0,8 5,2±0,6 5,3±0,7 4,6±0,5 4,5±0,4 10,4±0,7 10,6±0,6 3,5±0,4 3,3±0,4 4,8±0,5 4,7±0,4 4,4±0,4 4,5±0,4 0,8±0,04 1,0±0,03 4,1±0,3 3,9±0,2 2,8±0,1 2,6±0,08 6,2±0,4 6,4±0,3 8,5±0,6 8,6±0,7 5,5±0,3 5,3±0,2 4,7±0,2 5,2±0,3 0,9±0,03 1,3±0,06 40,4±0,36 43,3±0,38 100,7±0,76 100,8±0,69 Амінокислота Лізин Гістидин Аміак Аргінін Аспарагінова кислота Треонін Серин Глютамінова кислота Пролін, оксипролін Гліцин Аланін Цистеїн, цистин Валін Метіонін Ізолейцин Лейцин Тирозин Фенілаланін Триптофан Сума незамінних кислот Загальна сума НІР05 < 0,09 Таблиця 3 Амінокислотний склад білків контрастних за стійкістю до раку сортів картоплі Сантарка та Тетерів (у %, 2014 р.) № п/п 1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Сорти картоплі Сантарка Тетерів 3 4 8,3±0,5 8,5±0,4 3,2±0,4 3,4±0,5 4,0±0,5 4,2±0,6 10,2±0,8 10,4±0,7 7,8±0,5 7,3±0,6 4,9±0,6 4,5±0,7 4,3±0,6 4,0±0,6 9,8±0,7 9,5±0,6 3,9±0,4 4,1±0,5 5,1±0,3 5,3±0,4 4,6±0,4 4,9±0,3 0,8±0,06 0,9±0,06 4,3±0,2 4,5±0,1 2,9±0,1 2,8±0,08 6,1±0,3 5,8±0,3 8,3±0,4 8,0±0,4 5,9±0,5 6,0±0,6 Амінокислота 2 Лізин Гістидин Аміак Аргінін Аспарагінова кислота Треонін Серин Глютамінова кислота Пролін, оксипролін Гліцин Аланін Цистеїн, цистин Валін Метіонін Ізолейцин Лейцин Тирозин 3 UA 96248 U Продовження таблиці 3 1 18. 19. 2 Фенілаланін Триптофан Сума незамінних кислот Загальна сума 3 4,9±0,4 0,8±0,3 42,3±0,4 100,8±0,92 4 5,1±0,5 1,3±0,3 44,1±0,49 100,4±0,33 НІР05 < 0,09 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до раку, що включає зараження паростків картоплі літніми зооспорангіями збудника хвороби і їх аналіз, який відрізняється тим, що з бульб сортів картоплі, а також з гібридів, отриманих від різних комбінацій схрещування, виділяють нуклеопротеїди, визначають їх вміст спектрофотометричним способом при 450 нм, підбирають стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі і отримують стійкі нащадки. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4