Застосування поліпептидів сімейства купредоксину в лікуванні раку

1. Застосування купредоксину, вибраного з псевдоазурину, пластоціаніну і рустиціаніну і їх варіантів або похідних, для одержання медикаменту для лікування раку шляхом стимулювання некрозу клітин в раковій пухлині. 2. Застосування за п. 1, в якому купредоксин або його модифікація, або його похідне зв'язується із протеїном р53, що пригнічує пухлину. 3. Застосування за п. 1 або 2, в якому купредоксином є пластоціанін. 2 (19) 1 3 88272 4 17. В основному чистий фактор за п. 12, в якому 19. В основному чистий фактор за п. 18, в якому ракові клітини вибирають з групи, що включає кліфармацевтично прийнятний носій є придатним тини меланоми людини, клітини лейкемії, клітини для внутрішньовенного введення. раку грудей, клітини раку яєчника, клітини раку 20. В основному чистий фактор за п. 12, який має легенів, клітини мезенхімального раку, клітини низьку антигенність. раку товстої кишки, клітини раку дихальних шляхів 21. Фармацевтична композиція, що містить один або клітини раку травного тракту. або більше в основному чистих факторів за будь18. В основному чистий фактор за будь-яким з пп. яким з пп. 12-20 у фармацевтично прийнятному 12-17, що перебуває у фармацевтично прийнятносії. ному носії. 22. Фармацевтична композиція за п. 21, що має низьку антигенність. Ця заявка посилається на пріоритет попередньої патентної заявки США 60/414,550, поданої 15 серпня, 2003р., та продовженої в частині патентної заявки США за номером 10/047,710, поданої 15 січня, 2002p., котра посилається на пріоритет попередньої патентної заявки США за номером 60/269,133, поданої 15 лютого, 2001р. Увесь зміст цих пріоритетних заявок повністю включено сюди через це посилання. Об'єкт цієї заявки було підтримано дослідницькими грантами Національного інституту Здоров'я (National Institutes of Health, NIH), м. Бетесда, Меріленд, США, (номери грантів Α116790-21, ES 04050-16, АІ45541, СА09432 та N01-CM97567). Уряд може мати певні права на цей винахід. Даний винахід стосується цитотоксичних факторів, що секретуються мікроорганізмами та інгібіторів цитотоксичних факторів та їхнього застосування у спричиненні затримки клітинного росту та модуляції клітинної смерті некрозом або апоптозом. Даний винахід також стосується способів продукування, виділення та ідентифікування таких цитотоксичних факторів та композицій, котрі включають в значній мірі чисті цитотоксичні фактори корисні для модулювання клітинної смерті та спричинення затримки клітинного росту. Винахід також стосується методів лікування станів, пов'язаних із апоптозом. Також, зокрема, винахід стосується використання в значній мірі чистих цитотоксичних факторів у способі індукування апоптозу або затримки клітинного росту в ракових клітинах та використання інгібіторів цитотоксичних факторів для лікування інфекцій або інших станів, спричинюваних патогеном. Інфекційні хвороби можуть бути результатом впливу багатьох факторів навколишнього середовища. В основі будь-яких інфекційних хвороб лежать інфекційні фактори, що їх викликають. Інфекційними агентами зазвичай є патогенний мікроорганізм, наприклад, патогенна бактерія. Рівень або здатність патогенного організму подолати захисні механізми та спричинити хворобу пов'язані із їхньою вірулентністю. Відомо, що патогенні та непатогенні мікроорганізми експресують цитотоксичні фактори, котрі дозволяють організму захищатися від імунної системи хазяїна та не дозволяти фагоцитам (наприклад, макрофагам та мастоцитам) знищувати в тілі мікроорганізм. Коли патогенні мікроорганізми виживають, мікроорганізми можуть розповсюджуватися в тканинах хазяї на та проліферувати, спричиняючи тяжкі симптоми хвороби. Патогенні бактерії були визнані основною причиною середніх або смертельних захворювань, наприклад, туберкульозу, холери, коклюшу, чуми та подібних. Для лікування цих тяжких інфекцій, ліки, наприклад, антибіотики, застосовуються як для того щоб убити інфекційний фактор або знешкодити цитотоксичний фактор, таким чином, щоб інфекційний фактор більше не був здатний захищатися від імунної системи хазяїна. Однак, патогенні бактерії зазвичай розвивають резистентність до антибіотиків та надалі потрібні покращені фактори для попередження розповсюдження інфекцій, викликаних цими мікроорганізмами. Рак є злоякісною пухлиною із потенціально необмеженим ростом. Головним чином це патогенна реплікація (втрата нормальної регуляції) різних типів клітин, що знаходяться в тілі людини. Початкове лікування цієї хвороби часто є хірургічним, радіаційне лікування або комбінація цих лікувань, але є частими місцеві рецидиви та метастазування. Можливим є хіміотерапевтичне лікування, але воно нечасто дає довготермінову регресію. Отже вони часто не виліковні. Взагалі, пухлини та їхні метастази стають нечутливими до хіміотерапії у випадках, відомих як мультипрепаратна резистентність. У багатьох випадках, пухлини по суті резистентні до деяких класів хіміотерапевтичних факторів. Також, такі лікування впливають на неракові клітини і є стресорними для організму людини, та дають багато побічних впливів. Тому потрібні поліпшені агенти для попередження розповсюдження ракових клітин. Відомо багато ракових захворювань, котрі регресують коли пацієнти інфікуються патогенними хворобами. Однак, дуже мало відомо про те, як бактеріальні інфекції викликають регресію ракових захворювань людини, Даний винахід має відношення до цитотоксичних факторів, котрі стимулюють клітинну смерть через некроз або апоптоз, або спричиняють затримку клітинного росту. З одного боку, було описано та виділено достатньо чисті цитотоксичні фактори. Достатньо чисті цитотоксичні фактори були одержані фракціонуванням колоночною хроматографією ростового середовища в котре було внесено патогенний мікроорганізм. Переважно, продукування та секрецію таких цитотоксичних 5 88272 6 факторів стимулювали під час росту патогенних міжклітинного ферменту лактатдегідрогенази організмів в присутності протеїнів ссавців. (LDH). Аналізи були проведені триплетами й поЗ іншого боку даного винаходу, ідентифікація милкові позначалися прямокутниками. рецепторів для протеїнів ссавців як засобу роздіФігура 3. На графіках показано каспазну актилення вірулентних та авірулентних мікроорганізмів вність (Фіг.3А-каспаза-3; Фіг.3В-каспаза-9) в цитоможе призвести до поліпшеної специфічності лікузольних екстрактах макрофагів J774, оброблених вання захворювань. фракцією QSFT В.серасіа. Цитозольні екстракти Ще один аспект даного винаходу стосується були одержані із макрофагів інкубуванням протяспособу лікування станів, пов'язаних із резистентгом ночі з фракцією QSFT В.серасіа (10пг протеїністю до клітинної смерті або сприйнятливості, ну) та із необроблюваних макрофагів. Субстратом котра включає етап застосування цитотоксичного для визначення активності каспази-3 був Acфактору, інгібування цитотоксичного фактору або DEVD-pNA (N-ацетил-Аsр-Gly-VаІ-Аsр-р-NО2його варіанту або похідного, можливо нанесеного анилін). Субстратом для визначення активності на фармацевтичний носій. каспази-9 був Ac-LEHD-pNA (N-ацетил-Leu-GluЦитотоксичний фактор, його варіант або похіHis-Asp-p-NO2-анилін). Екстракти інкубували із дне, може бути включений до фармацевтичної субстратом при 37°С протягом зазначеного часу. композиції для використання в попередженні та 10мкг цитозольного протеїну макрофагів було вилікуванні станів, пов'язаних із ненормальною клікористано в кожному випадку. Вивільнення pNA (ртинною проліферацією. Наприклад, цитотоксичний нітроанілін) визначалося спектрофотометрично фактор може бути застосований для лікування при 405нм. раку. Фігура 4. На діаграмі показано цитотоксичЦитотоксичний фактор, його варіант або похіність, визначену за % вивільненням лактатдегідродне, може бути використаний для лікування бактегенази (LDH), в макрофагах в присутності азуріну ріальної інфекції попередженням фагоцитарної (Az), цитохрому с551 (Cyt C551) та їхньої комбінації. клітинної смерті й, таким чином, допомозі імунній Цифрами показано мкг протеїну. Контрольний бусистемі хазяїна в боротьбі з вторгненим патогефер (буфер) показано справа. ном. Фігура 5. На діаграмі показано дію антитіл до В іншому втіленні даного винаходу, цитотоксиазуріну та цитохрому c551 на цитотоксичність фрачні фактори, так само, як і компоненти їхнього секкцій QSFT В.серасіа (А) та M.bovis (В) та в присутреторного апарату, можуть бути застосовані як ності преімунної сироватки. А, азурін (50мкг); С, кандидати для вакцин проти інфекційних факторів. цитохром с551 (25мкг); ab, комбінація антитіл до Даний винахід також стосується способу моазуріну та цитохрому c551; P, преімунна сироватка. дуляції клітинної смерті, що включає етап керуДля кожного аналізу було використано по 2мкг вання секрецією цитотоксичних факторів. В одому фракції QSFT. Цифри після ab та Ρ показують пг з втілень, цитотоксичні фактори можуть бути заантитіл або преімунного протеїну. Результати пристосовані як протиракові фактори проти хазяїна ведено як середньоквадратичне стандартного відракових клітин людини. Цитотоксичні фактори тахилення потрійного експерименту. кож можуть бути використані як мішені для ствоФігура 6. На графіку показано дію післяін'єкрення ліків скринінгом або розробкою інгібіторів. ційного азуріну/цитохрому с551 у "голої" миші на Даний винахід також стосується способу морозмір пухлини після індукування пухлинних клітин дуляції клітинної смерті, що включає застосування меланоми (UISO-Mel-2). Приблизно 106 UISO-Melцитотоксичних факторів, таких як азурін, пластоці2 клітин було ін'єктовано підшкірно "голій" миші анін, рустиціанін, псевдоазурін або цитохром після однотижневих інтраперитонеальних ін'єкцій С551, або мутантів цих цитотоксичних факторів. цитратного буферу (контроль), відомого як протиЦі та інші сторони, переваги та характерні римеланомний препарат DTIC (7.5мкг) або тричі на си даного винаходу стануть зрозумілими із настутиждень протягом 4 тижнів суміші азурін/цитохром пних фігур та опису переважних реалізацій. с551 у великій (150мкг азурін/75мкг цитохром с551) Фігура 1. На діаграмі показано дію 1.0mМ АТФ або малій (10мкг азурін/5мкг цитохром c551) дозах. на вбивання макрофага за відсутності або присутМиші були досліджені та дані графічно представності фільтрованого супернатанту ростового серелені при різних термінах, розмірах (об'єм пухлини) довища (SUP) або гідроксиапатитної поточної пухлин контролю (введення буферу), введення (HAFT), АТФ-агарозної поточної (AAFT) та QDTIC та високих та малих дозах азурін/цитохром сефарозної поточної (QSFT) колоночнос551. хроматографічних фракцій, одержаних із ростовоФігура 7. На графіку показано збільшення та го середовища В.серасіа. Рівень клітинної смерті втрата ваги мишей під час експерименту описаномакрофагів вимірювався за вивільненням міжкліго під Фігурою 6. Під час курсу згаданого вище тинного ферменту лактатдегідрогенази (LDH). В експерименту, мишей зважували на терезах й зааналізі використовувалося по 2мкг з кожної фракписували вагу у грамах. ції. Аналізи були проведені триплетами й помилФігура 8. На графіку показано регресію пухликові позначалися прямокутниками. ни МеІ-6 у "голої" миші, котрій введено фракцію Фігура 2. На діаграмі показано дію на клітинну QSFT Μ. bovis в присутності або відсутності азурісмерть макрофагів фільтрованого супернатанту ну (AZ). Приблизно 106 клітин UISO-Меl-6 було ростового середовища (SUP) та колоночновведено підшкірно "голій" миші. Малі пухлини розхроматографічних фракцій (HAFT, AAFT та QSFT) винулися приблизно після одного тижня. Мишам В. серасіа за відсутності АТФ. Рівень клітинної було введено інтраперитонеально фосфатносмерті макрофагів вимірювався за вивільненням 7 88272 8 Для потреб даного опису, тут, термін "лікуванбуферний розчин (контроль), фракцію QSFT M. ня" включає попередження, зниження, зупинення, bovis та суміш фракції QSFT Μ. bovis та азуріну. або обернення прогресування або тяжкості стану Фігура 9. На графіку показано цитотоксичність або симптомів, що лікуються. По суті, термін "лікуазуріну до клітин MCF-7( ) та MDA-MB-157(), обвання", відповідно, включає медичне, терапевтичроблених різними концентраціями азуріну протяне та/або профілактичне застосування. гом 72 годин. Термін "стани, пов'язані з резистентністю до Фігура 10. На графіку показано регресію пухклітинної смерті", як його застосовано тут, віднолини MCF-7 у "голої" миші котрій введено азурін ситься до захворювання, стану або нездужання за, ( ) та контрольні тварини (). принаймні, тенденції до подовженого клітинного Фігура 11(A) та (B). Фігура 11(A) - таблиця на життя, порівняно із здоровими клітинами подібного котрій показано суміщення амінокислотних послітипу, як визначено достатньо досвідченим лікарем довностей азуріну P. aeruginosa з іншими бактеріабо клініцистом. Термін "стани, пов'язані зі сприйальними азурінуми. Амінокислотні послідовності нятливістю до клітинної смерті", відноситься до суміщено програмою Genetyx. Фігура 11(B) - табзахворювання, стану або нездужання за, принайлиця на котрій показано азурін дикого типу (wtмні, тенденції до передчасної клітинної смерті, азурін) та химерні мутантні азуріни. порівняно із здоровими клітинами подібного типу, Фіг.12(A) та 12(B). Фігура 12(A) діаграма, що як визначено достатньо досвідченим лікарем або показує цитотоксичність азуріну дикого типу та клініцистом. редокс мутантного по відношенню до клітин макТермін "той, що має функціональний пухлинрофагів. Азурін дикого типу (·), апо-азурін (‫,)ס‬ ний ген супресор р53" відноситься до клітини, котМ44КМ64Е (▲), С112D (D). ра має пухлинний ген супресор р53, котрий не є Фігура 12(B) - діаграма, що показує цитотоксиінактивованим, мутованим, втраченим або недочність азуріну дикого типу та химерного мутантноконаним. го по відношенню до клітин макрофагів. Азурін Термін "дефектний на пухлинний ген супресор дикого типу (·), SI (‫ ,)ס‬S2 (▲), S3 ( ), S4 (D), S6 (D), р53" відноситься до клітини, котра має пухлинний wtS5 (▼), wtS5S4S6 (¨), S3S5 (v). Фігура 12(B) ген супресор р53, котрий є інактивованим, мутовадіаграма, також показує відносну ефективність ним, втраченим або недоконаним. Наприклад, тапереносу електрону мутантів, виражену як його ка дефектність може траплятися як результат гевідсоток до азуріну дикого типу. Для визначення нетичних аберацій в гені р53, або взаємодії із відсотку цитотоксичності, кількість необроблених вірусними та клітинними онкогенами. життєздатних клітин була взята за 100% та визнаТермін "в значній мірі чистий", коли стосується чена кількість життєздатних клітин в зразках обротерміну "цитотоксичний фактор", як вжито тут, стоблених азуріном. сується цитотоксичного фактору, наприклад, цитоФігура 13 діаграма, що показує апоптозну актоксичного фактору, виділеного із секретованого тивність азуріну, апо-азуріну та мутантного азуріну ростового середовища, у формі досить вільній або по відношенню до клітин макрофагів. Азурін диконезабрудненій активними інгібуючими речовинами. Термін "в значній мірі чистий" стосується фактору го типу (·), апо-азурін (‫ ,)ס‬M44KM64E (▲), C112D в кількості більше 75% за масою від виділеної (D). фракції, або принаймні "в значній мірі на 75% чисФігура 14 діаграма, що показує цитотоксичтий". Термін "в значній мірі чистий" стосується реність азуріну дикого типу (wtazu ▲), рустиціанін човини в кількості більше 75% за масою від актив(неочищений ·), апо-рустиціанін (apo-rus ‫ ,)ס‬та ної речовини, або принаймні "в значній мірі на 75% псевдоазурін (Paz ). чистий". В значній мірі чистий цитотоксичний факФігура 15 діаграма, що показує цитотоксичтор може бути застосований в поєднанні з однією ність азуріну дикого типу (·) та пластоціаніну ( ). або більше в значній мірі чистих речовин або видіВизначення лених цитотоксичних факторів. Для потреб даного опису, тут, термін "цитотокТермін "варіант або похідне" цитотоксичного сичний фактор" відноситься до фактору, секретофактору, як вжито його тут, відноситься до речованого патогенним або непатогенним мікроорганівини або сполуки, одержаної хімічною модифікацізмом, котрий стимулює клітинну смерть через єю або маніпулюванням цитотоксичним фактором некроз або апоптоз, або спричиняє затримку кліабо геном, що кодує цитотоксичний фактор. Варітинного росту. Приклади цитотоксичних факторів ант або похідне цитотоксичного фактору може включають азурін, пластоціанін, рустиціанін, псевбути одержано хімічною модифікацією цитотоксидоазурін, або цитохром с551. Термін "АТФчного фактору або маніпулюванням генами, що залежний", коли вживається для модифікації теркодують цитотоксичний фактор, наприклад, зміною міну "цитотоксичний фактор", стосується цитотокосновного складу або характеристик цитотоксичсичного фактору, котрий спричиняє клітинну ного фактору, але не його токсичності. Подібним смерть або затримку клітинного росту в присутночином, "варіант або похідне" інгібітору цитотоксичсті аденозин-5'-трифосфату (АТФ). Термін "АТФного фактору може включати хімічну модифікацію незалежний", коли вживається для модифікації хімічної структури інгібітору або маніпулюванням терміну "цитотоксичний фактор", стосується цитогенами, що кодують інгібітор. токсичного фактору, котрий спричиняє клітинну Термін "відсоток (%) ідентичності амінокислотсмерть або затримку клітинного росту за відсутноної послідовності" визначається як відсоткове сті аденозин-5'-трифосфату (АТФ). співвідношення амінокислотних залишків цитотоксичного фактору котрі є ідентичними до амінокис 9 88272 10 4930-4937 (2000), зміст котрих повністю включено лотних залишків в порівнюваній послідовності, при через посилання]. Ферменти, що використовують суміщенні двох послідовностей. Для визначення % АТФ, діють на різні енергетично залежні похідні амінокислотної ідентичності, послідовності сумінуклеотидів, таких як АТФ, аденозин-5-дифосфат щаються й, за потреби, вставляються проміжки, (АДФ), аденозин-5-монофосфат (АМФ), або адещоб досягти максимального % ідентичності; коннозин, конвертуючи їх у різні продукти в свою черсервативні заміни не вважаються ідентичними в гу можуть модулювати смерть фагоцитів, таких як послідовності. Процедура суміщення амінокислотмакрофаги та тучні клітини через активацію пуриної послідовності для визначення відсотку подібнергічних рецепторів. 045 Один з аспектів даного ності є добре відомою спеціалістам в даній галузі. винаходу стосується відкриття того, що АТФЧасто вільно доступне програмне забезпечення, незалежні цитотоксичні фактори, наприклад ретаке як BLAST, BLAST2, ALIGN2 або Megalign докс протеїни, також секретуються деякими вида(DNASTAR) застосовується для суміщення пептими патогенних мікроорганізмів та того, що ці факдних послідовностей. тори спричиняють клітинну смерть через апоптоз. При суміщенні амінокислотних послідовнос[Zaborina et al., Microbiology, 146,2521-2530 (2000) тей, % амінокислотної послідовності подібний до зміст котрих повністю включено через посилання]. даної амінокислотної послідовності А до, із, або 046 Наступний аспект даного винаходу стосується порівняно із даною амінокислотною послідовністю неочікуваного відкриття того, що АТФ-залежні циВ (котра також може бути сформульована як амітотоксичні фактори індукують апоптоз або порунокислотна послідовність А, котра має або вклюшення клітинного росту в ракових клітинах. Такі чає певний % подібної амінокислотної послідовноцитотоксичні фактори можуть бути використані сті до, із або порівняно з амінокислотною для лікування станів пов'язаних із резистентністю послідовністю В) може бути обрахована як: до клітинної смерті. Такі стани можуть включати, % подібності амінокислотної послідовноснаприклад, меланому людини, лейкемію, рак гру= Х/Y·100 ті дей, рак яєчників, рак легенів, мезенхімальний рак, рак товстої кишки, так дихально-травних шляхів де (наприклад, раки шлунку, стравоходу, глотки та X є числом амінокислотних залишків прорахороту). 047 Звичайно ракові клітини не чутливі до ваних програмою або алгоритмом суміщення як апоптозної смерті. Така резистентність клітини до ідентичні співпадання А та В апоптозної клітинної смерті може бути спричинена та інактивуючими мутаціями в гені, що кодує пухлинΥ є загальним числом амінокислотних залишний ген супресор р53. Відомо, що клітинний апопків в В. тоз ссавців потребує протеїну р53. Однак в 50% Якщо довжина амінокислотної послідовності А раків людини мають місце інактивуючі мутації в не є рівною довжині амінокислотної послідовності гені, що кодує пухлинний ген супресор р53. В, то % ідентичності амінокислотної послідовності Хоча, також відомо, що р53 регулює експресію А до В не буде рівним % ідентичності амінокислоредокс-протеїнів в клітинах ссавців, редокс протетної послідовності В до А. їни ссавців прямо не впливають на апоптоз рако"Терапевтично ефективна кількість" є кількісвих клітин або порушення росту. Не було показано тю, ефективною для попередження розвитку або ролі мікробних АТФ-незалежних цитотоксичних полегшення існуючих симптомів особи, що лікуфакторів в індукуванні апоптозу в ракових клітинах ється. Визначення терапевтично ефективної кільабо в зменшенні розміру пухлини. кості є нормальною здатністю спеціаліста в даній Наступний аспект даного винаходу стосується галузі. методів визначення та визначення характеристик Даний винахід пропонує цитотоксичні фактори, цитотоксичних факторів секретованих мікроорганікотрі секретуються патогенними або непатогеннизмами. Ці способи можуть надати засоби відкриття ми мікроорганізмами та котрі стимулюють клітинну відповідних інгібіторів або стимуляторів клітинної смерть через некроз або апоптоз, або спричинясмерті. Інгібітори або стимулятори можуть бути ють затримку клітинного росту. Коли непатогенні розроблені як фармацевтичні препарати та викомікроорганізми проникають в тканини людини або ристовуватися для лікування станів, що характетварини, клітини-фагоцити стають першою ланкою ризуються резистентністю та сприйнятливістю до захисту в імунній системі хазяїна. Зазвичай, фагоклітинної смерті. цити вишукують й знищують чужорідні патогени, Інший бік винаходу стосується цитотоксичних що проникають в тіло. Однак, цитотоксичні фактофакторів, котрі було описано та виділено та інгібіри, що секретуються мікробами, можуть стимулюторів цих цитотоксичних факторів. Цитотоксичні вати клітинну смерть клітин-фагоцитів. Таким чифактори можуть бути активовані або інактивовані ном, заважаючи фагоцитам виконувати їхню у відповідності до способу даного винаходу для захисну імунну функцію. попередження або лікування станів пов'язаних із Раніше винахідники повідомляли про те, що клітинною смертю. Наприклад, цитотоксичний фабагато патогенних бактерій секретують АТФктор може бути застосований для лікування стану залежні цитотоксичні фактори, наприклад, фермепов'язаного із сприйнятливістю до клітинної смернти, що використовують АТФ, котрі спричиняють ті. смерть фагоцитів через некроз. Секреція цитотоксичних факторів [Zaborina О. et al., Infect. Immun. 67: 5231-5242 В одному аспекті даного винаходу, цитотокси(1999); Melnikov A. et al., Mol. Microbiol. 36: 1481чні фактори даного винаходу секретуються вели1493 (2000); and Punj V. et al., Infect. Immun. 68 : кою кількістю різних патогенних організмів, вклю 11 88272 12 секреція цитотоксичних факторів може бути досягчаючи бактерій та найпростіших. Приклади патонена ростом мікроорганізмів на ростовому серегенних бактерій придатних для створення цитотокдовищі в присутності протеїнів ссавців Придатнисичних факторів включають, але не обмежуються ми середовищами є , наприклад, L бульйон, до Pseudomonas aeruginosa (P.aeruginosa), поживний бульйон, Trypticase соєвий бульйон та Burkholderia cepacia (B.cepacia), Vibrio cholera триптоно-дріжджовий екстракт (Difco Laboratories, (V.cholera), та Mycobacterium bovis (M.bovis). ТаMaryland, U.S.A.). Звичайно, приблизно від 500мл кож, цитотоксичні фактори секретуються патогендо 1,000мл стерильного автоклавованого середоними, такими як Leishmania amazonensis та Brugia вища інокулюється від 104 до 106клітин/мл. Інокуmalayi. льоване середовище потім інкубується за умов P.aeruginosa, опортуністичний патоген, придатних для забезпечення росту мікроорганізму, В.серасіа, котрий спричиняє смертельну інфекцію звичайно на ротаційному шейкері при 30-37°С. у пацієнтів, котрі страждають на фіброзно-кістозну Вибір ростового середовища, умов інкубувандегенерацію, V.cholera, кишковий патоген, котрий ня, та інших факторів, котре робить можливим спричиняє холеру та повільно ростуча група мікоуспішне культивування бактерій та інших мікроорбактерій, таких як М. tuberculosis або M.bovis, котрі ганізмів буде зрозумілим спеціалісту в даній галузі. спричиняють туберкульоз та можуть секретувати Винахідники спостерігали, що максимум концентферменти, що використовують АТФ. рації цитотоксичних факторів в ростовому середоКрім секретування ферментів, що використовищі зустрічається наприкінці фази експоненціавують АТФ винахідниками відкрито, що льного росту та на початку стаціонарного росту. P.aeruginosa секретує АТФ-незалежні цитотоксичні В іншій реалізації даного винаходу, ідентифіфактори. Вони були ідентифіковані як два редокс кація рецепторів для ссавцевих протеїнів створює протеїни, азурін та цитохром с551. Було показано, можливість розділення вірулентних та авірулентщо В.серасіа може секретувати редокс протеїни. них штамів мікроорганізмів. Наприклад, присутТакож, було показано, що M.bovis може секретувати цитотоксичні фактори котрі мають високу АТФність рецепторів до a2-макроглобуліну переважно незалежну цитотоксичність спрямовану до фагов клінічних штамах, але не природних штамах, не цитів. лише корелює із здатністю першого до секретуСтимулювання секреції цитотоксичних фактовання цитотоксичних агентів як зброї проти захисрів в присутності протеїнів ссавців ту хазяїна, але також дозволяє розрізняти клінічні, В іншому аспекті даного винаходу, продукувірулентні штами та природні, авірулентні штами. вання та секреція цитотоксичних факторів стимуОтже, вірулентні штами організмів можуть бути люються під час росту патогенних організмів в ідентифіковані й потім протестовані на чутливість присутності протеїнів ссавців. Наприклад, секреції до антибіотиків або для інших клінічних цілей. цитотоксичних факторів патогенними мікроорганіСекреція АТФ-незалежних цитотоксичних факзмами такими як P.aeruginosa, M.bovis та В.серасіа торів стимулюються в присутності протеїнів ссавців таВ іншій реалізації даного винаходу, достатньо ких як каппа-казеїн, коров'ячий сироватковий альчисті АТФ-незалежні цитотоксичні фактори були бумін, овальбумін, a2-макроглобулін. Було припуодержані фракціонуванням колоночною хроматографією ростового середовища секретуючого мікщено, але тут напевно не доведено, що патогенні роорганізму. Переважно, бактеріальні клітини вимікроорганізми відчувають присутність певних далялися із ростового середовища перед протеїнів ссавців, що вказує на середовище хазяїфракціонуванням. на ссавця, й таким чином запускає механізм цитоЦе могло досягатися попереднім центригувантоксичних агентів, для протидії та руйнування заням та наступним фільтруванням ростового серехисту хазяїна. довища. Винахідниками було визначено що деякі клініПридатні фільтри звичайно мають розмір пор чні (вірулентні) культури В.серасіа секретують веменший або рівний 0.5мкм та переважно близько лику кількість ферментів, котрі використовують 0.2мкм. Також, інші способи видалення патогену АТФ, таких як аденілаткіназа або 5'-нуклеотидаза, будуть відомими спеціалісту в даній галузі. тоді як культури з навколишнього середовища Нефракціоноване ростове середовище не має (авірулентні) секретують лише малі кількості цих високої АТФ-незалежної цитотоксичної активності, ферментів. В клінічних культурах, таких як а отже фракціонування колоночною хроматограВ.серасіа штам 38, рівень секреції цитотоксичного фією є необхідним для посилення активності, що фактору значно збільшувався в присутності a2індукує апоптоз або порушення клітинного росту. макроглобуліну в ростовому середовищі. СекретоФракціонування видаляє АТФ-залежні цитотоксичвані продукти з клінічних культур мали вищий ріні фактори. Було припущено, але тут напевно не вень цитотоксичності по відношенню до макрофадоведено, фракціонування видаляє інгібітори АТФгів та тучних клітин ніж культури з навколишнього незалежних цитотоксичних факторів котрі можуть середовища. Клінічні ізоляти котрі показували підбути присутні в нефракціонованому ростовому вищену секрецію цитотоксичних факторів в присусередовищі. тності a2-макроглобуліну також показували наявХроматографічні методи корисні для очищенність рецепторів до a2-макроглобуліну на своїй ня цитотоксичних факторів будуть відомими спеціповерхні. алісту в даній галузі. Вони включають, наприклад, В іншій реалізації даного винаходу, продукуіон-обмінну хроматографію, гідроксиапатитну хровання та секреція АТФ-незалежних цитотоксичних матографію, афінну хроматографію, та гельфакторів стимулювалися під час росту мікрооргафільтраційну хроматографію. Придатні для фракнізмів в присутності протеїнів ссавців. Підвищена 13 88272 14 ціонування бактеріальних ростових середовищ зольним протеїном Apaf-1, за допомогою методу хроматографічні колони включають, наприклад: описаному в [Zou et al., J.Biol.Chem., 274:11549Hydroxyapatite; Superdex 75 або 200; Superose 6 11556 (1999), зміст котрих включено для всіх цілей або 12; Sephacryl S; Sephadex G або Sephadex LH; шляхом цього посилання]. Mono Q або Mono S; Q-Sepharose; DEAE Апоптоз може спостерігатися за допомогою Sepharose або CM Sepharose; Sepharose XL; ΑΤΦвизначення фрагментацій ядерної ДНК, індуковаSepharose; Hi Trap Blue; Blue Sepharose; DNA них апоптозом, за допомогою, наприклад, фрагмеCellulose або Sepharose 2B, 4B або 6В, котрі понтаційного набору APOLERT DNA (Clontech стачаються фірмою Amersham Pharmacia Biotech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A.). Цей AB, Uppsala, Sweden або Bio-Rad Laboratories, дослід базується на опосередкованому термінальHercules, California, U.S.A. ною дезоксинуклеотидилтрансферазою (Tdt) марФерменти, котрі використовують АТФ можуть куванні dUTP нерівних країв (TUNEL), де Tdt катабути виділені хроматографічним фракціонуванням лізує включення флуоресцеїн-dUTP до вільного 3'як проточним або елюцією фракцій гідроксиапатигідроксильних кінців фрагментованої ДНК в клітитних та АТФ-агарозних колон. При такому фракцінах, що зазнають апоптоз. Включення флуоресцеонуванні, ферменти, котрі використовують АТФ, їн-dUTP до фрагментованої ядерної ДНК спричитакі як АТФаза або аделаткіназа абсорбуються на няє зелену флуоресценцію, котра була визначена колонці й можуть бути потім видалені або очищені. конфокальною мікроскопією. [Дивись, наприклад, Markaryan et al., J.Bacteriol., В іншій реалізації даного винаходу, фракціо183, рр.. 3345-3352, 2001]. новані ростові середовища перевірялися щоб виВ іншій реалізації даного винаходу, АТФзначити здатність цих фракцій індукувати апоптоз незалежні цитотоксичні фактори виділяються як або порушення клітинного росту. Ці методи є копроточна фракція Q-сефарозної колони (QSFT). Qрисними для ідентифікації та опису характеристик сефароза є четвертинною амонійною сполукою із АТФ-незалежних цитотоксичних факторів. сильним іонним обмінником. Такі колони можуть Ідентифікація АТФ-незалежних цитотоксичних бути отримані від фірми Amersham Pharmacia факторів Biotech AB, Uppsala, Sweden. Супернатант (SUP) В іншому аспекті, даний винахід пропонує виабо інші колонкові фракції, такі як гідроксиапатитзначені цитотоксичні фактори котрі проявляють на проточна колонкова фракція (HAFT) або АТФАТФ-незалежну ініційовану апоптозом цитотоксичагарозна проточна колонкова фракція (AAFT) звиність або спричиняють затримку клітинного росту. чайно не демонструють високої АТФ-незалежної Винахідниками було з'ясовано, що фракція QSFT цитотоксичності. із P.aeruginosa та В.серасіа є збагаченою двома Опис характеристик АТФ-незалежних цитотокпротеїни, азуріном та цитохромом с551. Ідентифісичних факторів кація цих двох протеїнів ґрунтувалася на їхньому В наступний аспект даного винаходу, фракціорозділенні на SDS-PAGE та визначенні їхніх Nновані ростові середовища перевірялися на прикінцевих амінокислотних послідовностей. На просутність АТФ-незалежних цитотоксичних факторів. тилежність цьому, аналіз SDS-PAGE фракції QSFT Рівень клітинної смерті міг вимірюватися за вивііз M.bovis дав тонку смугу 65кДа коров'ячого сирольненням міжклітинного ферменту лактатдегідроваткового альбуміну (BSA), котрий є компонентом генази (LDH) як описано в [Zaborina et al., Infection середовища 7Н9 котре використовується для виand Immunity, 67, 5231-5242 (1999) та Zaborina et рощування M.bovis, а також декілька смуг більше al., Microbiology, 146,2521-2530 (2000), зміст котрих за молекулярну масу 45кДа, але не смуги характевключено для різних цілей шляхом цього посиланрні для цитохрому с551 та азуріну. (Дивись приклад ня]. 9). Здатність АТФ-незалежних цитотоксичних фаАзурін та/або цитохром с551 та фракції QSFT кторів індукувати апоптоз може спостерігатися за демонстрували ініційовану апоптозом цитотоксичдопомогою мітосенсору ApoAlert із конфокальною ність до фагоцитів. Окремо, цитохром с551 спричимікроскопією з використанням MITOSENSORTM няв порушення клітинного росту. Очищена суміш APOLERT ТМ мітохондріально-мембранного сеназурін/цитохром с551 або фракція QSFT із сорного набору [Clontech Laboratories, Inc., Palo В.серасіа була оброблена сумішшю антитіл до Alto, California, U.S.A.]. В досліді, здорові, неапопазуріну та цитохрому с551, мала значно меншу цитозні клітини флуоресціюють червоним, тоді як тотоксичність до макрофагів. На протилежність апоптозні мертві клітини флуоресціюють зеленим. цьому, фракція QSFT із M.bovis, коли була обробКомбінація червоного та зеленого дає жовту флулена антитілами до азуріну та цитохрому С551, оресценцію клітин, що вказує на апоптично вмидемонструвала дуже мале зниження цитотоксичраючі клітини. [Дивись Zaborina et al., Microbiology, ності, що підтверджує те, що фракція QSFT із 146,2521-2530 (2000), зміст котрих включено для M.bovis містить цитотоксичні фактори інші ніж азурізних цілей шляхом цього посилання]. рін та цитохром с551. Отже, різні патогени секретуАпоптоз опосередковується через активацію ють різні цитотоксичні фактори, індукуючі апоптоз каскаду ферментів відомих як каспази, котрі є цисабо порушення клітинного росту, кожні з яких мотеїновими протеазами, що розщеплюють апарагіжуть бути відмінними мішенями для розвитку ліків. нові залишки. Отже, апоптоз також може бути виАТФ-незалежні цитотоксичних фактори. явлено визначенням двох важливих каспазних І. Купредоксинові сполуки активностей, а саме каспаза-9 та каспаза-3, про Ці малі сині протеїні міді (купредоксини) є прокотрі відомо, що вони активуються при апоптозі теїнами передачі електронів (10-20кДа) котрі беолігомеризацією цитохрому С із мітохондрій циторуть участь в бактеріальних редокс-ланцюгах, фо 15 88272 16 коротким (приблизно 4Å) і включає ліганд міді Hisтосинтезу або в невідомих процесах. Іон міді є 87, котрого було піддано дії розфактора в гідроміцно зв'язаним із протеїновим матриксом. Просфобній «ділянці», тоді як другий шлях набагато торово викривлене трикутне плоске розташування довше (приблизно 12-15Å) і включає майже конседвох гістидинових та одного цистеїнового ліганду рвативний залишок Туr-83 в негативній «ділянці» навколо міді створює специфічні умови для елект[Redinbo et al., J. Bioenerg. Biomembr., vol.26 (1), рону металічного сайту та інтенсифікує синій коpp.49-66 (1994), зміст якого включений для всіх лір. Кількість купредоксинів у середовищі було цілей на підставі цього посилання]. досліджено кристалографічно в середовищі при Рустіціаніни високій роздільній здатності. Рустіціаніни є одноланцюговими поліпептидаАзурін ми блакитного забарвлення, котрі містять мідь, Азуріни є протеїнами, що містять мідь й мають отриманими із тіобацил. Рентгенівська кристалічна 128 амінокислотних залишків котрі відносяться до структура оксидованої форми надзвичайно стабісімейства купредоксинів й беруть участь в перельного і такого, що має високу окислювальною дачі електрону в рослинах та певних бактеріях. дією купредоксину рустіціаніну з Thiobacillus Азуріни включають купредоксини із P.aeruginosa ferrooxidans (SEQ ID NO: 3) була визначена шля(PA) (SEQ ID NO: 1), A.xylosoxidans, та хом багатохвильової аномальної дифракції і довеa.denitrificans, Murphy, L.M.et al., J.Mol.Biol., дена до роздільної здатності 1,9Å. Рустіціаніни vol.315, pp 859-71 (2002), зміст котрих включено складаються з центральної бета-сендвіч складки, для різних цілей шляхом цього посилання. Хоча що складається з шести- та семитяжового бетагомологія послідовностей між азурінуми коливалиста. Як і в інших купредоксинах, іон міді скоорється між 60-90%, структурна гомологія у цих модинований кластером чотирьох консервативних лекул дуже висока. Усі азуріни мають характерний залишків (His 85, Cysl38, His143, Metl48), структуb-сендвіч із т.з. фрагментом "Greek key" та єдиним рованих у вигляді деформованого тетраедра. атомом міді, завжди розташованим в одному регі[Walter, R. L. et al., J. Mol. Biol., vol.263, стр.-730-51 оні протеїну. Крім того, азуріни мають переважно (1996), зміст якого включений для всіх цілей на нейтральну "ділянку", котрий оточує мідний сайт підставі цього посилання]. [Murphy et al.]. Псевдоазуріни Пластоціаніни Псевдоазуріни є сімейством одноланцюгових Пластоціаніни є розчинними білками еукаріополіпептидів блакитного забарвлення, котрі містичних рослин, що містять один атом міді на молетять мідь. Амінокислотна послідовність псевдокулу, і в оксидованій формі мають блакитне забаразуріну, одержаного з Achrorraobacter cycloclastes, влення. Вони містяться в хлоропласті, в якому приведена в SEQ ID NO: 4. Ренгенографічний вони виконують функцію переносу електронів. З структурний аналіз псевдоазуріну показує, що він часу визначення структури тополиного пластоціамає структуру аналогічну до структури азурінів, ніну в 1978р. структуру водоростевих хоча між цими білками існує низька гомологія по(Scenedesmus, Enteromorpha, Chlamydomonas) і слідовності. Між загальною структурою псевдоазурослинних (квасоля звичайна) пластоціанінів вирінів і азурінів є дві істотні відмінності. По віднозначали з використанням або кристалографічного шенню до азурінів в псевдоазурінів є методу, або методу ядерний-магнітного резонансу, карбоксикінцеве подовження, що складається з а структура тополиного пластоціаніну була доведвох альфа-спіралей. У серединному пептидному дена до роздільної здатності 1,33Å. На SEQ ID NO: регіоні азурін містить подовжену петлю (ця петля 2 приведено амінокислотну послідовність пластовкорочена в псевдоазурінів), що формує клапанціаніну з Phormidium laminosum. ний фрагмент, котрий містить коротку альфаНе незважаючи на розходження в послідовноспіраль. Єдина істотна відмінність в місці приєдстях серед пластоціанінів водоростей і судинних нання атома міді полягає в конформації MET бічрослин (наприклад, 62%-а ідентичність послідовного ланцюга і довжини зв'язку MET-S міді, яка ностей між Chlamydomonas і тополиними білками), істотно коротша в псевдоазуріні, ніж в азуріні. тривимірні структури зберігаються (наприклад, II. Цитохром с551 середньоквадратичне відхилення 0,76Å позицій С Цитохром с551 з P. aeruginosa (Pa-c551) є моноальфа між Chlamydomonas і тополиними білками). мірним редокс-білком із 82 амінокислотними заСтруктурні характеристики включають деформолишками (SEQ ID NO: 5), котрий бере участь в ване тетраедр місця зв'язування міді на одному дисиміляційному денітрифікуванні, як фізіологічкінці антипаралельного восьмитяжового бетаний донор електронів нітритредуктази. Функціонациліндра, яскраво виражений негативну «ділянку» льні властивості Ра-с551 були глибоко досліджені. і плоску гідрофобну поверхню. Центр сполучення Реакції з нефізіологічними низькомолекулярними атома міді пристосований для виконання його фунеорганічними редокс-реактантами та з іншими нкцій переносу електрона, і припускатися, що немакромолекулами, такими як сині білки, що містять гативна і гідрофобна «ділянки» беруть участь в мідь, еукаріотичним цитохромом с і нітритредуктарозпізнаванні, партнерів фізіологічної реакції. Хімізою фізіологічного партнера забезпечили провечна модифікація, крос-зшивання і експерименти дення тесту на білок-білковий перенос електрона. сайт-специфічного мутагенезу підтвердили важлиТривимірна структура Ра-с551, що входить в вість негативних і гідрофобних «ділянок» у взаєбактерійний клас І цитохромів, має одиничний нимодіях зв'язку з цитохромом f, а також підтвердили зькоспіновий гем з легуванням His-Met і типовою модель два функціонально важливих шляхів пеполіпептидною складкою, яка, проте, залишає ренесу електрону в пластоціаніні. Один передбакромки пірольних кілець II і III гема відкритими чуваний шлях перенесення електрона є відносно 17 88272 18 [Cutruzzola et al., J. Inorgan. Chem., vol 88, pp. 353комплекс з білком р53, що пригнічує пухлину, і 61 (2002), зміст якого включений для всіх цілей на стабілізувати його. р53 діє як ген, «що пригнічує підставі цього посилання]. Відсутність 20 залишків пухлину», і його недостатнє вироблення або інакомега-петлі, яка присутня в класі І цитохромів, тивація, зумовлена мутацією, може привести до викликає подальше відкриття гемінового краю на розвитку пухлини. рівні пропіонату 13. Розподіл заряджених залишків Час напіврозпаду р53 в клітині зазвичай склана поверхні Ра-с551 є виключно анізотропним: одна дає лише декілька хвилин. Стабілізація р53 забезсторона багатше кислотними залишками, тоді як печує суттєвий генерацію реактивних видів кисню на іншій стороні є кільце позитивних бічних ланцю(ROS), що є потенціальними стимуляторами апопгів, головним чином, лізинів,розташованих на межі тозу. Азурін утворює комплекс з р53, стабілізує гідрофобних «ділянок», що оточують гемінову щійого і підвищує його внутрішньоклітинний рівень, лину. Ця «ділянка» містить залишки Gly11, Val13, викликаючи тим самим апоптоз за каспаза-3 і каAla14, Met22, Val23, Pro58, Ile59, Рrо60, Рrо62, паза-9-залежними мітохондріальними шляхами Рrо63 і АІа65. Анізотропний розподіл зарядів при[Yamada, Т. et al., Infec. Immun., vol. 70, pp. 7054-62 водить до великого дипольного моменту, що є (2002), зміст якого включений для всіх цілей даним важливим фактором для формування комплексу посиланням]. переносу електрона. Редокс-активність азуріну не є важливою для Про розподіл зарядів, описаних вище для Paйого цитотоксичної активності. Навпаки, генерація C551, повідомлялося відносно інших білків, що береактивних видів кисню в процесі формування руть участь в переносі електрона і їх акцепторів комплексу є стимулюючим фактором для апоптоелектронів. Більш того, модифікація залишків зу. [Goto, Μ. et al., Mol. Microbiol., 47, pp.549-59 шляхом сайт-специфічного мутагенезу всередині (2003), зміст якого включений для всіх цілей цього гідрофобної або зарядженої «ділянки» продемонспосилання]. Наприклад, апо-азурін, що має амінотрувала важливість поверхневої комплементарнокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, але не міссті для зв'язування і переносу електрона відносно тить атом міді, володіє значно нижчою редоксрізних білків. Як приклад підтвердження значення активністю в порівнянні з азуріном, але проявляє гідрофобної «ділянки» для властивостей переносу істотну цитотоксичну активність. електронів азуріну з P. aeruginosa було одержане Важливість комплексоутворення з р53 проілюза результатами проведених досліджень по мутастрована на основі відмінностей цитотоксичної нтах залишків Met44 і Met64, змінених на позитивактивності двох мутантних азурінів, С 112D (SEQ но і негативно заряджені амінокислоти. [Cutruzzola ID NO: 6) та подвійного мутанта М44КМ64Е (SEQ et al.]. ID NO: 7). Зв'язування міді із залишком Cys-112 є Індукція апоптозу або затримки росту ракових важливим для редокс-активності. Мутант C112D, клітин за допомогою АТФ-незалежних цитотоксичщо є дефектним на координування з міддю, має них факторів редокс-активність, що становить приблизно 0,01% У даному винаході пропонуються способи вивід активності азуріну, проте проявляє істотну цикористання АТФ-незалежних цитотоксичних фактотоксичність. При порівнянні мутант М44КМ64Е торів з метою індукції апоптозного некрозу клітин володіє редокс-активністю, що становить приблизабо затримки клітинного росту в ракових клітина. но 2% від активності азуріну, але проявляє незнаАТФ-незалежні цитотоксичні фактори, такі як спочну цитотоксичність. луки купредоксину і цитохром с551 можуть бути Молекула азуріну містить гидрофобну «ділянвикористані для лікування захворювань, пов'язаку», тобто місце взаємодії фізіологічних партнерів них з патологічним порушенням некрозу клітин. - цитохрому с551 і нітритредуктази. [Cutruzzola et Добре відомо, що ракові клітини не схильні до al.]. Мутант C112D, в якому гидрофобна «ділянка» апоптозу. Згідно одному аспекту даного винаходу є незмінною, здатний формувати комплекси з р53 і введення цитотоксичного фактора або активної підвищувати його внутрішньоклітинний рівень. речовини, що стимулює секрецію цитотоксичного Проте, подвійний мутант М44КМ64Е, в якому елекфактору в кількості, достатній для стимулювання тричний диполь створений в гідрофобній «ділянапоптозу ракових клітин або затримки клітинного ці», не здатний формувати такі стабільні комплекросту, є ефективним для зменшення розміру пухси. Отже, сайт взаємодії з цитохромом с551 і лини in vivo і уповільнення росту пухлини. Напринітритредуктазою також є важливим для формуклад, проведені тести для порівняння ефективносвання комплексу з р53. ті азуріну та цитохрому с551 з відомими засобами Було використані pull-down методи центрифупроти злоякісної меланоми [5-(3,3'-N,N'гування з градієнтом щільності гліцерину і глютадиметилтриазен-1-ил)-імідазол-4-карбоксиамід] тион S-трансферазы (GST) для демонстрації вза(DTIC) показують, що суміш азуріну та цитохрому ємодії сполук купредоксина з р53. [Yamada et al. с551 дає сильнодіючу нетоксичну композицію, що (2002), зміст якого включений для всіх цілей на стимулює регресію пухлини in vivo у „голих" (безпідставі справжнього посилання]. Як відомо, р53 тимусових) мишей. утворює олігомерні комплекси і гібридний білок У одному прикладі здійснення даного винахоGST-p53 осідає при різних фракціях гліцерину, ду пропонується спосіб, в якому лікування з викотаких як 5, 10, 15, 20 або 25% гліцерин, тоді як ристанням сполуки купредоксину, наприклад азуазурін осідає при 5% гліцерину. Попередня інкубаріну, спричиняє апоптозний клітинний некроз у ція азуріну з гібридним білком GST-p53 з наступракових клітин. Не обмежуючись теорією, вважаний центрифугуванням в градієнті щільності гліцеється, що цитотоксична активність сполуки купрерину продемонструвала присутність азуріну у всіх доксину зумовлена його здатністю формувати фракціях гліцерину, що вказує на його зв'язок з 19 88272 20 Фармацевтичні композиції, що включають цир53. Мутант C112D, але не мутант М44КМ64Е, тотоксичні фактори продемонстрував аналогічний зв'язок. [Yamada et Фармацевтичні композиції, що включають циal. (2002)]. тотоксичні фактори, можуть бути виготовлені з Попередня інкубація гібридного білку GST-p53 використанням будь-яких відомих технологій, наз мутантом азуріном М44КМ64Е змінило олігомеприклад, з використанням технологій змішування, ризацію р53, внаслідок чого більшість GST-p53 розчинення, гранулювання, дражування, емульгубули виявлені при 5-10% гліцерині, де також був вання, інкапсулювання, поглинання або ліофілізувиявлений мутант азурін. Це вказує на те, що гідвання. В основному чистий цитотоксичний фактор рофобна «ділянка» азуріну також бере участь у або інша речовина можуть бути заключені у фарвзаємодії з р53. Втрата гідрофобності азуріну не мацевтично прийнятний носій, добре відомий в тільки призводить до втрати цитотоксичності, але даній області техніки. Такі носії дозволяють виготакож перешкоджає процесу олігомеризації. Не товити препарат у вигляді таблетки, пігулки, драдивлячись на те, що мутант М44КМ64Е демонже, капсули, рідини, гелю, сиропу, суспензії, суструє незначне стимулювання апоптозу, він все ж спензії і т.п. Прийнятні наповнювачі також можуть таки проявляє істотне інгбування розвитку клітинвключати, наприклад, добавки і препарати целюного циклу. Таким чином, зміна природи комплексу лози. Інші наповнювачі можуть включати, наприр53-купредоксин здатна змінити специфічність р53 клад, ароматизатори, фарбники, розпушувачі, завід апоптозу до затримки клітинного росту. гусники і інші прийнятні добавки, активатори або Дія азуріну залежить від пухлинної клітина, що речовини, що зв'язують. має функціональний ген-супресор пухлини р53. Композиції відповідно до даного винаходу моПроте, цитотоксичні фактори також можуть сприжуть бути використані при лікуванні захворювань, чиняти уповільнення росту клітин, що мають депов'язаних з некрозом клітина, або при його профектний ген-супресор пухлини р53. Наприклад, філактиці. В достатньо чистий цитотоксичний факцитохром с551 не впливає на р53, але істотним тор може бути введений в кількості достатній для чином підвищує рівень білка р16, що пригнічує профілактики або лікування захворювання, пов'япухлину. с551 інгібує розвиток клітинного циклу у заного з некрозом клітин. Зазвичай організм-хазяїн макрофагів, а також підвищує ефект азуріну. Крім є ссавцем, таким як людина або тварина. того, поєднання цитотоксичних фактор, таких як Застосування композицій, що включають цитоазурін і с551 (або М44КМ64Е) дозволяють досягти токсичні фактори ефективнішого інгібування розвитку пухлини шляКомпозиції відповідно до даного винаходу мохом стимулювання як апоптозу, так і затримки кліжуть бути введені шляхом використання будьтинного росту. якого прийнятного способу, наприклад, орально, З огляду на те, що режим дії цитохрому с551 не буккально, інгаляційно, під'язиково, ректально, залежить від наявності р53 в клітині, пропонується вагінально, трансуретрально, назально, місцево, спосіб регресії раку в 50% видів ракових захворючерезшкірно, тобто, трансдермально або парентевань людини, що характеризуються недоліком рально (включаючи внутрішньовенне, внутрішньогену-супресору пухлини р53. Додатково до с551 інші цитохроми, наприклад, цитохром f з ціанобакм'язове, підшкірне і внутрішньокоронарне введентерій також проявляє цитотоксичність. ня). Композиції і їх фармацевтичні лікарські форми Цитотоксичні фактори при лікуванні інфекційможуть бути введені в будь-якій кількості, що є них хвороб ефективною, для досягнення поставленої мети. У іншому прикладі здійснення даного винаходу Зокрема, вводиться в терапевтично ефективній опис характеристик цитотоксичних факторів може кількості. бути корисним для ідентифікації нових речовин, У різних прикладах здійснення композиція цищо інгібують некроз клітин, наприклад, при інфектотоксичних факторів включає носії і наповнювачі ційному захворюванні. Наприклад, інгібування се(включаючи буферні розчини, вуглеводи, манітол, креції або активності цитотоксичного фактора, що білки, поліпептиди або амінокислоти, такі як глівикористовує АТФ, або продукування АТФ може цин, антиоксиданти, бактеріостати, хелатні добавзнизити або усунути цитотоксичну активність патоки, суспендуючі агенти, загусники і/або консервангену, що спричиняє захворювання. ти, але не обмежуючись ними), воду, олії, сольові Відповідно, належне застосування сполуки, що розчини, водні розчини декстрози і гліцерину, інші інгібірує секрецію, або активність цитотоксичного фармацевтично прийнятні додаткові речовини в фактору, дозволяє одержати ефективний інструцілях наближення до фізіологічному стану, такі як мент для протиінфекційних розробок. Приклади буферні речовини, речовини для регулювання активних речовин, що є ефективними для інгібутонічності, змочуючі речовини і т.д. Слід визнати, вання цитотоксичних факторів, що викликають що, не дивлячись на те, що будь-який прийнятний некроз клітин, можуть включати антитіла для цитоносій, відомий фахівцям в даній області техніки, токсичних факторів, а також аналоги АТФ, що заможе бути використаний для застосування компопобігають активації ферментів, використовуючих зицій відповідно до даного винаходу, тип носія АТФ. Приклади цитотоксичних факторів і активних залежатиме від способу введення. Сполуки також речовин для інгібування або стимулювань секреможуть бути інкапсульовані всередині ліпосом з тирования або експресії цитотоксичних факторів використанням добре відомих технологій. Як носії включають ферменти, що використовують АТФ, для фармацевтичних складів відповідно до даного редокс-білки, активатори вироблення АТФ, інгібівинаходу можуть бути також застосовані біорозктори вироблення АТФ, активатори редокс-білків і ладні мікросфери. Опис прийнятних біорозкладних інгібітори редокс-білків, але не обмежені ними. мікросфер викладений, наприклад, в патентах 21 88272 22 США №№ 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; парати целюлози, гранулюючі речовини і зв'язуючі 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344 і речовини. 5,942,252. Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують Композиції відповідно до даного винаходу моцитотоксичні фактори, можуть бути вставлені у жна стерилізувати з використанням відомих сповектори і використані як вектори генної терапії. собів стерилізації або піддати стерилізації фільтВектори генної терапії можуть бути введені пацієнрацією. Отримані водні розчини можна пакувати тові, наприклад, шляхом внутрішньовенної ін'єкції, для застосування в початковому вигляді або момісцево [Nabel et al., Патент США №5,328,470 жуть бути ліофілізовані, при цьому ліофілізований 1994, США] або шляхом стереотаксичної ін'єкції препарат комбінують із стерильним розчином до [Chen et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, vol. 91, pp. його введення. 3054-7 (1994)]. Фармацевтичний препарат вектора Композиції цитотоксичних факторів відповідно генної терапії може включати прийнятний розчиндо даного винаходу можуть вводитися різними ник або матрицю із сповільненим вивільненням способами, зокрема шляхом ін'єкцій (наприклад, лікарської речовини, в яку введено носій для доінтрадермально, підшкірно, внутрішньом'язово, ставки гена. У альтернативному випадку, коли інтраперитонеально і т.д.), інгаляцій, місцево, суготовий вектор для доставки гену може бути отрипозитарно, з використанням черезшкірного пласманий непошкодженим з рекомбінантних клітин, тиру або орально. наприклад, ретровірусні вектори, фармацевтичний При ін'єкційному введенні цитотоксичний факпрепарат може включати одну або декілька клітин, тор може бути отриманий у водних розчинах, пещо виробляють систему для доставки гена. реважно у фізіологічно сумісних буферних розчиІнші зручні носії, добре відомі в даній області нах, таких як розчин Хенкса, розчин Рінгера або техніки, також включають багатовалентні носії, такі фізіологічний сольовий буферний розчин. Розчин як бактерійний капсулярний полісахарид, декстран може містити рецептурні речовини, наприклад або генно-інженерний вектор. Крім того, композисуспендуючі, стабілізуючі і/або диспергуючі речоція із сповільненим вивільненням, що включає вини. Крім того, композиція цитотоксичних фактомолекули цитотоксичних факторів, забезпечує рів може мати порошкоподібну форму для вклювивільнення цитотоксичних факторів протягом чення її до складу прийнятного носія, наприклад, тривалого періоду часу таким чином, що без комстерильної апірогеної води перед застосуванням. позиції із сповільненим вивільненням цитотоксичПри інгаляційному введенні цитотоксичні факний фактор був би виведений з організму пацієнта тори можуть вводитися у вигляді аерозольного і/або зруйнований, наприклад, протеазами або аерозолю з балончика або аерозольного апарату шляхом проведення простого гідролізу до прояву із застосуванням прийнятного газу-витіснювача, або підвищення терапевтичного ефекту. наприклад, дихлордифторметану, трихлорфторТочний рецептурний склад, спосіб введення і метану, двоокису вуглецю або іншого прийнятного дозування визначаються лікарем, що лікує, з урагазу. У випадку аерозолю, що подається під тисхуванням стану пацієнта. Доза і інтервал часу між ком, пристрій дозування може бути оснащений прийомами можуть регулюватися індивідуально клапаном для подачі дозованої кількості аерозодля забезпечення рівнів активного цитотоксичного лю. Можуть бути виготовлені, наприклад, желатифактора у плазмі, які є достатніми для підтримки нові капсули або ампули, що містять порошкову терапевтичного ефекту. Як правило, необхідний суміш білків і прийнятної порошкової основи, такої цитотоксичний фактор вводиться в суміші з фаряк лактоза або крохмаль для застосування в інгамацевтичним носієм, вибраним залежно від необляторах або інсуфляторах. хідного способу введення і звичайної фармацевПри місцевому введенні, композиція цитотоктичної практики. Фармацевтичні композиції, сичних факторів може бути отримана у вигляді використовувані відповідно до даного винаходу, розчинів, гелів, мазей, кремів, суспензій і т.д., які можуть бути отримані відомими способами із задобре відомі в даній галузі техніки. У ряді прикластосуванням одного або декількох фізіологічно дів здійснення, застосування проводиться за доприйнятних носіїв, що включають наповнювачі і помогою черезшкірного пластиру. При супозитардопоміжні речовини, що полегшують процесинг ному введенні (наприклад, ректально або цитотоксичного фактора, активних речовин для вагінально) композиції цитотоксичних факторів інгібування або стимулювання секреції цитотоксиможуть бути також отримані в складах, що містять чних факторів або їх сумішей в препаратах для відомі супозитарні основи. терапевтичного застосування. У одному прикладі здійснення доставка цитоПри оральному введенні, композиція цитотоксичних факторів може бути отримана шляхом змітоксичного фактора здійснюється у вигляді ДНК шування цитотоксичного фактора з фармацевтичтак, щоб поліпептид вироблявся in situ. У одному но прийнятними носіями добре відомими в даній прикладі здійснення ДНК є «безоболонковою», [як описано, наприклад, Ulmer etal., Science, vol. 259, галузі техніки. Може бути використаний твердий стр. 1745-49 (1993) і розглянуто Cohen, Science, носій, такий як манітол, лактоза, стеарат магнію і т.д.; такі носії забезпечують отримання хемотаксиvol. 259, стр. 1691-92 (1993)]. Засвоєння безобону у вигляді пігулок, пілюль, драже, капсул, рідини, лонкової ДНК може бути підвищене шляхом нанесення ДНК на носій, наприклад, біорозкладні сфегелів, сиропів, суспензій і т.п. для їх прийому усередину пацієнтом, що приймає лікування. Для ричні частинки, які ефективно переносяться в клітини. При застосуванні таких способів, ДНК мооральних твердих лікарських форм, наприклад, таких як порошки, капсули і пігулки, прийнятні наже бути присутня всередині будь-якої з широкого діапазону систем доставки, відомих фахівцям в повнювачі включають добавки, такі як цукор, пре 23 88272 24 даній області техніки, включаючи системи експреРоздільна упаковка компонентів забезпечує їхнє тривале зберігання без втрати функцій активних сії нуклеїнових кислот і системи експресії бактерій і вірусів. Способи включення ДНК в такі системи компонентів. експресії добре відомі фахівцям в даній області Реагенти, включені в комплекти, можуть потехніки. [Див., наприклад, WO90/11092, ставлятися в тарі будь-якого вигляду так, щоб WO93/24640, WO93/17706 і патент США зберігався термін придатності різних компонентів і №5,736,524]. щоб вони не були адсорбовані або змінені матеріВектори, використовувані для човникового алом тари. Наприклад, герметичні скляні ампули транспортування генетичного матеріалу від оргаможуть містити ліофілізований цитотоксичний понізму до організму, можуть бути розділені на два ліпептид, або полінуклеотид, або буферні розчини, основні класи: клонуючі вектори відтворюють плаякі були упаковані в атмосфері нейтрального, незміду або бактеріофаг з областями, що є неістотреакційного газу, такого як азот. Ампули можуть ними, для поширення у відповідній клітині-хазяїні і бути виготовлені з будь-якого прийнятного матерів які може бути введена чужорідна ДНК; чужорідна алу, такого як скло, органічні полімери, наприклад, ДНК відтворюється і розповсюджується, неначебто полікарбонат, полістирол і т.д., кераміка, метал вона була компонентом вектора. Вектор експресії або будь-який інший матеріал, звичайно викорис(наприклад, плазміда, дріжджі і геном вірусу тватовуваний для зберігання аналогічних реагентів. рин) використовується для введення чужорідного Інші приклади прийнятної тари включають прості генетичного матеріалу в клітину-хазяїна або ткапляшки, які можуть бути виготовлені з аналогічних нину з метою транскрипції або трансляції чужорідречовин, як і ампули, і м'яку упаковку, що має внуної ДНК, наприклад ДНК цитотоксичного фактора. трішнє покриття з фольги, наприклад, з алюмінію У векторах експресії введена ДНК функціонально або сплаву. Інші види тари включають пробірки, пов'язана з такими елементами, як промотори, що бульбашки, флакони, пляшки, шприци і т.д. Тара сигналізують клітині-хазяїну транскрибувати встаможе бути оснащена стерильним вхідним отвовлену ДНК. Деякі промотори є надзвичайно ефекром, і як пляшки оснащені пробкою, яку можна тивними, наприклад індуковані промотори, що репроколоти голкою шприца для підшкірних ін'єкцій. гулюють транскрипцію гена у відповідь на Інші види тари можуть бути забезпечені двома специфічні фактори. Функціональнo зв'язок полінувідділеннями, розділеними мембраною, що легко клеотиду цитотоксичного фактора з індукованим видаляється, після видалення якої відбувається промотором дозволяє регулювати експресію полізмішування компонентів. Мембрани, що видаляпептиду цитотоксичного фактора або фрагментів. ються, можуть бути виготовлені з скла, пластика, Приклади класичних індукованих промоторів гуми і т.д. включають промотори, що реагують на аКомплекти також можуть бути забезпечені інінтерферон, тепловий шок, іони важких металів і струкціями. Інструкції можуть бути віддруковані на стероїди, наприклад глюкокортикоїди [Kaufman, папері або іншому носієві і (або) можуть поставляMethods Enzymol., vol. 185, pp. 487-511 (1990)] і тися у вигляді машиночитаного носія, такого як тетрациклін. Інші бажані індуковані промотори гнучкий диск, CD-ROM, DVD-ROM, Zip диск, відеовключають промотори, що не є ендогенними для плівка, аудіоплівка і т.д. Детальні інструкції можуть клітин, в які вводиться конструкція, але, проте, бути не пов'язані фізично з комплектом; натомість реагують в цих клітинах, коли подається екзогенно користувачеві може бути дана вказівка звернутися стимулююча речовина. В цілому, ефективними до веб-сайту в Інтернеті, вказаного виробником векторами експресії часто є плазміди. Проте, розабо дистриб'ютором комплектів, або інструкції моглядаються інші форми векторів експресії, такі як жуть надсилатися електронною поштою. вірусні вектори (наприклад, відтворення дефектСтимулювання і інгібування секреції цитотокних ретровірусів, аденовірусів і аденоасоційованих сичних факторів. вірусів). Ідентифікування і характеризування цитотокВибір вектора зумовлюється використовувасичних факторів також може привести до розробки ним організмом або клітинами і бажаним признаспособів стимулювання секреції цитотоксичних ченням вектора. В цілому, вектори включають факторів. Як було показано, патогенні організми одиничні послідовності, області початку реплікації, декретують велику кількість цитотоксичних фактомаркерні гени, енхансерні елементи , промотори й рів у присутності білків ссавців. Цей принцип може послідовності, що термінують транскрипцію. бути модифікований в організмі людини з метою Комплекти, що містять цитотоксичні фактори створення нових способів стимулювання потрібноЗгідно одному аспекту винаходу, пропонується го або інгібування небажаного виробництва цитокомплект, що містить один або декілька наступних токсичних факторів. Такі способи є ефективними компонентів, що знаходяться в упаковці або кондля інгібування або стимулювання апоптозу клітин тейнері: (1) біологічно активна композиція, що або ініціації затримки клітинного зростання. Розувключає цитотоксичний фактор; (2) фармацевтичміння цитотоксичних факторів, а також їх досліно прийнятний ад'ювант або наповнювач; (3) ападження і розробка також забезпечують розробку рат для введення, наприклад шприц; і (4) інструкції лікарських препаратів і скринінгу активних речовин по введенню. Також розглядаються приклади здійі композицій, прийнятних для модуляції активності снення, в яких два або декілька компонентів (1), або секреції цитотоксичних факторів. Розуміння (4) знаходяться в одному й тому ж контейнері. механізму секреції, пов'язаного з секрецією цитоПри постачанні комплекту різні компоненти токсичних факторів в клітинах, створює нові додакомпозиції можуть бути упаковані в окрему тару і ткові шляхи розробки і створення ефективних інгізмішані безпосередньо перед застосуванням. біторів або стимуляторів цитотоксичних факторів. 25 88272 26 Розмежування і ідентифікація присутності рецепзміні. Амінокислоти, для яких можуть бути проветорів для білків ссавців також можуть бути викоридені консервативні заміщення, добре відомі в дастані як засіб диференціації між вірулентними і ній області техніки. авірулентними мікроорганізмами, які можуть заЕфективні консервативні заміщення приведені безпечити специфічний підхід при лікуванні захвов таблиці 1 «Переважні заміщення». Консервативрювання. ні заміщення, що забезпечують заміну амінокислоМодифікація цитотоксичних факторів ти одного класу іншою амінокислотою того ж типу, Цитотоксичні фактори також можуть бути хіміпідпадають під об'єм винаходу за умови, що замічно модифіковані або генетично змінені з метою щення істотно не змінює біологічну активність споотримання варіантів, у яких відсутній фермент, що луки. використовує АТФ, або редокс-активність, але які Таблиця 1 зберігають токсичність. Мутації і/або процесинг цитотоксичних факторів забезпечують отримання Переважні заміщення цитотоксичних речовин зі складами, що змінюються, які також демонструють функціональну активність. Зокрема, вкорочені похідні з високою ефекПочатковий Переважні Приклади заміщень тивністю і низькою антигенністю можуть бути залишок заміщення отримані з початкового цитотоксичного фактора. Ala (A) Val, Leu, lle Val Такі модифіковані або змінені цитотоксичні фактоArg (R) Lys, Gln, Asn Lys ри також включені в об'єм даного винаходу. Asn (N) Gln, His, Lys, Arg Gln Різні похідні цитотоксичних факторів можуть Asp (D) Glu Glu бути синтезовані із застосуванням стандартних Cys (C) Ser Ser способів. Похідними є амінокислотні послідовності, Gln (Q) Asn Asn сформовані з нативних сполук або безпосередньо, Glu (E) Asp Asp або шляхом модифікації, або шляхом часткового Gly (G) Pro, Ala Ala заміщення. Аналоги є амінокислотні послідовності, His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg що мають структуру аналогічну, але не ідентичну Leu, Val, Met, Ala, Phe, нативній сполуці, таку, що проте відрізняється від lle (I) Leu Норлейцин неї відносно певних компонентів або бічних ланНорлейцин, Val, Met, цюгів. Аналоги можуть бути синтезовані або моLeu (L) lle Ala, Pue Phe жуть мати різне еволюційне походження. Lys (K) Arg, Gln, Asn Arg Похідні і аналоги бути можуть повної або неMet (M) Leu, Phe, lle Leu повної довжини, якщо похідне або аналог містять модифіковану амінокислоту. Похідні або аналоги Phe (F) Leu, Val, lle, Ala, Tyr Leu цитотоксичних факторів включають молекули, що Pro (P) Ala Ala містять області, які, в основному, є подібними до Ser (S) Thr Thr цитотоксичих факторів як мінімум приблизно на Thr (T) Ser Ser 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% або 99% ідеTrp (W) Tyr, Phe Tyr нтичності по амінокислотній послідовності ідентиTyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe чного розміру або порівняно з суміщеною послідоHe, Leu, Met, Phe, Ala, Val (V) Leu вністю, в якій суміщення реалізується за Leu Норлейцин гомологічним алгоритмом. Додатково до природних алельних варіантів Неконсервативні заміщення, що впливають на: цитотоксичних факторів зміни можуть бути прове(1) структуру головного ланцюга поліпептиду, таку дені шляхом мутації в цитотоксичних факторах, як b-лист або a-спіральну конформацію, (2) заряд, що викликають зміни в амінокислотних послідов(3) гідрофобність або (4) велику частину бічного ностях кодованих цитотоксичних факторів, які не ланцюга цільового місця скріплення, можуть мозмінюють в значній мірі цитотоксичну активність. дифікувати функцію цитотоксичного фактора. За«Неосновний» залишок амінокислоти є залишком, лишки розділені на групи, виходячи із загальних який може бути змінений у послідовності цитотоквластивостей бічного ланцюга, як показано в табсичних факторів дикого типу без зміни біологічній лиці 2. Неконсервативні заміщення призводять до активності, тоді як «основний» залишок амінокисзаміни одного представника цих класів на інший лоти є необхідним для такої біологічної активності. клас. Заміщення можуть бути здійснені в консерНаприклад, прогнозується, що амінокислотні завативні місця заміщень або переважніше в неконлишки, що зберігаються серед цитотоксичних факсервативні місця. торів даного винаходу, практично не піддаються 27 88272 28 тільки ті обмеження, які визначені у формулі, що Таблиця 2 додається. Приклади Класи амінокислот Приклад 1. Стимулювання секреції цитотоксичних факторів білками ссавців Клінічні і екзогенні ізоляти (по п'ять кожного) В. Клас Амінокислоти серасіа вирощували в бульйоні протеозного пепНорлейцин, Met, Ala, Val, Гідрофобний тонно-дріжджового екстракту (ППД) з додаванням і Leu без додавання a2-макроглобуліна (1мг/мл). Після lle вирощування протягом 10 годин при 34°С на шейНейтральний гідроCys, Ser, Thr кері частину ростового середовища з кожної кульфільний тури центрифугували, і супернатант фільтрували кислий Asp, Glu через 0,22мкм міліпористий фільтр для видалення Основний Asn, Gln, His, Lys, Arg цілих клітин і залишків. Далі відфільтрований суКонформація розіGly, Pro пернатант тестували на активність аденілаткінази рваного ланцюга як описано в [Melnikov A. et al., Mol. Microbiol., 36: Ароматичний Trp, Туг, Phe 1481-1493 (2000)]. Аденілаткиназа переносить кінцевий фосфат з [g-32Р] АТФ на АМФ, при цьому Варіанти поліпептидів можуть бути виготовлеотримують АДФ. Продукти цієї реакції потім були ні із застосуванням відомих в даній області техніки виявлені із застосуванням методу тонкошарової способів, таких як олігонуклеотидний (сайтхроматографії. Секреція аденілаткінази була мініспецифічний) мутагенез, аланінове сканування і мальною у тому випадку, коли клітини В. серасіа PCR мутагенез. Сайт-специфічний мутагенез вирощували в бульйоні протеозного пептонно[Carter, Biochem J., vol. 237, pp. 1-7 (1986); Zoller дріжджового екстракту (ППД). Проте, секреція з and Smith, Methods Enzymol., vol. 154, pp. 329-50 клінічних ізолятів, але не екзогенних ізолятів, сти(1987)], касетний мутагенез, мутагенез рестрикціймулювалася в присутності a2-макроглобуліну. ною селекцією [Wells et al., Gene, vol. 34, pp. 315Імунофлуоресцентна мікроскопія з антитілом 23 (1985)] або інші відомі способи можуть бути до a2-макроглобуліна показала, що клінічні ізоляти застосовані для обробки клонованої ДНК з метою мають рецептори, що зв'язують a2-макроглобулін, отримання варіанту ДНК цитотоксичного фактора. тоді як такі рецептори відсутні у екзогенних ізоляЦитотоксична активність мутантів C112D і тів. Клінічні і екзогенні ізоляти В. серасіа вирощуМ44КМ64Е цитотоксичного фактора була описана вали за відсутності й у присутності 1мг/мл a2вище. Крім того, в прикладі 19 показана цитотокмакроглобуліну в бульйоні протягом 1 години. сична активність ряду химерних мутантів азуріну, Сторонній a2-макроглобулін видаляли шляхом отриманих із застосуванням методу сайтпромивання фосфатно-сольовим буферним розспецифічного мутагенезу відповідно до опису в чином. Клітини інкубували протягом 2 годин антиприкладі 18. У даному винаході також можуть витілами a2-макроглобуліна, кон'югованими з флуокористовуватися цитотоксичні фактори, такі як ресцеінізотіоціанатом (FITC), отриманими шляхом апо-азурін, в яких відсутній атом міді. Як аповведення ін'єкції а2-макроглоболіна кролям. Після азурін, так і мутант C112D проявляють значну ципромивання фосфатно-сольовим буферним розтотоксичну активність, тоді як мутант М44КМ64Е чином клітини, оброблені FITC-кон'югованими анне проявляє її. Проте, мутант М44КМ64Е все ж титілами, фіксували в 16% параформальдегіді, таки викликає істотне інгібування прогресії клітиннаносили на покриті поли-L-лізином слайди і доного циклу. сліджували із застосуванням конфокальної мікроУ одному прикладі здійснення даного винахоскопії. Флуоресціювали лише клінічні ізоляти, що ду використовуються цитотоксичні фактори, що проявили підвищену секрецію цитотоксичних факмутують, зберігають здатність формувати комторів у присутності a2-макроглобуліну (зелені плекс з р53 і стабілізувати р53 і, отже, викликати флуоресціюючі клітини), тим самим демонструючи апоптоз. У іншому прикладі здійснення даного виприсутність рецепторів для a2-макроглобуліна. находу використовуються цитотоксичні фактори, що мутують, такі як мутант М44КМ64Е, що мають Приклад 2. Киллінг АТФ-залежного макрофага здатність взаємодіяти з р53 і викликати затримку відфільтрованим супернатанто або фракціями клітинного росту. колоночної хроматографії, отриманими з середоПовніше розуміння даного винаходу може бути вища для вирощування В. серасіа отримане з посиланням на приведені нижче конкКлінічний штам В. серасіа (штам 38 - колекційретні приклади. Приклади описуються виключно в ний номер 95828, D. G. Allison, University of ілюстративних цілях і не обмежують об'єму винаManchester Institute of Science and Technology, ходу. Зміни форми і заміна еквівалентів розглядаManchester, UK) вирощували в ТВ бульйоні (10г ються залежно від обставин або доцільності. Не Бакто-тріптона, 3g Бакто-м'ясного екстракту на дивлячись на те, що в даному описі використовулітр води) при 34°С на шейкері до OD550нм (оптичвалися конкретні терміни, такі терміни є описовиній щільності), рівної 1,3. Далі середовище для ми і не використовуються в цілях обмежень. Мовирощування центрифугували і фільтрували через жуть бути запропоновані зміни і варіанти даного 0,22мкм миліпористий фільтр для видалення цілих винаходу, що не виходять за межі істоти і об'єму клітин і залишків. Клітини макрофагів відділяли від винаходу, і, таким чином, можуть бути введені клітинних ліній J774 і вирощували в середовищі RPMI-1640 (GIBRO-BRL, Grand Island, Ν. Υ.) відпо 29 88272 30 відно до опису [Zaborina О. et al., Infect. Immun. 67: оброблені макрофаги або макрофаги, оброблені 5231-5242 (1999)]. Відфільтроване середовище протягом ночі фракціями SUP, HAFT або AAFT, для вирощування послідовно вносили на гідроксифлуоресціювали головним чином червоним коапатитові, АТФ-агарозні ті Q-сефарозні колонки. льором, указуючи на відсутність апоптичного некПроточну фракцію з гідроксиапатитової колонки розу клітин. Макрофаги, оброблені протягом ночі (HAFT) фракціонували на АТФ-агарозній колонці фракцією QSFT, флуоресціювали головним чином (AAFT). Далі AAFT фракцію фракціонували на Qзеленим кольором, що указувало на апоптичний сефарозній колонці (QSFT). некроз більшості макрофагів. Хронометраж пока106 макрофагів вносили на 96-лункові планшезав, що апоптоз наступив приблизно через 6 годин ті й інкубували протягом двох годин в інкубаторі в (на що вказує поєднання червоної і зеленої флуоатмосфері СО2 для приєднання. 2мкг білка з супересценції, що створює жовтий колір клітин) і завернатанту або проточної фракції з кожної з вищершився через 12-16 годин. згаданих колонок додавали в лунки, і планшети Приклад 5. Індукція апоптозу в мастоцитах, що інкубували протягом 4 годин в присутності або за викликається цитотоксичними факторами В. серавідсутності 1,0мМ АТФ. Ступінь некрозу макрофасіа гальних клітин далі визначали по секреції внутрішМастоцити отримували, за способом, описаньоклітинного ферменту лактатдегідрогенази ним в [Melnikov A. et аl., Mol. Microbiol. 36: 1481(LDH) відповідно до опису [Zaborina О. et al., Infect. 1493 (2000)]. Фракціоноване середовище для виImmun., 67: 5231-5242 (1999)]. Ступінь килінгу макрощування В. серасіа готували, як і в прикладі 2. рофагів в присутності або за відсутності 1,0мМ Індукцію апоптозу в мастоцитах, що викликається АТФ відфільтрованого супернатанту (SUP) і фракцитотоксичним фактором В. серасіа, визначали з ціями колонок HAFT, AAFT і QSFT приведена на використанням конфокальної мікроскопії, відповідФіг.1. Всі аналізи були проведені з триразовим но до опису в прикладі 4. повторенням і вказані планки погрішностей. Необроблені мастоцити або мастоцити, оброПриклад 3. Киллінг АТФ-незалежних макрофаблені протягом ночі супернатантом і фракціями гів відфільтрованим супернатантом або фракціями HAFT або AAFT середовища для вирощування В. колоночної хроматографії, отриманими з середосерасіа, флуоресціювали головним чином червовища для вирощування В. серасіа ним кольором, що вказує на відсутність апоптичноСупернатант (SUP) і фракції колоночної хрого некрозу клітин. Мастоцити, оброблені протягом матографії (HAFT, AAFT і QSFT) середовища для ночі фракцією QSFT середовища для вирощуванвирощування В. серасіа аналогічні тим, що виконя В. серасіа, флуоресціювали головним чином ристовувалися в прикладі 2. Ізолювання макрофазеленим кольором, що вказує на апоптичний некгів проводили аналогічним чином, як і в прикладі 2. роз більшості мастоцитів. Ступінь некрозу клітин макрофагів визначали на Приклад 6. Індукція апоптозу в макрофагах, основі секреції LDH, як і в прикладі 2, і вона прищо викликається фракціями QSFT В. серасіа і М. ведена на Фіг.2. Тільки фракція QSFT проявляє bovis високу АТФ-незалежну цитотоксичність по відноМакрофаги отримували як і в прикладі 2. Індушенню до макрофагів. кцію апоптозу в макрофагах, що викликається циПриклад 4. Індукція апоптозу в макрофагах, тотоксичними факторами В. серасіа і М. bovis, вищо викликається цитотоксичним фактором P. мірювали з використанням методів, викладених в aeruginosa прикладі 4. Індукція апоптозу макрофагів спостеріP. aeruginosa вирощували в L-бульйоні при галася при їх обробці фракціями QSFT В. серасіа і 37°С протягом 12 годин до оптичної щільності М. bovis. OD550нм рівної 1,2. Далі середовище для вирощуПриклад 7. Вимірювання активності каспази вання центрифугували, і фільтрували супернатант (каспази-3 і каспази-9) в цитозольних екстрактах через 0,22мкм фільтр. Збір супернатанту (SUP) і макрофагів, оброблених фракцією QSFT В. серафракцій колоночної хроматографії (HAFT, AAFT і сіа QSFT) проводили аналогічно до прикладу 2. МакМакрофаги отримували як і в прикладі 2. Макрофаги отримували, як і в прикладі 2. 2мкг білка з рофаги обробляли протягом ночіфракцією QSFT супернатанту або однієї з проточних фракцій доВ. серасіа з використанням способу, описаного в давали до 1x105 макрофагів в 200мкл середовища прикладі 2. Підготовку цитозольного екстракту RPMI, і суміш інкубували протягом ночі. Індукцію макрофагів і аналіз каспази проводили як описано апоптозу в макрофагах або необроблених, або у [Zaborina О. et al., Microbiology 146: 2521-2530 оброблених інкубацією протягом ночі SUP або (2000)]. фракціями HAFT, AAFT або QSFT визначали за Визначення активності каспази-3 було проведопомогою конфокальної мікроскопії із застосудене з використанням Ac-DEVD-pNA (N-ацетилванням набору ApoAlert Mitochondria Membrane Аsр-GІu-VаІ-Аsр-р-NО2-анилін) як субстрат. СекSensor (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, рецію pNA (р-нітроанилін) визначали спектрофоCalifornia, U.S.A.) відповідно до [Zaborina О. et al., тометрично при 405нм субстрату каспази-3 Microbiology 146:2521-2530 (2000)]. (200мкм) після інкубації протягом 15, 30, 45, 60, 75 При проведенні цього аналізу здорові, неапопі 90 хвилин при 37°С (Фіг.3А) з неіндукованим цитичні клітини флуоресціюють червоним кольором, тозольним екстрактом макрофагів, і цитозольний тоді як апоптичні мертві клітини флуоресціюють екстракт макрофагів інкубували протягом ночі з зеленим кольором. Поєднання червоного і зеленофракцією QSFT В. серасіа (10мкг білка), і цитозого кольорів створює жовті флуоресціюючі клітини, льний екстракт макрофагів інкубували протягом котрі є апоптичними, вмираючими клітинами. Неночі з фракцією QSFT В. серасіа (10мкг білка) з 31 88272 32 додаванням інгібітору (DEVD-CHO). В кожному Приклад 9. SDS-PAGE аналіз білків в супернавипадку використовували 10мкг цитозольного білтанті і фракціях AAFT, HAFT і QSFT середовища ка макрофагів. для вирощування з P. aeruginosa, В. серасіа і М. При проведенні аналізів каспази-9 секрецію bovis pNA з 200мкМ субстрату каспази-9 Ac-LEHD-pNA SDS-PAGE сепарація продемонструвала, що (N-ацетил-Lеu-GІu-Ніs-Аsр-р-NO2-анилін) визначабілки присутні в супернатанті і у фракціях AAFT, ли після 15, 30, 45, 60, 75 і 90 хвилин інкубації HAFT і QSFT P. aeruginosa, В. серасіа і Μ. bovis. (Фіг.3В) з неіндукованим цитозольним екстрактом Середня фракція QSFT з мукоїдного штаму 8821 макрофагів; цитозольний екстракт макрофагів інP. aeruginosa показала присутність двох смуг: смукубували протягом ночі з фракцією QSFT В. сераги 18кДа, відповідною азуріну, шляхом проведення сіа (10мкг білка), і цитозольний екстракт макрофаN-кінцевого аналізу і смуги 9кДа, відповідною цигів інкубували протягом ночі з фракцією QSFT В. тохрому с551. Фракція QSFT В. серасіа показала серасіа (10мкг білка) з додаванням інгібітору присутність трьох переважаючих смуг: 75кДа, (LEHD-CHO). В кожному випадку використовували 20кДа і 8кДа. N-кінцева амінокислотна послідов10мкг цитозольного білка макрофагів. ність 10 амінокислот смуги 20кДа (AHHSVDIQGN), DEVD-CHO і LEHD-CHO відповідно блокують визначена шляхом розщеплювання білків по Едактивність каспази-3 і каспази-9, і їх можна приману, продемонструвала 80% гомологію послідовдбати у Biomol Research Laboratories, Plymouth ності до смуги N-кінцевої послідовності 10-и аміноMeeting, PA, U.S.A. Активності як каспази-9, так і кислоти азуріну P. aeruginosa, тоді як N-кінцева каспази-3 підвищувалися при обробці макрофагів амінокислотна послідовність смуги 10 амінокислот протягом ночі фракцією QSFT В. серасіа (Фіг.3А і смуги 8кДа (EDPEVLFKNK) продемонструвала В). Вказані активності залишалися на надзвичайно 100% збіг із смугою цитохрому с551 P. aeruginosa. низькому рівні для необроблених макрофагів або у Таким чином, фракції QSFT, що володіють висоприсутності інгібітору, що вказує на той факт, що кою цитотоксичною активністю як P. aeruginosa і В. індукція апоптозу, що викликається фракціями серасіа, продемонстрували збагачення редоксQSFT, включає активацію каспази. білками типу азуріну і цитохрому с551. В протилежПриклад 8. Аналіз TUNEL для визначення ність цьому фракція QSFT Μ. bovis продемонструфрагментації ядерної ДНК в макрофагах, обробвала товсту смугу 65кДа бичачого сироваткового лених фракціями QSFT М. bovis або В. серасіа Альбуміну (BSA), що є складовою частиною сереФракціоноване середовище для вирощування довища 7Н9, використовуваною для вирощування В. серасіа було отримане з використанням спосоМ. bovis, а також декілька смуг з молекулярною бу, описаного в прикладі 2. М. bovis BCG вирощумасою понад 45кДа, але не білки 8кДа або 22кДа вали в середовищі Middlebrook 7H9 (Difco типу цитохрому с551 або азуріну. Laboratories, Maryland, U.S.A.) з додаванням 2% Приклад 10. Некроз клітин в макрофагах, оброблених азуріном/цитохромом с551 гліцерину, 0,02% TWEENÒ80 і ADC (альбуОчищені азурін і цитохром с551 (Sigma мін/декстроза/цитрат) (що поставляються, Difco Chemicals, St. Louis U.S.A.) додавали до макрофаLaboratories, Maryland, U.S.A.). Бактерії вирощувагів, отриманих як і в прикладі 2, і суміш інкубували липротягом декількох днів при 32°С на шейкері до протягом 2 годин. Рівні концентрації азуріну і цизбору клітин, що наросли в культурі. Фракціоноватохрому с551 були такими ж, як і на Фіг.4. Числа не середовище для вирощування М. bovis було позначають кількість білка в мкг. Некроз макрофаотримане за способом, описаним в прикладі 2. гів вимірювали на основі секреції міжклітинного Макрофаги отримували, як і в прикладі 2. Індукцію ферменту лактатдегідрогенази (LDH) за способу апоптозу в макрофагах, необроблених, або оброприкладу 2. Як азурін, так і цитохром с551 викликаблених протягом ночі інкубацією з SUP або фракли некроз макрофагів. Поєднання азуріну і цитоціями HAFT, AAFT або QSFT вимірювали за допохрому с551 викликало масовий некроз макрофагів. могою конфокальної мікроскопії шляхом Буферний контроль (буфер) показаний справа. виявлення ядерної фрагментації ДНК, індукованою (Фіг.4). апоптозом, з використанням набору ApoAlert DNA Приклад 11. Індукція апоптозу в макрофагах, Fragmentation (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, оброблених азуріном/цитохромом с551 California, U.S.A.). Даний аналіз заснований на Макрофаги отримували, як і прикладі 2. Макметоді dUTP nick-мічення по кінцях (TUNEL) за рофаги обробляли азуріном/цитохромом с551 участю кінцевої дезоксинуклеотидил-трансферази (50/25мкг) протягом 4 і 6 годин, і потім досліджува(Tdt), де Tdt каталізує включення флюоресцеинали за допомогою конфокальної мікроскопії, викоdUTP на вільних 3'-гідроксильних кінцях фрагменристовуючи комплект ApoAlert Mitochondria тованої ДНК в клітинах, в яких протікає апоптоз. Membrane Sensor, як і в прикладі 4, з метою виВключення флюоресцеїну-dUTP в ядерну фрагмезначення ступеня апоптозу. Макрофаги продемоннтовану ДНК створює флюоресценцію зеленого стрували рівні апоптозу, що підвищувалися, при кольору, що виявляється за допомогою конфоказбільшенні тривалості інкубації у присутності сульної мікроскопії. міші азуріну і цитохрому с551. Контрольні макрофаМакрофаги, оброблені фракціями або QSFT ги без обробки (оброблені фосфатно-сольовим Μ. bovis, або В. серасіа, мали жовто-зелене ядро буферним розчином протягом 6 годин) не проявина червоному фоні цитоплазми, що вказує на ядели апоптоз. рну фрагментацію ДНК. Спостерігалася незначна Приклад 12. Цитотоксичність суміші азуріфрагментація або її повна відсутність у необробну/цитохрому с551 або фракцій QSFT, отриманих з лених макрофагів або у макрофагів, оброблених В. серасіа або М. bovis, в макрофагах після попеіншими колонковими фракціями. 33 88272 34 Приклад 14. Індукція апоптозу в клітинній лінії редньої обробки антитілами до азуріну і цитохрому меланоми USIO-Mel-6 фракцією QSFT Μ. bovis с551 визначена аналізом TUNEL Макрофаги отримували, як і в прикладі 2. МакКлітини меланоми USIO-Mel-6 були підготоврофаги обробляли очищеною сумішшю азурілені відповідно до опису [Rauth, S et al., Anticancer ну/цитохрому с551 (50/25мкг) або фракціями QSFT Research, 14 (6): 2457-2463 (1994)]. Фракція QSFT В. серасіа або М. bovis в присутності або за відсуΜ. bovis була отримана відповідно до прикладу 8. тності суміші антитіл до азуріну і цитохрому С551, Клітини меланоми, оброблені фракцією QSFT Μ. одержаною в кролях. Антитіла змішували в співbovis (5мкг білка), і необроблені контрольні клітини відношенні 1:1, і змішані антитіла (1, 2, 3 або 4мг) інкубували протягом 12 годин. Індукцію апоптозу використовували для обробки макрофагів. визначали шляхом проведення аналізу TUNEL з Ступінь некрозу макрофагів визначали на осметою виявлення ядерної фрагментації ДНК, винові секреції LDH, як і в прикладі 2. На Фіг.5 прокликаної апоптозом, як в прикладі 8. Клітини мелаілюстровано зниження цитотоксичності по віднономи, оброблені фракцією QSFT Μ. bovis, мали шенню до макрофагів, оброблених сумішшю жовто-зелене ядро на червоному фоні цитоплазазуріну/цитохрому с551 (А+С) або фракцією QSFT, ми, що вказує на ядерну фрагментацію ДНК. Споотриманою з В. серасіа (BC-QSFT), у присутності стерігалася незначна фрагментація або її повна антитіл азуріну та цитохрому с551. Таке зниження відсутність у необроблених клітин меланоми. не спостерігалося з фракцією QSFT, отриманою з Приклад 15. Зниження росту пухлинних клітин М. bovis (MB-QSFT). меланоми (USIO-Mel-2) у „голих" (бестимусних) Отже, коли суміш азуріну/цитохрому с551 або мишей після обробки азуріном/цитохромом с551 фракцію QSFT В. серасіа обробили сумішшю анПриблизно 106 клітин USIO-Mel-2 вводили ін'єтитіл азуріну і цитохрому с551 і при подальшому кцією підшкірно бестимусним мишам (що поставаналізували на цитотоксичність до макрофагів, ляється, Frederick Cancer Research and цитотоксичність в значній мірі була знижена. В Development Center, Frederick, Maryland U.S.A.). протилежність цьому, якщо фракції QSFT Μ. bovis, Невеликі пухлини розвивалися приблизно через у якої, як раніше було продемонстровано шляхом три тижні. Потім один раз в тиждень мишам ввопроведення аналізу SDS-PAGE, відсутні смуги дили інтраперитонеально ін'єкції відомого лікарсьазуріну і цитохрому с551 (приклад 9), заздалегідь кого препарату проти меланоми, DTIC [5-(3,3'-N,Nобробляють антитілами азуріну/цитохрому с551, то диметилтриазен-1-ил)-имидазол-4-карбоксимид] при проведенні подальшого аналізу на цитотокси(7,5мкг) [див. Ahlmais et al., Cancer 63: 224-7 чність спостерігається украй незначне зниження (1989)], або три рази на тиждень вводили внутріцитотоксичності. очеревинно ін'єкції великих (150мкг азуріну/75мкг Приклад 13. Індукція апоптозу в лініях пухлинцитохрому С551) і малих (10мкг азуріну/5мкг цитоних клітин за допомогою фракції QSFT В. серасіа і хрому с551) доз суміші азуріну/цитохрому с551 або азуріну/цитохрому с551 вимірювана конфокальною контрольного буферного розчину (цитратного бумікроскопією фера) протягом 4 тижнів. Об'єм пухлини визначаКлітинні лінії легеневої карциноми Н460, раку ли в інтервалах у контрольної групи мишей, у мияєчника РА-1, раку грудей NCF, раку товстої кишки шей, що пройшли лікування із застосуванням НТ-29 і лейкемія НТ-1080 були отримані з АмериDTIC, і у мишей, що отримували великі і малі дози канської типової колекції культур мікроорганізмів азуріну/цитохрому с551. (Manassas, VA, U.S.A.). Клітинні лінії раку грудей На Фіг.6 проілюстровано збільшення розміру MDD7 і MN1 були отримані від Andrei Gudkov, Ph. пухлини у контрольної групи бестимусних мишей, D., Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, OH у мишей, що пройшли лікування із застосуванням U.S.A.). Клітинні лінії раку грудей UISO-BCA-9 і DTIC, і у мишей, що отримували дози азурімеланоми UISO-MEL-1, MEL-2, MEL-6 і MEL-29 ну/цитохрому с551, і на Фіг.7 приведені дані збільвирощували і зберігали відповідно до методики, шення і втрати ваги у таких мишей. Подальші ін'єописаної в [Rauth, S et al., In vitro Cellular and кції великих доз у розмірі 150мкг азуріну/75мкг Developmental Biology, 30a (2): 79-84 (1994) і цитохрому-с551 дозволили уповільнити ріст і зменRauth, S et al., Anticancer Research, 14 (6): 2457шити розмір пухлини в порівнянні з DTIC. На Фіг.7 2463 (1994)]. Приблизно 1x105 кожного типу клітин показано, що ін'єкція або DTIC, або суміші азурікультивували протягом ночі в планшеті з шаром ну/цитохрому с551 не вплинули на збільшення ваги dTC3 товщиною 0,15мм (Bioptech, Butler, PA, мишей. Впродовж експериментального періоду у U.S.A.) у присутності фракції QSFT В. серасіа всіх мишей спостерігалося збільшення ваги. (5мкг білок а) або суміші азуріну/цитохрому с551 Приклад 16. Вплив пост-ін'єкції азуріну і фрак(50/25мкг). Далі клітини досліджували за допомоції QSFT М. bovis у безтимусних мишей на розмір гою конфокальної мікроскопії, як і в прикладі 4, з пухлини після введення пухлинних клітин меланометою визначення ступеня апоптозу. Як фракція ми (МеІ-6) QSFT В. серасіа, так і суміш азуріну/цитохрому Приблизно 106 клітин USIO-Mel-6 вводили с551, індукувала масовий апоптоз в клітинах легешляхом ін'єкції підшкірно 3 бестимусним мишам невої карциноми Н460, раку товстої кишки НТ-29, (Frederick Cancer Research and Development лейкемії НТ-1080, раку яєчника РА-1, раку грудей Center, що поставляється, Frederick, Maryland MDD7, NCF і MN1 і меланоми USIO-MEL-1, MEL-2, U.S.A.). Невеликі пухлини розвивалися приблизно MEL-6 і MEL-29 після інкубації протягом ночі. В через три тижні. Одній миші ін'єкційно вводили кожному випадку клітини, необроблені цитотоксиінтраперитонеально фосфатно-сольовий буферчним фактором (додавання фосфатно-сольового ний розчин (контроль), другій миші ін'єкційно ввобуферного розчину), не мали масивного апоптозу. 35 88272 36 дили фракцію QSFT M. bovis (5мкг білок а) і третій на дві групи по 10 мишей в кожній. Група, що промиші ін'єкційно вводили суміш фракції QSFT Μ. ходила лікування, отримувала щодня внутріочереbovis (5мкг білок а) і азуріну (50мкг). Фракцію QSFT винно 1мг азуріну в 1мл нормального сольового M. bovis отримували відповідно до прикладу 8. розчину протягом 28 днів, тоді як контрольна група Розміри (об'єм пухлини) пухлин у контрольної миотримувала щодня 1мл сольового розчину протяші, у миші, що проходила лікування фракцією гом 28 днів. QSFT Μ. bovis, і у миші, що проходила лікування До лікування приступили через три дні після сумішшю QSFT M. bovis і азуріну, були визначені інокуляції MCF-7. Під час проведення експерименчерез 30 днів. Ці дані приведені на Фіг.8. У обох ту проводилося щоденне обстеження мишей, і мишей, що пройшли лікування, спостерігалося двічі в тиждень вимірювали 3-осьовий об'єм пухзниження росту пухлини в порівнянні з контрольлини і вагу тіла. На 29-й день тварини забивалися, ною мишею. і була проведена повна аутопсія. Всі пухлини і Приклад 17. Індукція азуріном апоптозу і ревнутрішні органи були збереженідля проведення гресії клітин раку грудей людини гістологічного й імуноцитохімічного обстеження. Клітинні лінії грудей людини MCF-7 (р53+/+) і Темпи зростання об'єму пухлин у мишей, що MDA-MB-157 (р53-/-) були отримані з базової колеотримували щодня 1мг азуріну протягом 28 днів, кції культур мікроорганізмом Відділення хірургічної були істотно нижчі, ніж у тварин в контрольній груонкології університету шт. Ілінойс, Чікаго. Нормапі. Одномірний аналіз даних показав, що відмінльні клітини грудей (MCF-1OF) і клітини шкіри були ність темпів зростання пухлин в цих двох групах отримані з цього ж джерела. Клітини HBL100 були (порівняння мишей, що отримували азурін, з минадані Dr. Nita J. Mahile, Department of Biochemistry шами контрольної групи) є значною. Наприклад, and Molecular Biology, Mayo Clinics, Rochester, MN. через 22 дні після початку курсу лікування середКлітини вирощували або в середовищі MEM з доній об'єм пухлин у мишей, що проходили лікувандаванням соли Ерла, 10% FBS, Пеніциліня, становив лише 22% від середнього об'єму пухну/стрептоміцину, або в середовищі Macoy's 5A. лин у контрольних мишей (тобто, 0,0267см3 і Клітини вирощували при 37°С в атмосфері з 6% 0,1240см3 відповідно, Р=0,0179, тест Kruskalзмістом СО2. Wallis), що вказувало на 78% уповільнення зросГен, кодуючий азурін, Pseudomonas aeruginosa тання пухлин. ампліфікували і клонували в pUCI9. Азурін очищаПо завершенню експерименту на 29-й день ли від Е. coli JM109 відповідно до [Yamada, Т. et середній об'єм пухлин у мишей в групі, що отриal., Infect. Immun., vol. 70, pp.7054-62 (2002), зміст мували азурін, становив лише 15% від середнього якої включений для всіх цілей даним посиланням]. об'єму пухлин мишей контрольної групи. На Фіг.10 Цитотоксичність азуріну по відношенню до кліграфічно показана зміна об'ємів пухлин в часі у тинних ліній визначали шляхом проведення аналідвох груп, виражене в см3. зу ΜΊΓΤ відповідно до опису [Yamada et al., (2002)]. При багатоваріантному підході нелінійні модеНа Фіг.9 показана цитотоксичність азуріну відносно лі із змішаним ефектом співпадали з даними. Одна клітин MCF-7 і MDA-MB-157, оброблених азуріном модель, відповідна для зростання пухлини, була різної концентрації протягом 72 годин. Після 72 експоненціальною в часі з коефіцієнтами, які були годин обробки азурін в концентрації 28,5мкМ суб'єктний-специфічними змішаними ефектами. (400мкг/мл) індукував некроз 50% клітин в клітинах Підібрана модель для контрольної групи була наMCF-7 протягом 72 годин. За аналогічних умов ступною: об'єм пухлини=експ {-4,23+0,06*час}, тоді проведення експерименту клітинам MDA-MB-157 як модель для групи, що проходила лікування, було потрібно 57мкМ (800мкг/мл) для 50% некрозу була наступною: об'єм пухлини експ = {клітин. 4,23+0,03*час}. Відмінність була статистично знаЗ метою визначення того чи викликає азурін чущою (Р=0,0456). В період лікування (28 днів) у аналогічний клітинний некроз в нормальних клітимишей, що проходили лікування, не було виявленах були протестовані дві епітеліальні клітинні лінії но яких-небудь ознак токсичності, підтвердженням молочної залози (HBL 100 і MCF-10F). Після 72 чому є зниження ваги і (або) інші зазвичай спостегодин інкубації з 57мкМ (800мкг/мл) азуріну тільки режувані ознаки токсичності. 20% клітин MCF-10F і 18% клітин HBL 100 виявиОцінка ступеня апоптозу в пухлинах була пролися нежиттєздатними. Життєздатність клітин виведена з використанням забарвлення TUNEL, як в значали шляхом проведення водного протеолітичприкладі 8. У мишей в групі, що проходила лікуного аналізу титрування клітин 96 (cell titer 96 вання азуріном, наголошувалося істотне збільaqueous proteolytic assay) [Eilon, G. F. et al., Cancer шення апоптичних показників в порівнянні з миChemother. Pharmacol., vol. 45, pp. 183-91 (2001)] з шами контрольної групи, у яких рідко зустрічалися використанням набору Promega (Madison, Wl). апоптині клітини. Приклад 18. Лікування азуріном забезпечує Приклад 19: Отримання мутантів азуріну зменшення розміру пухлини у безтимусних мишей, Мікроорганізми і плазміди що отримали ін'єкції пухлинних клітин раки грудей Ген азуріну (азурін дикого типу) ампліфікували Приблизно 500000 клітин MCF-7, отриманих як реакцією полімеразного ланцюга (PCR) відповідно і в прикладі 17, були ін'єкційно введені в праве до способу, описаному [Kukimoto et al., FEBS Lett, нижнє жирове тіло молочної залози самкам безvol. 394, pp. 87-90 (1996), зміст якого включений тимусних мишей, що заздалегідь отримували для всіх цілей даним посиланням]. PCR проводили зстрадіол (що поставляється, Frederick Cancer з використанням ДНК геному від штаму РАО1 P. Research and Development Center, Frederick, aeruginosa як матрична ДНК. Були використані як Maryland U.S.A.). Миші були довільно розподілені прямий і зворотний праймери 5' 37 88272 38 GCCCAAGCTTACCTAGGAGGCTGC TCCATGCTAЗаміни амінокислот у передбачуваних анти3' (SEQ ID NO: 8) і 5'генних епітопів P. aeruginosa амінокислотами з TGAGCCCCTGCAGGCGCCCATGAAAAAGCCCGG інших мікробних азурінів були направлені на отриC-3' (SEQ ID NO: 9), в яких додатково вставлені мання химерних азурінів, в яких були змінені антирестрикційні сайти Hindlll і сайти Pstl підкреслені. генні епітопи. Химерні мутанти були побудовані Фрагмент ампліфікованої ДНК з 545 bр (комсукупно шляхом сайт-специфічного мутагенезу і плементарна пара гетероциклічних підстав ДНК), заміни рестрикційного фрагмента BSTEII в гені гидролізований Hindlll і Pstl, був вставлений у відазуріну з використанням наступних олігонуклеотиповідні сайти pUC 19 так, щоб ген азуріну був роздів: для T21Q мутації в ЕР1 ЕР1, 5'міщений нижче промотору Іас для отримання ексCAACACCAATGCCATCcagGTCGACAAGAGCTGC пресійної плазміди pUC 19- azuA. Як штамAAGC-3' (SEQ ID NO: 32) та 5'господар використовували Е. col JM 109 для ексAGCTCTTGTCGACctgGATGGCATTGGTGTTGAAC пресії гена азуріну. Був культивований рекомбінаTGC-3' (SEQ ID NO: 33); для T126K мутації в ЕР7, нтний штам Е. coil в середовищі 2YT, що містить 5'-GAAGGGCACCCTGAagCTGAAGTGATGCGCG50мкг мл-1 ампіциліну, 0,1мМ IPTG і 0,5мМ CuSO4, 3' (SEQ ID NO: 34), та 5'протягом 16 годин при 37°С для отримання азуріGCGCATCACTTCAGctTCAGGGTGCCCTTCATC-3' ну. (SEQ ID NO: 35); для T52K/A53S мутацій в EP2, 5'Сайт-специфічеський мутагенез гена азуріну AACTGGGTACTGAGCAagtCCGCCGACATGCAGG Сайт-специфічний мутагенез гена азуріну був GC-3' (SEQ ID NO: 36) та 5'проведений з використанням набору QuickChange CTGCATGTCGGCGGactTGCTCAGTACCCAGTTGT Site-Directed Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA). G 3' (SEQ ID NO: 37); для G58P/V591 мутацій в Був розроблений одиничний набір олигонуклеотиЕР3, 5'дов для кожної мутації, а саме: для C112D: 5'CCGCCGACATGCAGccCaTGGTCACCGACGGCAT CAGTACATGTTCTTCGACACCTTCCCGGGCCACGGC-3' (SEQ ID NO: 38) та 5'3' (SEQ ID NO: 10) та 5'GCCATGCCGTCGGTGACCAtGggCTGCATGTCGG TGGCCCGGGAAGGTGTCGAAGAACATGTACTGCCGG-3' (SEQ ID NO: 39); для M591N60A мутаций в 31 (SEQ ID NO: 11); для М44K: 5'ЕР3, 5'CCTGCCGAAGAACGTCAAGGGCCACAACTGGG-3' CATGCAGCCCATcGcCACCGACGGCATGGC-3' (SEQ ID NO: 12) та 5'(SEQ ID NO: 40) та 5'CCCAGTTGTGGCCCTTGACGTTCTTCGGCAGG-3' CATGCCGTCGGTGgCgATGGGCTGCATGTCG-3' (SEQ ID NO: 13); для M64E: 5'(SEQ ID NO: 41); для S66A/G67A/H83F/K85P/L861 GGTCACCGACGGCGAGGCTTCCGGCCTGG-3' мутацій в EP4, EP5, та ЕР6, 5'(SEQ ID NO: 14) та 5'GTCACCGACGGCATGGCTgCCGcCCTGGACAAG CCAGGCCGGAAGCCTCGCCGTCGGTGACC-3' GATTACCTGAAGCCCGACGACAGCCGTGTCATC (SEQ ID NO: 15). Мутації були підтверджені шляGCCttCACccGaTcATCGGCTCGGGCGAGAAGGAC хом розшифровки послідовності ДНК. TCG-3' (SEQ ID NO: 42) та Химерні мутанти азуріну 5'GTCACCGAGTCCTTCTCGCCCGAGCCGATgAtC ggGGTGaaGGCGATGACACGGCTGTCGTCGGGCT Пошук амінокислотних залишків азуріну, які TCAGGTAATCCTTGTCCAGGgCGGcAGCCATGCC розглядалися як кандидати для Т-кліток-епітопів, GTCG-3' (SEQ ID NO: 43), у яких сайт BSTEII був проводили за допомогою програмного забезпепідкреслений, були використані для заміни фрагчення GENETYX (Software Development, Tokyo). ментів BSTEII з гена азуріну дикого типу. Рядкові Було виявлено сім передбачуваних антигенних букви в олігонуклеотидах указують на мутагенні епітопів ЕР1-ЕР7: ЕР1, 120TVDKS25 (SEQ ID NO: нуклеотиди. 16); ЕР2, V49LSTAA54 (SEQ ID NO: 17); EP3, На Фіг.11(B) проілюстрований азурін дикого G58VVT61 (SEQ ID NO: 18); EP4, G63HASG66 (SEQ типу і химерні мутанти азуріни, отримані з викориID NO: 19); EP5, R79VIAH83 (SEQ ID N0:20); EP6, станням вищеописаних способів. S1 (SEQ ID NO. K85LIG88 (SEQ ID N0:21); та ЕР7, M121KGTLT126 45), S2 (SEQ ID NO. 46), S3 (SEQ ID NO. 47), S4 (SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO. 50) і S6 (SEQ ID NO. 51) були побудоАмінокислотні послідовності азуріну від різних вані сукупно в цьому порядку шляхом сайтмікроорганізмів були отримані з GenBank і суміщеспецифичного мутагенезу. WtS5 (SEQ ID NO. 52) і ні за допомогою програмного забезпечення S3S5 (SEQ ID NO. 48) були побудовані шляхом GENETYX для порівняння амінокислот навколо заміни фрагментів wt (SEQ ID NO. 44) BSTEII азупередбачуваних сайтів епітопів (ЕР) Т-кліток ріну дикого типу (wtS5) і азуріну S3 (S3S5) мута(Фіг.11(A)). ЕР сайти, що налічують від 1 до 7, погенним фрагментом BSTEII відповідно. WtS5S4S6 казані з планками погрішностей на верхній частині (SEQ ID NO. 53) і S3S5S4S6 (SEQ ID NO. 49) були послідовностей. PA Pseudomonas aeruginosa побудовані двома циклами сайт-специфичного PAO1 (SEQ ID NO: 23); AF, Alcaligenes faecalis мутагенезу з використанням гена wtS5 і гена S3S5 (SEQ ID NO: 24); AX, Achromobacter xylosoxidans як матрична ДНК відповідно. Введення мутацій ssp. denitrificans I (SEQ ID NO: 25); BB, Bordetella було підтверджене шляхом розшифровки послідоbronchiseptica (SEQ ID NO: 26); MJ, Metylomonas вності ДНК. Замінені амінокислоти показані жирsp. J (SEQ ID NO: 27); NM, Neisseria meningitidis ним шрифтом. Гени були виражені в Ε coli відповіZ2491 (SEQ ID NO: 28); PF, Pseudomonas дно до вищенаведеного опису для азуріну дикого fiuorescen (SEQ ID NO: 29); PC, Pseudomonas типу. Експресія S3S5S4S6 не спостерігалася. chlororaphis (SEQ ID NO: 30); XE, Xylella fastidiosa Азуріни дикого типу і мутанти азуріни очищали 9a5c (SEQ ID NO: 31). від периплазматичних фракцій рекомбінантних 39 88272 40 клітин Ε coli з використанням колонки Q-Sepharose тить, або мутант азурін. Після 16 годинної обробки FF і колонки Superdex 75 (Amersham Pharmacia клітини офарблювали фарбником MitoSensor і Biotech AB, Uppsala, Sweden) відповідно до спосоаналізували шляхом проточної цитометрії за добу, описаного [Kukimoto et al. (1996)]. Для отрипомогою фільтру FL-1 відповідно до Інструкції з мання апо-азуріну азурін дикого типу обробляли експлуатації фірми-виготівника. 0,1Μ MES буферною рідиною з рН 6,0, 0,2М тіомоНа Фіг.13 показана апоптична активність азучевини, що містить, 0,25М NaCI і 1мМ EDTA, проріну, апо-азуріну і мутантів C112D і М44КМ64Е по тягом 16 годин. Мідь, що виділилася, видаляли відношенню до макрофагів. Апоптотична швидшляхом діалізу відповідно до способу, описаного кість (%) виражена у вигляді частки популяції клі[van Pouderroyen et al., Biochemistry, vol. 35, pp. тин, яка змістилася від контрольної популяції до 1397-1407 (1996)]. флуоресціюючій зеленим кольором апоптичної Приклад 20: Цитотоксична активність азуріну і популяції. мутантах азурінів Приклад 22: Цитотоксична активність рустиціАзурін дикого типу, апо-азурін, мутанти C112D анина, апо-рустиціанина і псевдоазуріну і М44КМ64Е і химерні мутанти, отримані в прикладі Азурін дикого типу отримували, як в прикладі 19, використовувалися в аналізах макрофагальної 19. Рустіціанін з Thiobacillus ferrooxidas і псевдоцитотоксичності. Макрофаги отримували, як в приазурін з Aclzromobacter cycloclastes отримували кладі 2. шляхом гіперекспресії їх генів і колоночноПриблизно 1х105 клітин на лунку висівали в хроматографічного фракціонування відповідно до культуральні планшети з 96 лунками в 200мкл сеопису для азуріну [Yamada et al. 2002; Goto et al. редовища RPMI-1640, що містить 10% FBS, при 2003]. Апо-рустіціанін отримували з використан37°С в атмосфері, що містить 5% СО2. Після виням способу, описаного в прикладі 18. Клітини рощування протягом ночі клітини промивали тим UlSO-Mel-2 були отримані, як і в прикладі 13. же самим середовищем, яке потім замінювали Приблизно 5x103 клітин на лунку висівали в новим середовищем, що містить азурін, або мукультуральні планшети з 96 лунками в 200мкл сетант азурін. Після 24 годинної обробки 10мкл 5мг редовища MEM, що містить 10% FBS, при 37°С в mi4 MTT [3-(4,5-диметилтіазол-2-іл-2,5атмосфері, що містить 5% СО2. Після вирощувандифенілтетразолійбромід)] розчин додавали до ня протягом ночі клітини промивали тим же самим культури і інкубували протягом 2,5 годин при 37°С. середовищем, яке потім замінювали або буфером Реакцію МТТ завершували шляхом додавання (PBS рН 7,4 або Tris-HCI рН 5,0), неочищений зра40мМ НСІ в ізопропанолі. Отриманий МТТ формазок, рустиціанін, що містить, в Tris-HCI pH5,0, або зан вимірювали спектрофотометрично відповідно апо-рустиціаніном в PBS рН 7,4. Після 24 годин до методу, описаним [Mosmann, J. Immunol. проводили аналіз МТТ відповідно до процедури, Methods, vol. 65, pp. 55-63 (1983)]. описаної в прикладі 19. Цитотоксичність азуріну Цитотоксичность азуріну і мутантах азурінов дикого типу, рустиціаніна, апо-рустиціаніна і псевприведена на Фіг.12(A) і 12(B). На Фіг.12(B) також доазуріну приведена на Фіг.14. показана відносна ефективність перенесення елеПриклад 23: Цитотоксична активність пластоктрона мутантів, виражена у відсотках від ефектиціаніну вності азуріну дикого типу. В даному випадку ефеАзурін дикого типу отримували, як і в прикладі ктивність перенесення електрона між оксидованим 18. Пластоціанін з Phormidium laminosum отримуазуріном і відновленим цитохромом с551 була вивали шляхом гіперекспресії його гена і колоночноміряна шляхом лазерно-імпульсного фотолізу відхроматографічного фракціонування відповідно до повідно до опису [Cutruzzola et al., Journal of опису процесу для азуріну. Макрофаги ізолювали, Inorganic Biochemistry 88; 353-361, 2002]. як і в прикладі 2. Приклад 21: Апоптотична активність азуріну і Приблизно 1x105 клітин на лунку висівали в мутантах азурінів культуральні планшети з 96 лунками в 200мкл сеЗ метою визначення швидкості апоптозу, виредовища RPMI-1640, що містить 10% FBS, при кликаного азуріном дикого типу або мутантами 37°С в атмосфері, що містить 5% СО2. Після виазуріну, зміну мітохондріального потенціалу вимірощування протягом ночі клітини промивали тим рювали шляхом проточної цитометрії (Becton же самим середовищем, яке потім замінювали Dickinson, Inc., Franklin Lakes, NJ) з використанням новим середовищем, азурін, що містить, або мунабору ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor тант азурін. Після 24 годинної обробки 10мкл (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, 5мг/мл М'ІТ [3-(4,5-диметилтіазол-2-ил-2,5U.S.A.). Ізоляція макрофагів була проведена як в дифенілтетразолійбромід)] розчин додавали до прикладі 2. культури і інкубували протягом 2,5 годин при 37°С. Приблизно 1x106 клітин на один осередок виРеакцію МТТ завершували шляхом додавання сівалося в культуральні планшети в шістьма осе40мМ НСІ в ізопропанолі. Отриманий МТТ формаредками в 2мл середовища RPMI-1640, що містить зан вимірювали спектрофотометрично відповідно 10% FBS, при 37°С в атмосфері, що містить 5% до методу, описаним [Mosmann, J. Immunol. СО2. Після вирощування протягом ночі клітини Methods, vol. 65, pp. 55-63 (1983)]. Цитотоксичність промивали тим же самим середовищем, яке потім азуріну дикого типу і пластоціаніну приведена на замінювали новим середовищем, азурін, що місФіг.15. 41 88272 42 43 88272 44 45 88272 46 47 88272 48 49 88272 50 51 88272 52 53 88272 54 55 88272 56 57 88272 58 59 88272 60