Харчова композиція, що містить поліфеноли, та її застосування при лікуванні раку та запальних захворювань

1. Харчова композиція, що містить: а) аскорбінову сполуку; б) сполуку лізину; в) сполуку проліну; г) принаймні одну поліфенольну сполуку, що вибирають з групи, яка складається з галату епігалокатехіну, галату епікатехіну, епігалокатехіну, епікатехіну і катехіну та д) N-ацетилцистеїн. 2. Харчова композиція за п. 1, в якій аскорбінову сполуку вибирають з групи, що складається з аскорбінової кислоти, фармацевтично прийнятних аскорбатів, естерів аскорбатів і/або їх сумішей. 3. Харчова композиція за п. 2, в якій фармацевтично прийнятною сіллю аскорбату є аскорбат кальцію або аскорбат магнію. 4. Харчова композиція за п. 2 або 3, в якій естер аскорбату є аскорбілпальмітатом. 5. Харчова композиція за п. 1, в якій сполуку лізину вибирають з групи, що складається з гідрохлориду лізину і фармацевтично прийнятних солей лізину. 6. Харчова композиція за будь-яким з пп. 1-5, в якій сполуку проліну вибирають з групи, що складається з гідрохлориду проліну і фармацевтично прийнятних солей проліну. 7. Харчова композиція за будь-яким з пп. 1-6, яка додатково містить мікроелемент, що вибирають з 2 (19) 1 3 80692 4 14. Харчова композиція за п. 9, яка містить 250 мг аскорбінової кислоти, 250 мг аскорбату кальцію, 250 мг аскорбату магнію, 250 мг аскорбілпальмітату, 1000 мг поліфенолів, 200 мг N-ацетилцистеїну, 1000 мг лізину, 750 мг проліну, 500 мг аргініну, 100 мкг селену, 2 мг міді, 1 мг марганцю, 500 мг кальцію, 400 мг магнію і 200 мг біофлавоноїдів цитрусових. 15. Харчова композиція, яка містить L-лізин, Lпролін, L-аргінін, аскорбінову кислоту, кальцій, магній, принаймні одну поліфенольну сполуку, що вибирають з групи, яка складається з галату епігалокатехіну, галату епікатехіну, епігалокатехіну, епікатехіну і катехіну, Nацетилцистеїн, селен, мідь і марганець. 16. Харчова композиція за п. 15, яка містить 1000 мг L-лізину, 750 мг L-проліну, 500 мг L-аргініну, 710 мг аскорбінової кислоти, 22 мг кальцію, 50 мг магнію, 1000 мг поліфенолів, 200 мг Nацетилцистеїну, 30 мкг селену, 2 мг міді і 1 мг марганцю. 17. Харчова композиція за п. 15 або 16, в якій аскорбінову кислоту вибирають з групи, що складається з аскорбінової кислоти, аскорбату кальцію, аскорбату магнію і аскорбілпальмітату. 18. Харчова композиція за будь-яким з пп. 15-17, в якій поліфенол вибирають з групи, що складається з галату епігалокатехіну, галату епікатехіну, епігалокатехіну, епікатехіну, катехіну і інших фармацевтично прийнятних солей поліфенолу і/або їх суміші. 19. Застосування харчової композиції за будь-яким з пп. 1-18 для виготовлення фармацевтичної композиції для лікування раку. 20. Застосування за п. 19, в якому рак вибирають з групи, що складається з меланоми, раку молочної залози, раку товстого кишечнику, раку легень і раку мозку. 21. Застосування харчової композиції за будь-яким з пп. 1-18 для виготовлення фармацевтичної композиції для лікування запального захворювання. 22. Застосування за п. 21, в якому запальне захворювання є остеоартритом. Дана заявка заявляє пріоритет 35 U.S.C. § 119 (є) США попередньої заявки серійний № 60/348,143 поданої 11 січня 2002, зміст якої повністю тут включений. Представлений винахід стосується харчової фармацевтичної рецептури і її використання при лікуванні раку. Більш специфічно, представлений винахід стосується поліфенолу, що містить фармацевтичні рецептури, які мають ефективну кількість поліфенолів при лікуванні раку. Рецептура представленого винаходу використовується як агент для попередження та лікування раку, включаючи аскорбінову кислоту, лізин, пролін і принаймні одну поліфенольну сполуку вибрану із групи, що складається з галату епігалокатехіну, галату епікатехіну, епігалокатехіну, епікатехіну і катехіну. Рак є однією з провідних причин смерті в індустріальному світі. Не існує специфічного каузального лікування раку і смертність від раку є однією з найвищих серед усіх захворювань. Лікування, що найбільш широко використовується - хіміотерапія і променева терапія, не розрізняє здорову тканину і рак і пов'язана із серйозними побічними ефектами. Таким чином, існує потреба у вибірковому лікуванні раку. Один із ключових механізмів, що використовується раковими клітинами для розповсюдження і метастазування в організмі призводить до ферментативної деструкції навколишньої з'єднувальної тканини. Терапевтичні підходи до контролю цього процесу за допомогою специфічних ліків не були успішними і в даний час не існує ніяких засобів, здатних контролювати метастаз раку. Поточні протоколи лікування хіміотерапією і променевою терапією сфокусовані на руйнування ракової клітини в організмі і вони не спрямовані на метастаз. Крім того, ці лікування токсичні, не специфічні і пов'язані з серйозними побічними ефектами. Хіміотерапія і променева терапія несуть ризик розвитку нових ракових утворень і через деструкцію ними з'єднувальної тканини в організмі можуть сприяти інвазії раку. Для росту і розповсюдження до інших частин організму, ракові клітини руйнують екстрацелюлярний матрикс через різноманітні матричні металопротеїнази (MMPs) і плазмін, активності яких були скорельовані з агресивністю росту пухлини. Рат і Паулінг (1992) -припустили, що харчові добавки, такі як амінокислота, лізин та аскорбінова кислота можуть діяти як природні інгібітори протеолізу екстрацелюлярного матриксу і по суті мають потенціал для модулювання росту і розповсюдження пухлини. Ці харчові добавки можуть здійснювати їх протипухлинну дію через декілька механізмів, серед них інгібування MMPs і укріплення з'єднувальної тканини навколо ракових клітин (ефект "капсулювання" пухлини). [Патент США № 5,962, 517] розкриває фармацевтичну композицію для різноманітних медичних показань (лікування акне). Розкрита композиція містить компонент пригнічення акне, принаймні, один з коріння реп'яха великого, коріння щавлю жовтого, або композицію основану на катехіні; і відновлюючий клітини шкіри компонент, що містить перехідний метал. Розкрита композиція не показує, що має якесь цінне значення для попередження і/або лікування раку. [РСТ WO 00/76492] розкриває харчову рецептуру для лікування захворювання, яка містить сполуку катехіну. Однак, було показано, що біозасвоювання сполук катехіну є низьким [Chen L, Lee M. J., Yang С. S. Drug Metab. Dispos. 25: 1045-1050 (1997); Yang С S., Chen L, Lee M. J., Balentine D. Α., Kuo M. C, Schantz S. Cancer Epidemol. Biomark. Prev. 7: 351-35 (1998); Bell J. R., 5 Donovan J. L, Wong R., Waterhouse H., German J. В., Walzem R. L, Kasim K. Am. J. Clin. Nutr. 71: 103108 (2000); Sherry Chow H. H., Cai Y., Alberts D. S., Hakim I., Dorr R., Shahi F., CrQwell J. Α., Yang S. С, Нага Н. Cancer Epidemol. Biomark. Prev. 10: 53-58 (2001)) і РСТ WO 00/76492] не приводять до розкриття засобів для підвищення біозасвоювання, як вимагається при лікуванні і/або попередженні раку. Demeule і інші розкриває, що катехіни зеленого чаю, можуть мати інгібувапьні впливи на матриксну металопротеїназу. Не існує ніякої пропозиції або вчення щодо того, як використовувати катехіни при лікуванні і/або попередженні раку. З огляду на факт, що біозасвоювання поліфенолів людьми є надзвичайно низьким, низька концентрація катехінів в тканині значно зменшує терапевтичне значення поліфенолів, включаючи галат егіігалокатехіну (EGCG). Існує постійна необхідність в знаходженні кращої харчової фармацевтичної композиції, яка містить поліфеноли, що є ефективним при лікуванні пухлинних захворювань і інших захворювань, включаючи запальні захворювання. Існує потреба в безпечних й ефективних природних підходах, що можуть бути використані для контролю процесу розповсюдження раку в організмі. Існує також потреба в превентивному заході проти розвинення ракових утворень або доброякісних пухлин у людини і такий засіб міг би застосовуватися до пацієнтів без ризику побічних впливів, пов'язаних з лікуванням. Харчові фармацевтичні композиції стали широко застосовуватися, так як кількість випадків раку в останній час збільшилась. Потреба в такій композиції буде тривати і ймовірно збільшиться. В одному об'єкті, представлений винахід забезпечує харчову фармацевтичну композицію, корисну для лікування раку, що включає: а) аскорбінову сполуку; б) сполуку L-лізину; в) сполуку L-проліну; і г) принаймні, одну поліфенольну сполуку, вибрану з групи, що складається з галату епігалокатехіну, галату епікатехіну, епігалокатехіну, епікатехіну ι катехіну. Сполуки а-в) розширюють дію поліфенольної сполуки в блокуванні проліферації та метастазу раку. Переважно, аскорбінову сполуку вибирають з групи, що складається з аскорбінової кислоти, фармацевтично прийнятних аскорбатів, естерів аскорбатів і/або їх суміші. Переважно, фармацевтично прийнятним аскорбатом є аскорбат кальцію або аскорбат магнію. Більш переважно, естером аскорбату є аскорбілпальмітат. Переважно, сполуку лізину вибирають з групи, що складається з фармацевтично прийнятних солей гідрохлориду лізину і лізину. Переважно, сполуку проліну вибирають з групи, що складається з фармацевтично прийнятних солей гідрохлориду проліну і проліну. В іншому об'єкті, представлена харчова фармацевтична композиція додатково містить мікроелемент, що вибирають з групи, що 80692 6 складається з селену, міді, марганцю, кальцію і 'магнію. В іншому об'єкті, представлена харчова фармацевтична композиція додатково містить амінокислоту. Переважно, амінокислотою є аргінін. Більш переважно, харчова фармацевтична композиція додатково містить N-ацетилцистеїн. В іншому об'єкті, представлений винахід забезпечує харчову фармацевтичну композицію, корисну при лікуванні раку, що включає: а) аскорбінову сполуку; б) сполуку L-лізину; в) сполуку L-проліну; г) N-ацетилцистеїн; і д) принаймні, одну поліфенольну сполуку, що вибирають з групи, що складається з галату епігалокатехіну, галату епікатехіну, епігалокатехіну, епікатехіну і катехіну, а-г) Сполуки розширюють дію поліфенольної сполуки в блокуванні проліферації та метастазу раку. В іншому об'єкті, представлений винахід забезпечує харчову фармацевтичну композицію, що містить 250мг аскорбінової кислоти, 250мг аскорбату кальцію, 250мг аскорбату магнію, 250мг аскорбілпальмітату, 1,000мг поліфенолів, 200мг Nацетилцистеїну, 1,000мг лізину, 750мг проліну, 500мг аргініну, ЗОмкг селену, 2мг міді і 1мг марганцю. В іншому об'єкті, представлений винахід забезпечує харчову фармацевтичну композицію, що містить 25мг аскорбінової кислоти, 25мг аскорбату кальцію, 25мг аскорбату магнію, 25мг аскорбілпальмітату, 200мг поліфенолів, 10мг Nацетилцистеїну, 50мг лізину, 25мг проліну, 50мг аргініну, 1мкг селену, 20мкг міді і 50мкг марганцю. В іншому об'єкті, представлений винахід забезпечує харчову фармацевтичну композицію, що містить 5,000мг аскорбінової кислоти, 5,000мг аскорбату кальцію, 5,000мг аскорбату магнію, 5,000мг аскорбілпальмітату, 5,000мг поліфенолів, 1,500мг N-ацетилцистеїну, 5,000мг лізину, 3,000мг проліну, 3,000мг аргініну, 200мкг селену, 9мг міді і 10мг марганцю. В іншому об'єкті, представлений винахід забезпечує харчову фармацевтичну композицію, що містить 250мг аскорбінової кислоти, 250мг аскорбату кальцію, 250мг аскорбату магнію, 250мг аскорбілпальмітату, 1,000мг поліфенолів, 200мг Nацетилцистеїну, 1,000мг лізину, 750мг проліну, 500мг аргініну, 100мкг селену, 2мг міді, 1мг марганцю, 500мг кальцію і 400мг магнію. В іншому об'єкті, представлений винахід забезпечує харчову фармацевтичну композицію, що містить 250мг аскорбінової кислоти, 250мг аскорбату кальцію, 250мг аскорбату магнію, 250мг аскорбілпальмітату, 1,000мг поліфенолів, 200мг Nацетилцистеїну, 1,000мг лізину, 750мг проліну, 500мг аргініну, 100мкг селену, 2мг міді, 1мг марганцю, 500мг кальцію, 400 магнію і 200 біофлавоноїдів цитрусових. Ще в одному об'єкті, представлений винахід забезпечує харчову фармацевтичну композицію, корисну при лікуванні раку, що містить: L-лізин, Lпролін, L-аргінін, аскорбінову кислоту, кальцій, магній, поліфеноли, N-ацетилцистеїн, селен, мідь і марганець. 7 В іншому об'єкті, представлений винахід забезпечує харчову фармацевтичну композицію, що містить 1,000мг L-лізину, 750мг L-проліну, 500мг L-аргініну, 710мг аскорбінової кислоти, 22мг кальцію, 50мг магнію, 1,000мг поліфенолів, 200мг N-ацетилцистеїну, 30мкг селену, 2мг міді і 1мг марганцю. В іншому об'єкті, представлений винахід забезпечує спосіб лікування раку у індивідуума, включає етап призначення індивідуумові харчових фармацевтичних композицій як описано. Переважно, рак вибирають з групи, що включає меланому, рак молочної залози, рак товстого кишечнику, рак легень і рак мозку. В іншому об'єкті, представлений винахід забезпечує спосіб лікування запального захворювання у індивідуума, що включає етап призначення індивідуумові харчової фармацевтичної композиції як описано. Переважно, запальним захворюванням є остеоартрит. Короткий опис малюнків Фіг.1 зображує інгібувальні впливи поліфенолів, аскорбату, проліну і лізину на міграційне -поводження ракових клітин молочної' залози людини. Фіг.2 зображує інгібувальні впливи поліфенолів, аскорбату, проліну і лізину на міграційне поводження ракових клітин товстого кишечнику людини. Фіг.З зображує інгібувальні впливи поліфенолів, аскорбату, проліну і лізину на міграційне поводження клітин меланоми людини. Фіг.4 зображує інгібувальні впливи поліфенолу, аскорбату, проліну і лізину на апоптоз клітин меланоми людини. Фіг.5 зображує інгібувальні впливи аскорбінової кислоти, проліну, лізину і різних кількостей EGCG на клітинну проліферацію меланоми людини (А 2058). Фіг.6 зображує інгібувальні впливи EGCG на проліферацію ракових клітин молочної залози людини (MDA-MB 231). Фіг.7 зображує впливи додавання до основного середовища аскорбінової кислоти, проліну, лізину і різних кількостей EGCG на проліферацію ракових клітин молочної залози людини (MDA-MB 231). Фіг.8 зображує впливи додавання до основного середовища аскорбінової кислоти, проліну, лізину і різних кількостей EGCG на проліферацію ракових клітин товстого кишечнику людини (НСТ116). Фіг.9 зображує впливи додавання до основного середовища аскорбінової кислоти, проліну, лізину і різних кількостей EGCG на експресію матриксних металопротеїназ (ММР) у клітинах меланоми людини. Фіг.10 зображує впливи додавання до основного середовища аскорбінової кислоти, проліну, лізину і різних кількостей EGCG на інвазію Матригелю раковими клітинами молочної залози людини (MDA-MB 231). Фіг.11 зображує впливи додавання до основного середовища аскорбінової кислоти, 80692 8 проліну, лізину і різних кількостей EGCG на інвазію Матригелю раковими клітинами товстого кишечнику людини (НТС 116). Фіг.12 зображує впливи додавання до основного середовища аскорбінової кислоти, проліну, лізину і різних кількостей EGCG на зменшення кількості клітин, що піддалися інвазії, на клітинах меланоми людини (А 2058). Як використовується тут, "лізин" використовується взаємозамінно з L-лізином, "пролін" використовується взаємозамінно з Lпроліном, "аргінін" використовується взаємозамінно з "L-аргініном"; "вітамін С" використовується взаємозамінно з аскорбіновою кислотою і може включати аскорбати або естери аскорбатів. "MMPs" відноситься до матриксних металопротеїназ; наприклад, ММР-1, ММР-2, ММР-3, ММР-4, ММР-5, ММР-6, ММР-7, ММР-8, ММР-8, ММР-9, ММР-10, ММР-11 і т.д. "EGCG" відноситься до (-) -епігалокатехін-3-галату, що є головною поліфенольною складовою, що присутня у зеленому чаї. "NHDF" відноситься до нормального дермального фібробласту людини, включаючи хондроцити людини та стромальні клітини людини. Представлений винахід забезпечує харчову фармацевтичну композицію, аскорбінову кислоту, лізин, пролін і, принаймні, одну поліфенольну сполуку. Переважно, сполуку аскорбату вибирають з групи, що складається з аскорбінової кислоти, аскорбату та естерів аскорбатів. Переважно, лізин є гідрохлоридом лізину або фармацевтично прийнятними солями лізину. Переважно, пролін є гідрохлоридом проліну або його фармацевтично прийнятними солями. Поліфенольні сполуки є екстрактами зеленого чаю. Вони також відомі як катехіни. Поліфеноли присутні в зеленому чаї і були запропоновані для забезпечення захисту проти широкого спектра захворювань, включаючи рак [Mukhtar Η., Ahmed N. Am. J. Clin. Nutr. 71: 1698S-1702S (2000)]. Пероральний прийом зеленого чаю підсилив ефекти доксорубіцину при інгібуванні розвинення пухлини у мишей. Потенційна протиракова активність катехінів може -стосуватися їх впливів на декілька факторів, залучених у проліферацію ракових клітин і їх метастаз. Катехіни, як відомо, викликають зупинення клітинного циклу у людських клітинах карциноми [Ahmad Ν., Feyes D. К., Nieminen A. L, Agarwal R., Mukhtar H. J. Natl. Cancer Inst. 89: 1881-1886 (1997)]. Для захисту від запалення і цитокинів, викликаних пухлинами також залучається поліфенольна фракція зеленого чаю. Поліфенольні сполуки представлені як 30% сухої маси у зеленому чаї. Вони включають флаваноли, флавандіоли, флавоноїди та фенольні кислоти. Флаваноли є найбільш переважними серед поліфенолів у зеленому чаї і зазвичай відомі як катехіни. Існує чотири головних катехіни в зеленому чаї: 1) (-) -епікатехін, 2) (-) епікатехін-3-гапат, 3) (-) -епігапокатехін і 4) (-) епігалокатехін-3-галат (EGCG). Серед катехінів EGCG є основною поліфенольною складовою у зеленому чаї. EGCG є сильною антиоксидантною 9 сполукою і може придавати зеленому чаю властивості протиракової дії. Було описано, що сполуки катехіну здійснювали свою протиметастатичну дію через попередження процесу ангіогенезу тканин [Cao Y.( Cao R. Nature 398: 381 (1999)]. Також було показано, що EGCG противодіє дії урокінази (активатор uплазміногену) [Jankun J., Selman S. H., Swiercz R., Skrzypczak J. E. Nature: 387-567 (1997)], одного з ферментів, що найчастіше експресуються у клітинах раку у людини. EGCG є переважною поліфенольною сполукою. Переважно, поліфенольну сполуку вибирають з групи, що складається з палату епігалокатехіну, галату епікатехіну, епігалокатехіну, епікатехіну, катехіну і інших фармацевтично прийнятних солей поліфенолу і/або їх сумішей. Однією з основних терапевтичних цілей даної патентної заявки є попередження перетравлення екстрацелюлярного матриксу і його відновлення. Аскорбінова кислота або її сіль (тобто, аскорбат) необхідна для синтезу колагену, еластину й інших ключових молекул екстрацелюлярного матриксу. Для підсилення протиракової дії поліфенольних сполук, переважним чином, використовується комбінація аскорбінової кислоти, проліну і лізину. Більш переважно, комбінація підсилює поліфенольні сполуки, що включають галат епігалокатехіну, галат епікатехіну, епігалокатехін, епікатехін, катехін таким чином, що поліфенольна сполука є ефективною при зменшенні інвазії ракових клітин або повного блокування інвазії. Без зв'язку з будь-якою теорією, представлена харчова фармацевтична рецептура містить суміш компонентів, що включають поліфеноли і виявлено, що суміш ефективно функціонує при блокуванні проліферації і процесів метастазу. Виявлено, що представлена харчова рецептура композиції значно зменшує інвазію ракових клітин або повністю блокує метастаз ракових клітин. Таким чином, дана композиція ефективно попереджує поширення цих ракових клітин. Терапевтичне використання заявленої сполуки є ефективним, селективним і безпечним лікуванням раку молочної залози, товстого кишечнику й інших органів. Переважно, розкрита харчова фармацевтична композиція може містити два з компонентів, що ковалентно зв'язані. Переважно, ефективність харчової композиції підсилюється включенням сполук, відомих цінною дією на ріст і інвазію раку й інших пухлин, включаючи L-аргінін і/або аргінінвмісні сполуки. Більш переважно, використовується Nацетилцистеїн. Більш переважно, використовуються сіль селену, сіль міді і сіль марганцю, що є ефективними при попередженні і лікуванні раку та інших пухлин. Дана композиція може також включати одну або більшу кількість сполук, необхідних як кофермент у циклі Кребса, дихальному ланцюгу, або для інших метаболічних функцій клітин у кількості, що ефективна для попередження і лікування раку та інших пухлин. Представлена харчова фармацевтична композиція може призначатися пацієнтові у формі 80692 10 капсул, таблеток, порошків, пілюль, ін'єкцій, вливань, інгаляцій, супозиторіїв або інших фармацевтично прийнятних носіїв і/або засобів доставки для попередження й лікування раку й інших пухлин. Переважно, харчова фармацевтична композиція призначається у вигляді капсул, таблеток або порошків. Більш переважно, вона призначається у вигляді капсул. Представлена харчова фармацевтична композиція може використовуватися для попередження і лікування раку та інших пухлин у конкретного пацієнта, в якого пухлина або рак знаходиться в молочній залозі, яєчниках, шийці матки або інших органах репродуктивної системи, легенях, печінці, шкірі, шлунково-кишковій системі, мозку, кістках або інших органах організму. Переважно, композиція використовується при раку легень і раку мозку. Представлена харчова фармацевтична композиція може також використовуватися для попередження і лікування інфекційних захворювань, атеросклерозу, рестенозу, інших серцево-судинних захворювань та запальних захворювань. Переважно, запальним захворюванням є остеоартрит. Активація Плазміну Опосередкована ММР: Припускається, що на MMPs активність можна впливати лізином за допомогою плазмінопосередкованих механізмів, хоча не виключаються інші механізми. MMPs виділяються як проферменти і їх активація опосередковується частково за допомогою плазміну і її завершення вимагає активної форми ММР-3. Механізм активації різноманітних MMPs, детально описаний [Nagase (1997)] вказує, що ММР-3 також вимагає перетворення плазміногену на його активну форму, плазмін. Плазміногеновий активний зв'язувальний центр має сайти, в яких специфічно приєднується лізин. Тому лізин може перешкоджати активації плазміногену в плазмін за допомогою активатора плазміногену [Рат і Паулінг, 1992] шляхом приєднання до активних сайтів плазміногену. Транекзамова кислота, синтетичний аналог лізину використовувалася для інгібування протеолізу, викликаного плазміном через цей механізм. Так як активність плазміну є необхідною для стимуляції деяких MMPs тканини, лізин може перешкоджати перетворенню плазміногену на плазмін і таким чином він може інгібувати активацію майже всіх MMPs. Крім того, EGCG може здійснювати інгібувальний вплив на деградацію екстрацелюлярного матриксу через інгібування ММР-2. Ракова Інвазія і Роль Матриксу: Можливо також пригнічувати інвазію ракових клітин матриксу, збільшуючи стійкість і міцність з'єднувальної тканини навколо ракових клітин і сприяючи "капсулюванню" пухлини. Це вимагає оптимізації синтезу і структури колагенових фибрилів, для яких є суттєвим гідроксилювання гідроксипроліну і залишків гідроксилізину у волокнах колагену. Аскорбінова кислота може бути необхідною для гідроксилювання цих амінокислот. Аскорбінова кислота і L-лізин, як 11 правило, в людському організмі не виробляються; тому, субоптимальний рівень цих харчових добавок є можливим на різних патологічних стадіях, також як і через незбалансовані дієти. Хоча пролін може одержуватися з аргініну, на його одержання й або гідроксилювання можна впливати при патологічних станах. Також показано, що вміст гідроксипроліну метастатичної тканини пухлини є набагато нижчим ніж неметастатичної тканини пухлини [Chubainskaia і інші, 1989]. Широкий спектр ліків, що зменшують метастаз також підвищують вміст гідроксипроліну тканин [Chubinskaia і інші, 1989]. Було виявлено, що вміст гідроксипроліну в сечовині пацієнтів хворих на рак буде вище, ніж у здорових людей або пацієнтів не хворих на рак [Okazaki і інші, 1992]. Всі ці результати показують несприятливі впливи ракових клітин на метаболізм проліну і можливо обумовлює дефіцит проліну у пацієнтів хворих на рак. Пацієнти хворі на рак можуть мати недостатні рівні аскорбінової кислоти. Аскорбінова кислота може бути цитотоксичною до лінії злоякісних клітин і виявляє протиметастатичну дію. Представлений винахід розкриває, що комбінація аскорбінової кислоти, проліну, лізину і, принаймні, однієї поліфенольної сполуки сприяє сильному протипроліферативному і протиметастатичному впливу на лінії ракових клітин. Переважно, що представлена харчова фармацевтична рецептура є ефективною проти меланоми, раку молочної' залози і ракових клітин товстого кишечнику. Найбільше переважно, що представлена фармацевтична рецептура є ефективною проти ракових клітин товстого кишечнику людини. Поліфенольні сполуки (Катехіни): EGCG представляє один з катехінів у екстракті зеленого чаю і може мати інгібувальні впливи на ріст ракових клітин у людини. Точний основний механізм є неясним. Представлений винахід розкриває неочікуваний синергізм харчової фармацевтичної рецептури, що включає аскорбінову кислоту, пролін і лізин і, принаймні, одну поліфенольну сполуку при ефективному блокуванні проліферації і метастазу ракових клітин. Харчова фармацевтична композиція представленого винаходу ефективно блокує інвазію раку молочної залози, товстого кишечнику, шкіри (меланому) і інших форм раку. Компоненти представлені в харчовій рецептурі є сполуками, що зустрічаються в природі; і коли використовується в заявленому діапазоні, як розкрито в заявці, вони показують, що не мають ніяких токсичних побічних впливів. Таким чином, ця композиція може також використовуватися з профілактичною ціллю, тобто ефективного попередження раку й інших пухлин у організмі. Через те, що вірусні клітини та інші агресивні мікроорганізми використовують протеази подібні тим, що і ракові клітини для поширення інфекції в організмі, композиція, заявлена в даній заявці може використовуватися для ефективного попередження й лікування вірусних захворювань і інших інфекційних захворювань. 80692 12 Подібний механізм активації матриксних металопротеїназ, який використовують ракові клітини для інвазії матриксу також сприяє дестабілізації атеросклеротичних бляшок, що призводять до інфарктів міокарду і удару. Тому, композиція, заявлена в даній заявці може також використовуватися в ефективному попередження й лікування атеросклерозу, рестенозу й інших серцево-судинних ускладнень. Активація матриксних металопротеїназ, яку використовують ракові клітини для інвазії матриксу є ключовим компонентом при різноманітних запальних станах. Тому, композиція, заявлена в даній заявці може також використовуватися в ефективному попередженні й лікуванні захворювань, таких як ревматоїдний артрит, емфізема, алергії, остеоартрит та інші стани, що включають запальні аспекти. Харчова фармацевтична композиція представленого винаходу може призначатися пацієнтові у формі, таблеток, пілюль, ін'єкцій, вливань, інгаляцій, супозиторіїв або інших фармацевтично прийнятних носіїв і/або засобів доставки. Приклади Впливи аскорбінової кислоти, лізину, проліну, і принаймні, однієї поліфенольної сполуки досліджувалися з точки зору їх потенціалу проти проліферації і проти інвазії в лініях ракових клітин людини широкого спектра. Більш детально був досліджений один з компонентів екстракту зеленого чаю (тобто, галат епігалокатехіну (EGCG)). Матеріали і Способи Ракові клітини молочної залози людини MDAMB-231, ракові клітини товстого кишечнику людини НСТ 116, лінія клітин меланоми людини А2058 були отримані з АТСС. Нормальні фібробласти шкіри людини були отримані з GICBO. Де не визначено, використовувалося культуральне середовище, отримане з АТСС. При проліферації ракових клітин досліджували кожне лікування, що замінювалося вісім разів. При дослідженнях інвазії, кожне лікування здійснювалося повторно три або чотири рази. Дослідження Клітинної Проліферації В цих дослідженнях 5х104 ракових клітин молочної залози вирощували в середовищі Лєбовіца з 10% фетальної сироватки великої рогатої худоби (FBS) в планшетах на 24-комірки. Середовище використовувалося як (основне) або з певними додаваннями. Планшети інкубували в термостаті циркулюючого повітря (без додаткового С02) протягом чотирьох днів. Ракові клітини товстого кишечнику НСТ116 вирощували в середовищі МакКоя 5А і витримували в термостаті з 5% СО2 циркулюючого повітря. Наприкінці інкубаційного періоду, середовище вилучали і клітини в комірках промивали PBS з наступною інкубацією протягом 3 годин з забарвленням МІГ. Диметилсульфоксид (DMSO, 1мл) додавали до кожної комірки. Планшети з DMSO витримували при кімнатній температурі протягом 15 хвилин при обережному перемішуванні і потім OD розчину в 13 кожній комірці вимірювали при 550 нм. Було виявлено, що OD550 DMSO розчину в комірці була прямо пропорційна кількості клітин. OD550 лікування, що не містило ніякого додавання (основне) приймалася як 100. Дослідження Інвазії Матригелю Дослідження проводили, використовуючи Матригель (Becton Dickinson) прокладки в сумісних планшетах на 24-комірки. Фібробласти засівали та вирощували у комірках планшету, використовуючи DMEM. Коли фібробласти досягли конфлуентності, середовище вилучали і замінювали 750мкл середовища, визначеного для лікування. Ракові клітини (5 χ 104) суспендували у 250мкл середовища, доповненого харчовими добавками, як визначено в проекті експерименту, які були засіяні на прокладці в комірці. Таким чином середовище і на прокладці й у комірці містило ті ж самі додавання. Планшети із прокладками інкубували (у термостаті циркулюючого повітря для MDA-MB-231 клітин і 5% СО2 термостаті для ракових клітин товстого кишечнику й клітин меланоми) протягом 18-20 годин. Після інкубації вилучали середовище з комірок. Клітини на верхній поверхні прокладок обережно зішкрібали ватяним тампоном. Клітини, що проникнули через Матригель мембрану і мігрували на більш низьку поверхню Матригель, забарвлювали „гемаколор" барвником (EM Sciences) та візуально підраховували під мікроскопом. Результати піддавали ANOVA і всі можливі пари тестували на значення при ρ < 0,05. Середовище в різних дослідження було доповнено аскорбіновою кислотою, проліном, лізином і EGCG в концентраціях, як визначено. Желатиназна ЗимограФія Желатиназну Зимографію здійснювали в 10% Novex pre-cast поліакриламідному гелі (Invitrogen) в присутності 0,1% желатину. Завантажували (20мкл) культурального середовища і здійснювали SDS-PAGE з трис-гліциновим SDS буфером. Після електрофорезу гелі промивали 5% Тритоном Х100 протягом ЗО хвилин і забарвлювали. Одночасно здійснювали білкові стандарти і визначали приблизні молекулярні маси. Приклад 1 MDA-MB 231 (АТСС) ракові клітини молочної залози засівали на Матригель прокладки в камері для поліпшеної Матригель інвазії (BD). Кондиційне середовище з стандартного дермального фібробласту людини (Clonetics), доповнене різноманітними агентами (як позначено на Фіг.1) додавали до комірки. Камеру інкубували протягом 24 годин і клітини, що проникли в Матригель мембрану та мігрували на нижню поверхню мембрани, підраховували. Ці дані демонструють інгібувальний вплив гапату епігалокатехіну і комбінації аскорбінової кислоти, проліну і лізину на Матригель інвазію і міграцію за допомогою MDAMB 231 ракових клітин людини. Приклад 2 НТСТ116 (АТСС) ракові клітини товстого кишечнику людини засівали на Матригель прокладки в камері для поліпшеної Матригель інвазії (BD). Кондиційне середовище з 80692 14 стандартного дермального фібробласту людини (Clonetics), доповнене різноманітними агентами (як позначено на Фіг.2) додавали до комірки. Камеру інкубували протягом 24 годин і клітини, що проникли в Матригель мембрану та мігрували на нижню поверхню мембрани, підраховували. Ці дані демонструють інгібувальний вплив галату епігалокатехіну і комбінації аскорбінової кислоти, проліну і лізину на Матригель інвазію і міграцію НСТ116 ракових клітин товстого кишечнику людини. Приклад 3 А2058 (АТСС) людські клітини меланоми засівали на Матригель прокладки в камері для поліпшеної Матригель інвазії (BD). Кондиційне середовище з стандартного дермального фібробласту людини (Clonetics), доповнене різноманітними агентами додавали до комірки. Камеру інкубували протягом 24 годин і клітини, що проникли в Матригель мембрану та мігрували в нижню поверхню мембрани, підраховували. Ці дані демонструють інгібувальний вплив галату епігалокатехіну і комбінації аскорбінової кислоти, проліну і лізину на Матригель інвазію і міграцію А2058 клітин меланоми людини. Приклад 4 В цьому експерименті А2058 (АТСС) клітини меланоми людини засівали на Матригель прокладки в камері для поліпшеної Матригель інвазії (BD) в присутності: А: кондиційного середовища з стандартного дермального фібробласту людини (Clonetics) і В: те ж саме середовище доповнювали різними харчовими добавками, як позначено на Фіг.4 умовними позначками. Через 24 годин інкубування клітини, що проникли в Матригель мембрану і мігрували на нижню поверхню мембрани, досліджували під мікроскопом і підраховували. Ці дані демонструють апоптичний ефект галату епігалокатехіну і комбінації аскорбінової кислоти + пролін + лізин на А2058. А: Клітини Меланоми Людини в тканині культурального середовища. В: Клітини Меланоми Людини в тканині культурального середовища, що містить аскорбінову кислоту (100мкМ), пролін (140мкМ), лізин (400мкМ) і EGCG (20мкг/мл). Зверніть увагу: клітини були зруйновані. Приклад 5 Дослідження проліферації Ракових клітин Клітини Меланоми А2058 Фігура 5 показує вплив 10, 20 і 50мкг/мл EGCG без і з лізином, проліном і додаванням аскорбінової кислоти на проліферацію клітин меланоми. Ні лізин, ні пролін і ні аскорбінова кислота, ні EGCG при 10 і 20мкг/мл не мали ніякого значного впливу на проліферацію клітин. Однак, EGCG при 50мкг/мл значно знижував кількість клітин до ЗО%. Подібний вплив спостерігався з лізином, проліном й аскорбіновою кислотою. Ракові Клітини молочної залози MDA-MB-231 В цих експериментах, основне середовище доповнювали 0, 10, 20, 50, 100 або 200мкг/мл EGCG (Фігура 6). Результати показують, що 15 доповнення основного середовища 50, 100 і 200мкг/мл EGCG значно знижувало кількість клітин до 66,1±5,3, 33,6±2 і 29,6±0,8%, порівняно з контрольними середовищами без додавань відповідно. EGCG концентрації в клітинному середовищі до 20мкг/мл не мали ніякого значного інгібувального впливу на клітинну проліферацію. Були також досліджені впливи аскорбінової кислоти, лізину, проліну і різних концентрацій EGCG на проліферацію ракових клітин. Фігура 7 показує незначне зменшення кількості клітин до 86,1 ± 1,93% з аскорбіновою кислотою, лізином і проліном. Подальше додавання 20, 50 і 100мкг EGCG до цієї комбінації значно зменшувало кількість клітин до 74±5,8, 64,8±1,6 і 22±5%, порівняно з контрольною групою відповідно. Ракові клітини товстого кишечнику НС116 В той час, як інгібувальний вплив аскорбінової кислоти, проліну і лізину на проліферації ракових клітин товстого кишечнику був неясний, комбінація аскорбінової кислоти, проліну і лізину з 20мкг/мл EGCG значно зменшив кількість клітин до 69±0,5% (Фігура 8). Вищий рівень EGCG в цій комбінації (50мкг/мл) радикально зменшив кількість клітин до 4,6±0,3%. Протипроліферативна дія харчових комбінацій, використовуваних у цих дослідженнях відрізняється в залежності від типу ракових клітин. В ракових клітинах молочної залози комбінація аскорбінової кислоти, проліну і лізину з EGCG мала вищі протипроліферативні впливи, ніж тоді, коли ці харчові добавки використовувалися окремо. В меланомі і ракових клітинах товстого кишечнику, що піддавали дії комбінації аскорбінової кислоти, проліну, лізину не спостерігалося дії на їх проліферацію. Однак, комбінування цих харчових добавок з 20мкг/мл EGCG призвело до значного зменшення кількості ракових клітин товстого кишечнику, але не клітин меланоми. Виявлено, що ракові клітини товстого кишечнику більш чутливі до комбінації аскорбінової кислоти, проліну, лізину і EGCG, ніж ракові клітини молочної залози та особливо ніж клітини меланоми. Проліферація ракових клітин товстого кишечнику була майже повністю знижена (4,6%), коли аскорбінову кислоту, пролін і лізин давали з 50мкг/мл EGCG. Приклад 6 Дослідження Желатиназної ЗимограФії Вплив EGCG на клітини меланоми з основним середовищем й додаванням аскорбінової кислоти, проліну і лізину на експресію MMPs, зображується на Фігурі 9 желатиназної зимографії. Клітини меланоми показали дві смуги, що відповідають ММР-2 і ММР-9. Комбінація аскорбінової кислоти, лізину і проліну не має ніякого впливу на експресію MMPs смуг у порівнянні з основним середовищем. Однак, EGCG інгібує експресію і ММР-2 і ММР-9 в залежності від дози. Інтенсивність смуг для основного середовища й комбінації аскорбінової кислоти, лізину і проліну була такою ж самою. Приклад 7 Дослідження Інвазії Екстраиелюлярного Матриксу і Міграції 80692 16 Були досліджені інгібувальні впливи комбінації аскорбінової кислоти, проліну і лізину, використовувані окремо і разом з різними концентраціями EGCG. Вивчалися впливи цих комбінацій на екстрацелюлярний матрикс, використовуючи попередньо сформовані Матригель матрикси, що звичайно використовують для оцінки потенціалу інвазії різноманітних ліній ракових клітин. Ракові Клітини Молочної залози MDA-MB-231 Фігура 10 показує результати Матригель інвазії ракових клітин молочної залози, інкубованих у присутності аскорбінової кислоти, проліну і лізину. Інвазія ракових клітин, інкубованих у комбінації аскорбінової кислоти, проліну і лізину було зменшена до 48,1±22,1%, порівняно з клітинами, інкубованими в середовищі без додавань. В середовищі доповненому тільки 20мкг/мл EGCG, кількість клітин, що проникли зменшилася до 69,5±27,4%. Було досягнуто повне інгібування інвазії матриксу раковими клітинами молочної залози в присутності EGCG концентрації вище (50мкг/мл і 100мкг/мл). В іншому ряді досліджень, додавання до середовища 100мкМ аскорбінової кислоти 'зменшувало інвазію на 36%. Додавання аскорбінової кислоти і 140мкМ проліну надалі зменшувало інвазію на 47%. Використання 400мкМ лізину на додаток до аскорбінової кислоти і проліну в додаванні надалі зменшувало інвазію до 67%; лізин показує лінійну відповідь при підвищенні впливів аскорбінової кислоти і проліну до рівня 800мкМ. Фігура 10 також показує, що комбінація аскорбінової кислоти, проліну і лізину також як 20мкг/мл EGCG була ефективною для повного припинення інвазії ракових клітин через екстрацелюлярний матрикс. Ця комбінація зробила можливим досягти максимального інгібувального результату на інвазію ракових клітин без необхідності використання високих концентрацій окремих харчових добавок. Також, аскорбінова кислота, пролін і лізин поряд з EGCG уможливили припинити матричну інвазію ракових клітин молочної залози повністю при нижчому рівні EGCG (20мкг/мл). Ракові Клітини Товстого Кишечнику НСТ116 Фігура 11 показує, що комбінація аскорбінової кислоти, проліну і лізину значно зменшувала інвазію ракових клітин товстого кишечнику до 67,2±3,7%. Використання 20мкг/мл тільки одного EGCG зменшувало інвазію до 44,9±3,3%, в той час як комбінація аскорбінової кислоти, проліну, лізину і 20мкг/мл EGCG мала синергічний вплив, зменшуючи інвазію ракових клітин товстого кишечнику до 24,9±4,6%. Клітини Меланоми А2058 Фігура 12 показує, що комбінація аскорбінової кислоти, проліну і лізину була ефективна при зниженні кількості клітин, що проникли до 88,2±4%, однак це зменшення не було статистично значимим. Комбінація цих харчових добавок з тільки до 20мкг/мл EGCG було ефективною в зменшенні кількості клітин, що проникли, до нуля. Результати показують, що використання аскорбінової кислоти, проліну і лізину з EGCG 17 80692 дозволяють одержати радикальне зменшення кількості клітин, що проникають і мігрують через Матригель мембрану при нижчих рівнях EGCG. Інвазія була знижена до нуля, використовуючи настільки низький рівень, як 20мкг/мл EGCG з аскорбіновою кислотою, проліном і лізином у ракових клітинах молочної залози і клітинах меланоми. Переваги комбінованих результатів з раковими клітинами товстого кишечнику не були настільки вражаючими, як отримані з раковими клітинами молочної залози. Рівень EGCG повинен бути 50мкг/мл для одержання 90% зменшення інвазії цими клітинами. В цьому дослідженні, ніяких зрушень в MMPs експресії в клітинах меланоми не спостерігалось, хоча EGCG має інгібувальний вплив на їх експресію в залежності від дози. Ця серія досліджень остаточно демонструє, що представлена харчова фармацевтична рецептура, що включає аскорбінову кислоту, пролін, лізин і, принаймні, одну поліфенольну сполуку викликає ефективні протипроліферативний і протиінвазійний ефекти ракових клітин. Приклад 8 Наступні харчові фармацевтичні рецептури (Таблиці 1-5) і ЕПІКАН ФОРТЕ™ (Таблиця 6) ілюструють їх приготування. Виявлено, що ці рецептури, що включають аскорбінову кислоту, пролін, лізин і, принаймні, одну поліфенольну сполуку є ефективними в блокуванні інвазії ракових клітин і метастазу ракових клітин. Таблиця 1 Рецептура 1 % Біохімічні речовини Кількість Аскорбінова кислота 250мг 5,6 Аскорбат кальцію 250мг 5,6 Аскорбат магнію 250мг 5,6 Аскорбілпальмітат 250мг 5,6 Поліфеноли 1,000мг 22,5 N-Ацетилцистеїн 200мг 4,5 Лізин 1,000мг 22,5 Пролін 750мг 16,8 -Аргінін 500мг 11,2 Селен ЗОмкг