Мультивалентна вакцина з нативних везикул зовнішньої мембрани менінгококів, способи її застосування

Реферат: Даний спосіб належить до композиції вакцин, що містить нативні везикули зовнішньої мембрани менінгококів (NOMV) щонайменше з двох генетично модифікованих штамів Neisseria, що забезпечує захисний імунітет проти менінгококової інфекції, більш переважно, інфекції, що викликається менінгококами підтипу В. Заявлений спосіб також належить до способів імунізації тварини або людини проти менінгококової інфекції, що включають в себе введення вакцинної композиції за даним винаходом. UA 99659 C2 (12) UA 99659 C2 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 За даною заявкою запитується пріоритет попередньої заявки США номер 61/057462, озаглавленої «МУЛЬТИВАЛЕНТНА ВАКЦИНА З НАТИВНИХ ВЕЗИКУЛ ЗОВНІШНЬОЇ МЕМБРАНИ МЕНІНГОКОКІВ» і поданої 30 травня 2008 p., повний опис і вміст вищезгаданої заявки, таким чином, повністю включений в даний документ як посилання. Федеральна підтримка дослідження або розробки Уряд США має права на даний винахід. Neisseria meningitidis є основною причиною менінгіту і септицемії у всьому світі. Менінгококовий менінгіт являє собою запалення м'яких оболонок мозку, оболонки, що вистилає головний мозок і спинний мозок. Як при менінгококовій септицемії, так і при менінгококовому менінгіті, ураження викликане неконтрольованою місцевою або системною запальною відповіддю хазяїна. Захворювання, що викликається менінгококами групи В, в даний час є причиною щонайменше половини всіх викликаних менінгококами захворювань в багатьох країнах, включаючи Північну і Південну Америку, і Європу. Виникнення нового вірулентного клону Neisseria meningitidis групи В, відомого як ЕТ5, в Норвегії в кінці 70-х років відтоді стало відповідальним за тривалі епідемії в Норвегії, на Кубі, в Бразілії і Чілі. Ці епідемії викликали серйозну небезпеку для суспільної охорони здоров'я і значно посилили спроби розробки ефективної вакцини проти групи В в декількох країнах з епідемією. Відсутність ліцензованої в США вакцини проти групи В поряд зі слабким ефектом вакцин, що складаються з капсульних полісахаридів А і C, на дітей молодше 18 місяців перешкоджають прийняттю рішення про повсюдну вакцинацію дітей проти менінгококових інфекцій. Neisseria meningitidis розділяють на 13 серогруп, з яких 9 спричиняють інвазивне захворювання (А, В, C (C1, C1-), X, Y, W-135, Z, і L). П'ять серотипів є мішенями для розробки вакцин через їх здатність викликати епідемії, включаючи серотипи А, В, C, Y і W135, що є мішенню великої кількості досліджень для створення вакцин. Вакцини проти серогруп A, C, Y і W135 Neisseria meningitidis, що викликають майже всі інвазивні менінгококові інфекції, є доступними і загальноприйнятими для використання з відмінними результатами. Розробка відповідної вакцини проти штамів Neisseria meningitidis групи В більш значно ускладнена множиною причин. Наприклад, капсульний полісахарид, що визначає серогрупу, неефективний і потенційно небезпечний для використання у вакцині, оскільки має таку ж структуру, як полі-сіалова кислота, виявлена на визначених клітинах людини, а саме, клітинах крові. Крім того, додатковим фактором неможливості створення прийнятної вакцини є антигени мінливість і/або непостійна експресія у різних штамів групи В субкапсульних антигенів, експонованих на поверхні, таких як білки зовнішньої мембрани і ліпоолігосахарид (ендотоксин). Не було ідентифіковано жодного антигену, який би мав всі характеристики, необхідні для створення ефективної вакцини. В одному з аспектів даний винахід належить до вакцини, що містить нативні везикули зовнішньої мембрани менінгококів (NOMV), одержані щонайменше з двох штамів менінгококів, генетично модифікованих для забезпечення широкого спектра захисту. Нативні везикули зовнішньої мембрани менінгококів включають три різні набори антигенів на основі porA, LOS і консервативних білків зовнішньої мембрани; і генетично модифіковані штами модифіковані для забезпечення підвищення безпеки шляхом інактивації генів lpxL1, synX і lgtA. Обидва штами менінгококів можуть експресувати LOS з різною коровою структурою LOS і мати альфаланцюги, що складаються з глюкози і галактози. Кожний штам може експресувати щонайменше два різні підтипи білків або підтипи епітопів porA, які вибрані на основі підтипів porA, що переважають у ізолятів групи В. Крім того, вакцина може додатково містити інший консервативний поверхневий білок, який, як відомо, може індукувати бактерицидні антитіла, з надекспресією в кожному штамі і вибраний з групи, що складається з варіантів 1 FHBP (GNA1870), варіантів 2 FHBP і варіантів 3 FHBP; NadA; App; NspA; TbpA і ТbрВ. В іншому аспекті даний винахід належить до комбінації NOMV з трьох генетично модифікованих штамів Neisseria meningitidis, що мають антигенну мінливість. Щонайменше один з штамів вибраний з (1) Н44/76 HOPS-DL, який має наступні генетичні модифікації або характеристики: гени synX, lpxL1 і lgtA інактивовані; інсерція другого гена. porA (підтип P1.7-1,1) замість opaD; підвищена експресія NadA; і стабілізована висока експресія Орc і porA; (2) 8570 HOPS-GAL, що має наступні генетичні модифікації або характеристики: гени synX, IpxL1 і lgtA інактивовані; інсерція другого гена porA замість opaD; підвищена експресія варіант 1 білка, що зв'язує фактор H; і стабілізована висока експресія porA і Орc; і/або (3) В16В6 HPS-G2A, що має наступні генетичні модифікації або характеристики: гени synX, IpxL1 і lgtA інактивовані; інсерція другого гена porA замість opaD; підвищена експресія варіант 2 білка, що зв'язує фактор H; і стабілізована висока експресія porA і Орc. NOMV одержують без обробки детергентом або 1 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 денатуруючими розчинниками з клітинної маси або з виснаженого культурального середовища. Вакцину можна комбінувати з одним або декількома ад'ювантами і можна вводити внутрішньом'язово і/або інтраназально. В іншому аспекті даний винахід належить до композиції вакцини проти менінгококової інфекції, більш переважно, інфекції, викликаної менінгококами групи В, що містить нативні везикули зовнішньої мембрани менінгококів (NOMV) одного або декількох генетично модифікованих штамів Neisseria meningitidis. Один або декілька генетично модифікованих штамів модифіковані за допомогою: інактивації гена synX, інактивація гена IpxL1, інактивація гена lgtA в кожному штамі, що призводить до експресії укорочених або усічених ліпоолігосахаридів (LOS) з відсутністю тетрасахариду лакто-N-неотетраози, і/або інсерції щонайменше одного другого гена porA, що відрізняється за антигенними властивостями, замість гена opa. B іншому аспекті генетично модифікований штам додатково має підвищену або стабільну експресію щонайменше одного мінорного консервативного білка зовнішньої мембрани, і/або стабілізовану експресію щонайменше одного білка зовнішньої мембрани. Щонайменше один другий ген porA, що відрізняється за антигенними властивостями, може експресувати щонайменше один підтип білка або підтип епітопу porA, вибраний з найбільш поширених підтипів porA ізолятів meningitidis групи В. В іншому аспекті даний винахід належить до генетично модифікованого вакцинного штаму Neisseria meningitidis підтипу В. Генетично модифікований вакцинний штам може включати штам Н44/76 HOPS-D (B1), штам 8570 HOS-G1 (В2) і/або штам B16В6 HPS-G2A (В3). В іншому аспекті даний винахід належить до генетично модифікованого вакцинного штаму Neisseria meningitidis підтипу В, одержаного з: штаму Н44/76, який має наступні генетичні модифікації: і) ген synX інактивований, іі) ген lpxL1 інактивований, ііі) ген lgtA інактивований, iv) інсерція другого гена porA замість гена opaD, ν) експресія NadA в порівнянні з нативним штамом підвищена і vi) стабілізована підвищена експресія білків Орc і porA. У деяких аспектах генетично модифікований штам одержаний зі штаму дикого типу ЕТ-5 Н44/76 (В: 15: P1.7,16: L, 3,7:Р5.5, C). В іншому аспекті даний винахід належить до генетично модифікованого вакцинного штаму зі штаму Neisseria meningitidis підтипу В, одержаного з 8570, який має наступні генетичні модифікації з: і) ген synX інактивований, іі) ген IpxL1 інактивований, ііі) ген lgtA інактивований, iv) інсерція другого гена porA замість opaD; ν) підвищена експресія варіанту 1 білка, що зв'язує фактор H; і vi) стабілізована підвищена експресія білків porA і Орc. У деяких аспектах генетично модифікований штам одержаний зі штаму дикого типу ЕТ-5 85 70 (B:4: P 1.19,15: L3,7v: P5.5,11, C). В іншому аспекті даний винахід належить до генетично модифікованого вакцинного штаму Neisseria meningitidis підтипу В, одержаного з В16В6, який має наступні генетичні модифікації: і) ген synX інактивований, іі) ген IpxL1 інактивований, ііі) ген lgtA інактивований, iv) інсерція другого гена porA (підтип P 1.22-1,4) замість opaD; v) підвищена експресія варіанту 2 білка, що зв'язує фактор H; і vi) стабілізована підвищена експресія білків porA і Орc. У деяких аспектах генетично модифікований штам одержаний зі штаму дикого типу ЕТ-37 В16В6 (В:2а:Р 1.5,2: L2:P5.1,2,5). У деяких аспектах даний винахід належить до генетично модифікованого штаму, вирощеного на середовищі з дефіцитом заліза. В інших аспектах даний винахід належить до генетично модифікованого штаму, де інактивацію гена synX, гена IpxL1 або гена lgtA здійснюють за допомогою введення гена стійкості до лікарського засобу в послідовність інактивованого гена. В іншому аспекті винахід належить до вакцини, що містить NOMV, одержані з генетично модифікованих штамів за даним винаходом. NOMV одержують з клітинної маси або з використаної культурального середовища без обробки детергентом або денатуруючим розчинником. Вакцина може також містити один або декілька ад'ювантів. В інших аспектах генетично змінений штам модифікований так, що експресує білки накопичення заліза. В іншому аспекті даний винахід належить до вакцини проти менінгококової інфекції, що містить множину нативних везикул зовнішньої мембрани менінгококів (NOMV), де щонайменше деякі з NOMV по суті не експресують або не сіалують ліпоолігосахарид (LOS), містять LOS, який включає ліпід А з пентаацильною структурою, і мають підвищений рівень експресії щонайменше одного мінорного консервативного білка зовнішньої мембрани, де мінорний консервативний білок зовнішньої мембрани вибраний з білків, що індукують бактерицидні антитіла. Мінорний консервативний білок зовнішньої мембрани може бути вибраний з групи, що складається з Nad A, варіанту 1 білка, що зв'язує фактор H (FHBP) і варіанту 2 FHBP. В інших аспектах щонайменше деякі з NOMV містять укорочений або усічений LOS, що по суті не має 2 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 тетрасахарид лакто-N-неотетраозу (LNnT) і/або щонайменше деякі з NOMV містять два або більше різних білків porА. В іншому аспекті даний винахід належить до способу стимуляції імунної відповіді у відповідь на менінгококову інфекцію у тварини або людини, що включає введення композиції, що містить NOMV щонайменше з одного генетично зміненого штаму N. Meningitidis, тварині або людині для імунізації проти менінгококової інфекції. Вакцину використовують для імунізації проти інфекції, що викликається менінгококами групи В. В іншому аспекті даний винахід належить до способу одержання генетично модифікованого штаму N. Meningitidis, який можна використовувати у вакцині проти менінгококової інфекції, що включає стадії: а) вибору штаму менінгококу типу В, здатного до генетичної модифікації; b) генетичної модифікації штаму шляхом інактивації гена synX, с) генетичної модифікації штаму шляхом інактивації гена lpxL1, d) генетичної модифікації штаму шляхом інактивації гена lgtA, і є) генетичної модифікації штаму шляхом підвищення експресії одного або декількох консервативних білків зовнішньої мембрани. В інших аспектах винаходу спосіб додатково включає генетичну модифікацію штаму шляхом інсерції щонайменше одного другого гена porA, що відрізняється за антигенними властивостями, у відкриту рамку зчитування гена ора. В інших аспектах винаходу спосіб додатково включає стадію генетичної модифікації штаму для одержання стабільної експресії або надекспресії щонайменше одного білка зовнішньої мембрани за допомогою заміни полі-С послідовності всередині промотору або відкритої рамки зчитування щонайменше одного білка зовнішньої мембрани послідовністю, що містить нуклеотиди G i C. В іншому аспекті даний винахід належить до способу одержання вакцини проти менінгококової інфекції, що включає стадії: а) культивування генетично модифікованого штаму N. meningitidis, що має одну або декілька модифікацій, вибраних з групи, що складається з ген synX інактивований, ген IpxL1 інактивованйй, ген lgtA інактивований, введений щонайменше один другий ген porA з антигенними відмінностями замість гена ора, експресія щонайменше одного мінорного консервативного білка зовнішньої мембрани, підвищена або стабільна, і/або стабільна експресія щонайменше одного білка зовнішньої мембрани; b) збільшення розмірів культури за допомогою ферментації, використовуючи культивований штам підпункту а), для інокуляції середовища в ферментері; с) інактивації ферментувати культури; d) збору культивованих клітин N. meningitidis шляхом центрифугування з безперервним потоком і збору клітинної маси; є) виділення NOMV з клітинної маси; і f) ресуспендування NOMV в буфері або носії, прийнятному для введення вакцини. Фігура 1 являє собою схему технологічного процесу, що позначає одержання основного банку клітин з клітин для генетично модифікованих штамів Neisseria для одержання вакцини. Фігура 2 являє собою схему технологічного процесу, що позначає одержання препарату банку клітин, що застосовується для продукції генетично модифікованих штамів Neisseria для одержання вакцини. Фігура 3 являє собою схему технологічного процесу, яка позначає ферментацію Neisseria, що використовується для одержання генетично модифікованих штамів Neisseria для одержання вакцини. Фігура 4 являє собою схему технологічного процесу, що позначає очищення NOMV з генетично модифікованих штамів Neisseria для одержання вакцини. Фігура 5 являє собою продовження схеми технологічного процесу фігури 4. Фігура 6 являє собою зображення гелю, забарвленого Кумасі синім, що показує білковий вміст стандартного маркера (доріжка 1), контрольного препарату NOMV 8570 HOPS-G (доріжка 2), фільтрованої неочищеної вакцини (доріжка 3) і кінцевого продукту вакцини (доріжка 4). Фігура 7 являє собою гель, забарвлений сріблом, що показує вміст ліпоолігосахариду у вакцині. Доріжка 1 являє собою контрольний ML5 LPS, доріжка 2 являє собою фільтровану неочищену вакцину, і доріжка 3 являє собою кінцевий продукт вакцини. П'ятнадцять мкл розведення 1:2 100 мкг/мл вакцини розділяли в гелі (20 мкл з 100 мкл/мл 1:2 розведення контролю). Фігура 8 являє собою зображення забарвленого антитілом Вестерн-блота, що показує ідентичність і склад білків, виявлених у вакцині 8570 HOPS-G NOMV. Фігура 9 являє собою графік, що зображає TNF-, що вивільняється з крові людини після інкубації з різними концентраціями вакцини. Фігура 10 являє собою графік, на якому показане вивільнення IL-6 з крові людини після інкубування з різними концентраціями генетично модифікованої вакцини NOMV. 3 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 11 являє собою графік, на якому показаний TNF-, що вивільняється з крові людини після інкубації з різними концентраціями генетично модифікованої вакцини в порівнянні з DOCекстрагованими OMV зі штаму 44/76. Фігура 12 являє собою стовпчасту діаграму, на якій показані бактерицидні титри у мишей, вакцинованих різними концентраціями вакцини 8570 HOPS-G з ад'ювантом або без. Фігура 13 являє собою стовпчасту діаграму, на якій показані бактерицидні титри у мишей, вакцинованих вакциною 8570 HOPS-G, проти різних штамів, що тестуються. Фігура 14 являє собою графік, на якому показані результати аналізу виснаження бактерицидних антитіл для антигенів LOS, GNA1870, NOMV і Орc. На фігурі 15 показана відповідь антитіл у кроликів, вакцинованих вакциною 8570 HOPS-G NOMY з ад'ювантом і без. Фігура 16 являє собою графік, на якому показані результати аналізу бактерицидного виснаження для штамів, що тестуються проти вакцини 8570 HOPS-G1 NOMV. Фігура 17 являє собою графік, на якому показані результати аналізу бактерицидного виснаження для антигенів LOS і FHBP для штаму 8570 HOPS-G1 з нокаутом porA. На фігурі 18 представлений фенотип трьох генетично модифікованих штамів Neisseria (A=B1, В=В2, і С=В3) за даним винаходом. На фігурі 19 представлені плазміди, що використовуються для конструювання генетично модифікованих штамів Neisseria: а) плазміда, сконструйована для нокауту lgtA, b) плазміда для експресії другого porА, с) плазміда для надекспресії fHbp, під контролем ортологічного (Ptac у випадку E. coli) промотору і d) плазміда для надекспресії NadA, під контролем гомологічного промотору (промотор porA N. meningitidis) і є) характерна схема трансформації N. meningitidis плазмідою для надекспресії fHbp (варіант 1 і 2) і NadA за допомогою заміни гена NspA гомологічною рекомбінацією. Фігура 20а являє собою зображення стабілізації імунотипу з усіченим LOS вакцинного штаму NOMV за допомогою нокауту гена lgtA трьох генетично модифікованих штамів. На фігурі 20b представлений імуноблотинг експресії альфа-ланцюга LOS генетично зміненим штамом В2 і батьківським штамом (В16В6) з моноклональними антитілами проти L3.7,9 (ліворуч) і L8 (праворуч). На фігурі 21 графічно показана експресія варіанту 2 fHbp в генетично модифікованому штамі В3. На фігурі 21а показаний вибір штаму, що містить стійкий до гентаміцину рекомбінант, що містить надекспресований fHbp, за допомогою імуноблотингу, і фігура 21b являє собою Вестерн-блотинг з використанням моноклонального антитіла проти fHbp JAR4, що показує підвищену експресію fHBp. Даний винахід належить до композиції вакцини з широким спектром захисту, що використовується для імунізації проти інфекції, що викликається менінгококами, більш переважно, підгрупою Neisseria meningitidis типу В. В одному з варіантів здійснення даний винахід належить до композиції вакцини, що містить нативні везикули зовнішньої мембрани менінгококів (NOMV) щонайменше одного, переважно, щонайменше двох, більш переважно, щонайменше, трьох генетично модифікованих штамів Neisseria meningitidis. Нативні везикули зовнішньої мембрани менінгококів, звані також пухирцями, являють собою везикули, сформовані або одержані з фрагментів зовнішньої мембрани грам-негативної бактерії, які природним чином відділяються під час росту і які можна одержати з культурального середовища або з клітин неагресивними способами, в яких не застосовуються детергенти або денатуруючі розчинники. Ці NOMV, як правило, містять білки зовнішньої мембрани (OMP), ліпіди, фосфоліпіди, периплазматичний матеріал і ліпополісахарид (LPS), в тому числі ліпоолігосахариди. Грам-негативні бактерії, особливо патогени, подібні до N. meningitidis, часто передають NOMV при вірулентному інфікуванні процесом, відомим як пузиріння. Згідно з даним винаходом NOMV являють собою везикули, одержані із зовнішньої мембрани бактерій без використання способів хімічної денатурації і одержані з генетично модифікованих штамів, які мають антигенну різноманітність і кожний з яких генетично модифікований з метою підвищення безпеки, антигенної стабільності і розширення захисної імунної відповіді. В одному з варіантів здійснення даний винахід належить до композиції вакцини, що містить нативні везикули зовнішньої мембрани менінгококів (NOMV), одержані щонайменше з двох або більше генетично модифікованих штамів N. meningitidis, переважно, щонайменше з трьох різних генетично модифікованих штамів. Деякі варіанти здійснення даного винаходу належать до штамів N. meningitidis з антигенною різноманітністю, переважно, підтипу В, що містить щонайменше три генетичні модифікації в бактеріальному геномі, більш переважно, щонайменше п'ять генетичних модифікацій, більш доцільно, щонайменше шість генетичних модифікацій. Генетичні модифікації можуть включати 4 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одну або декілька з наступних модифікацій: 1) інактивацію гена synX, необхідного для біосинтезу сіалової кислоти, що призводить до втрати здатності експресувати або сіалувати ліпоолігосахариди (LOS) в капсулі; 2) інактивацію гена lpxL1, що призводить до значно меншої токсичності LOS, що має ліпід А з пента-ацильною структурою; 3) інсерцію другого гена porA, що відрізняється за антигенними властивостями, замість генів ора (ОраС або OpaD); 4) підвищення експресії щонайменше одного мінорного консервативного білка зовнішньої мембрани, де мінорний консервативний білок зовнішньої мембрани має здатність індукувати бактерицидні антитіла (як необмежувальні приклади, NadA, варіант 1 білка, що зв'язує фактор H (FHBP) і варіант 2 (FHBP); 5) інактивацію гена lgtA в кожному штамі, що призводить до експресії укороченого або усіченого LOS, у якого відсутній тетрасахарид лакто-N-неотетраози (LNnT); і/або 6) стабілізованої експресії конкретних білків зовнішньої мембрани, таких як Орc і porA, відповідальних за фазові варіанти штамів дикого типу. Даний винахід належить до генетично модифікованих штамів, що забезпечує як підвищену безпеку використання, так і збільшення широти захисної відповіді антитіл на менінгококові інфекції. В одному з варіантів здійснення генетично модифіковані штами забезпечують підвищену безпеку за допомогою включення щонайменше однієї з наступних мутацій в бактеріальний геном: делеції гена synX, що блокує синтез сіалової кислоти капсиду і призводить до формування негативного капсульного фенотипу NOMV, делеції гена lpxL1, що зменшує активність ендотоксину, призводячи до пента-ацильної структури ліпіду А, і/або делеції гена lgtA, що блокує біосинтез лакто-N-неотетраози на ліпоолігосахариді (LOS), що стабілізує усічену структуру LOS; більш переважно, генетично модифіковані штами надають дві з цих мутацій, найбільш переважно, генетично модифіковані штами надають всі три ці мутації. В іншому варіанті здійснення даного винаходу генетично модифіковані штами мають збільшену широту захисної відповіді антитіл через націлення щонайменше на один з трьох наборів можливих захисних антигенів, що містяться в NOMV. Три можливі для націлення антигени включають щонайменше одне з наступного: білок porA, щонайменше один консервативний мінорний білок і/або корова структура LOS, і включають будь-яке їх поєднання. У більш переважних варіантах здійснення, генетично модифікований штам націлений щонайменше на два з можливих захисних антигенів, найбільш переважно, націлений на всі три можливі захисні антигени. У деяких варіантах здійснення даного винаходу мутацію synX- (інактивація гена synX) вводили в генетично модифікований штам способом, як описано в патенті США 6558677, повний вміст якого наведений в цьому документі як посилання. У короткому викладі, плазміду на основі pUC19, що містить ген synX, в якому послідовність 200 п.о. замінена на ген стійкості до канаміцину, використовували для трансформації генетично модифікованого штаму. Стійкі до Kan трансформанти відбирали і тестували за допомогою ПЛР за присутністю ушкодженого гена synX і за негативним капсульним фенотипом. Цей synX-мутант сконструйований на основі результатів і інформації про послідовність, опубліковану Swartley і Stephens (Swartley and Stephens (1994) J. Bacteriol. 176: 1530-1534), які показали, що вставка транспозону в ген synX призводить до негативного капсульного фенотипу. Таку ж або еквівалентну мутацію можна вводити до будь-якого штаму N. meningitidis, що піддається трансформації. Прийнятна плазміда для використання для трансформації менінгококів була сконструйована з використанням наступного способу. Три послідовності ДНК з'єднували з використанням злиття способом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з елонгацією фрагментів, що перекриваються (SOE) (Horton et al. (1989) Gene 77: 61-65). Три послідовності включали, в наступному порядку, починаючи з 5'-кінця, synXB, основи 67-681; ген стійкості до канаміцину з pUC4K (Pharmacia LKB Biotech Co.), 671-1623; і synXB, основи 886-1589. Крім того, на 5'-кінці додавали гадану послідовність для накопичення, ACCGTCTGAA, за допомогою включення її на кінці праймера для ПЛР, що застосовується для ампліфікації послідовності основ 67-691 synXB. Повну конструкцію ампліфікували за допомогою ПЛР, очищували і лігували за тупими кінцями в pUC19. pUC19 використовували для трансформації Escherichia coli DH5 і відбирали на LB з агаром з 50 мкг канаміцину. Відбирали стійку до канаміцину колонію, ДНК виділяли, очищували і розщеплювали XbaI. Іншу копію гаданої послідовності для накопичення лігували в полілінкер, і одержану плазміду знову використовували для трансформації E. coli DH5, і проводили скринінг стійких до канаміцину колоній за допомогою ПЛР за присутністю додаткової послідовності для накопичення. Плазмідну ДНК виділяли з відібраної колонії і використовували як матрицю для ПЛР з використанням праймерів, що ампліфікують тільки частину вставки з плазміди, виключаючи ген стійкості до ампіциліну, який не треба вводити в N. meningitidis. Потім ампліфіковану ДНК очищували і використовували для трансформації генетично модифікованого штаму N. meningitidis. Мутант synX(-) N. meningitides відбирали за стійкістю до канаміцину і підтверджували ампліфікацією ПЛР модифікованої ділянки. 5 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У деяких варіантах здійснення даного винаходу генів lpxL1 інактивували в генетично модифікованих штамах для одержання LOS із зменшеною ендотоксичністю, експресованого на NOMV в композиціях вакцини. Ліпід А з LOS N. meningitidis зазвичай являє собою гекса-ацильну структуру і є відповідальним за ендотоксичні властивості LOS. Дві вторинні жирні кислоти, зв'язані ацил-оксіацилом, присутні в ліпіді А, є важливими для ендотоксичної активності. Генетично модифікований штам включає мутант lpxL1, як описано van der Ley і співавторами (van der Ley, P., Steeghs, L., Hamstra, HJ., van Hove, J., Zomer, B., and van Alphen, L. Modification of lipid A biosynthesis in Neisseria meningitidis lpxL mutants: influence on lipopolysaccharide structure, toxicity, and adjuvant activity. Infection and Immunity 69(10), 5981-5990, 2001.). Делеція гена lpxL1 призводила до експресії нормальних рівнів пента-ацильного LOS із сильно зменшеною ендотоксичністю, як тестували і за допомогою тесту на пірогенність у кроликів, і за допомогою аналізу вивільнення цитокінів з використанням моноцитів людини з цільної крові. Інші способи порушення функції гена lpxL1 передбачені в нижченаведений варіантах здійснення даного способу для розробки генетично модифікованих штамів. У деяких варіантах здійснення генетично модифікований штам містить інсерцію другого гена porA, що відрізняється за антигенними властивостями, замість одного з генів ора (ОраС або OpaD). Мажорний білок зовнішньої мембрани, порин А, або porA, Neisseria meningitidis, є продуктом гена porA. porA має широку антигенну різноманітність і є об'єктом фазової мінливості для ухилення від імуноселективного тиску; таким чином, він не завжди перехресно взаємодіє з іншими підтипами. Для підвищення реактивності композицій вакцини відносно різних підтипів porA щонайменше один додатковий ген porA вбудовують в ген ораС або opaD генетично зміненого штаму. Серотип porA, відібраний для вставки, вибирають на основі найбільш переважаючих форм porA, виявлених при інфекціях, що викликаються менінгококами підтипу В. Прийнятні серотипи porA включають як необмежувальні приклади: P 1.7-1 (зі штаму M1080); P 1.22,14 (зі штаму М4410); P 1.22,1,4; або інші прийнятні серотипи porA, що зрозуміло фахівцеві в даній галузі або як описано в сучасній літературі, наприклад, як описано в Sacchi et al., Diversity and prevalence of porA types in Neisseria meningitidis serogroup B in the United States, 1992-1998, J Infect Dis. 2000 Oct; 182(4): 1169-76. Другі гени porA можуть знаходитися під контролем будьякого прийнятного сильного промотору, що забезпечує експресію білка porA, наприклад, промотору porA прийнятних штамів, наприклад, штаму Н44/76. Прийнятні способи клонування гена porА в генетично змінений штам відомі фахівцеві в даній галузі і можуть включати як необмежувальні приклади гомологічну рекомбінацію. Наприклад, ген porA можна ампліфікувати за допомогою ПЛР з ДНК бактеріальної хромосоми, клонувати в клонуючий вектор і потім клонувати у відповідним чином сконструйовану плазміду, наприклад, pUC19, з використанням злиття генів за допомогою модифікації способу ПЛР з елонгацією фрагментів, що перекриваються. Цю сконструйовану плазміду можна вводити в бактеріальний геном за допомогою гомологічною рекомбінації, так щоб замінити ген ора. Трансформанти можна відбирати блотингом колоній з моноклональними антитілами проти порину. Ці способи відомі фахівцеві в даній галузі, У наступних варіантах здійснення даного способу модифіковані штами мають стабільну і/або підвищену експресією щонайменше одного мінорного білка зовнішньої мембрани. Прийнятні мінорні білки зовнішньої мембрани мають здатність індукувати бактерицидні антитіла (наприклад, як необмежувальні приклади, NadA, варіант 1 білка, що зв'язує фактор H (FHBP) і варіант 2 (FHBP). Не обмежуючись межами будь-якої теорії, стабілізація і/або підвищена експресія високо консервативних експонованих на поверхні мінорних білків. зовнішньої мембрани, ідентифікованих за допомогою геномного аналізу, як захисні антитіла, що мають потенціал індукувати, можуть призводити до збільшення перехресної захисної імунної відповіді. Прийнятні консервативні мінорні білки включають як необмежувальні приклади, NadA, варіант 1 і 2 FHBP і Орc. Способи стабілізації і/або надекспресії мінорного білка зовнішньої мембрани (OMP) включають використання що експресують плазмід і гомологічної рекомбінації або інших прийнятних способів, відомих фахівцеві в даній галузі. Мінорні OMP можуть знаходитися під контролем сильного промотору, як необмежувальні приклади, промотору porA N. meningitidis або індукованого IPTG промотору ptac E. CoIi. Як описано в прикладах нижче, сконструйовані плазміди використовували для встановлення підвищеної експресії fHbp 1 і fHbp 2 в генетично модифікованих штамах, де надекспресований білок виглядає правильно процесованим, ліпідованим і транслокованим до поверхні зовнішньої мембрани. Наприклад, експресія ν.1 під контролем IPTG промотору Ptac E. соlі, що індукується в штамі 8570 HOPS-G (В2) була приблизно в 4 рази вище, ніж в батьківському штамі 8570, а експресія v.2 в штамі В16В2 HPS-G2A (В3) була в 32-64 рази вище, ніж в батьківському штамі 6 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В16В6 (див. фігуру 20). Альтернативно, систему експресії з використанням промотору porA можна використовувати для стабілізації/над експресії мінорних консервативних білків. У наступних варіантах здійснення даного способу генетично модифіковані штами мають інактивацію гена lgtA, що призводить до експресії укороченого або усіченого LOS з відсутністю тетрасахариду лакто-N-неотетраози (LNnT). Важливою характеристикою LOS менінгококів є фазова мінливість, яка відбувається через мутації з високою частотою в гомополімерних відрізках нуклеотидних залишків в lgtA і інших генах Neisseria. Ці мутації включають або вимикають експресію трансферази lgtA, яка опосередковує збірку -ланцюга LOS (змінюючи конфігурацію замісників гептози два). Ця активація гена lgtA з фазовою мінливістю може призводити до небажаного подовження ланцюга LOS, що дає в результаті лакто-N-неотетраозу, яка має структурну схожість з антигенами клітин крові людини. Генетично модифіковані штами за даним винаходом мають ген lgtA, нокаутований за допомогою порушення нативного гена за допомогою маркера стійкості до антибіотика або іншого прийнятного маркера (для використання для скринінга за змінами в гені), як необмежувальний приклад, ген стійкості до зеоміцину. Способи нокауту гена lgtA відомі фахівцеві в даній галузі, включаючи як необмежувальні приклади конструювання плазмід і гомологічну рекомбінацію або трансформацію. Підданий мутагенезу ген lgtA був неактивним у всіх модифікованих штамах протягом щонайменше 22 пасажів, що спостерігаються, і була присутньою стабілізована усічена форма корової структури LOS. Делеція гена lgtA стабілізує усічену -корову структуру LOS, наприклад, забезпечуючи усічені корові структури, як зображено на фігурі 19, де показані три ілюстративні модифіковані штами, наприклад, штам В3 містить альфа-ланцюг L8 з коровою структурою L3. Генетично модифіковані штами за даним винаходом містять специфічні корові структури LOS, що відповідають імунотипам L3, L5 і L2, забезпечуючи стабілізовані корові структури, на які можна викликати імунну відповідь, і в прикладах нижче показані усічені L8-подібні LOS (L8-3, L8-5 і L8-2), які здатні знищувати штами дикого типу, що експресують повнорозмірний LOS. Штами lgtA здатні стимулювати антитіла, що розпізнають як усічені, так і повнорозмерні форми структури LOS, без перехресної реакції з олігосахаридами лакто-N-неотетраози, виявленими на клітинах крові людини. У наступних варіантах здійснення даного винаходу генетично модифіковані штами N. meningitidis мають стабілізовану експресію білків зовнішньої мембрани, які зазвичай є чутливими до фазової мінливості в штамах дикого типу, наприклад, як необмежувальні приклади, Орc і porA. Експресію цих білків можна стабілізувати способами, відомими в даній галузі, і що включають спосіб заміни послідовності полімерних повторів або в промоторах, або всередині рамки зчитування гена, що підлягає стабілізації, послідовністю, що не повторюється, оптимальної довжини, викликаючи максимальну експресію. Наприклад, частина послідовності полі-С або полі-G в промоторі цих генів можна замінювати послідовністю такої ж довжини, що містить як C, так і G нуклеотиди, наприклад, послідовність полі-G 12 п.о. з промотору орсА (див. SEQ ID NO:1) замінювали новою послідовністю такої ж довжини, що містить як C, так і G нуклеотиди, і ділянку Not I (див. SEQ ID NO:2, ділянку Not I підкреслюють). В інших прийнятних варіантах здійснення, послідовність полі-G в промоторі porA (наприклад, див. SEQ ID NO:3) можна замінювати новою послідовністю, що містить як C, так і G нуклеотиди. Додаткові варіанти здійснення даного винаходу належать до вакцинних штамів, вирощених в рідкому середовищі, що містить низький рівень заліза, щоб індукувати білкову експресію білків, залучених до накопичення заліза, наприклад, зв'язувальний трансферин білок А і В. В деяких варіантах здійснення середовище, що використовується не містить специфічної добавки хелаторів заліза, таких як десферол. Одне прийнятне середовище є модифікованим з середовища, опублікованого BW Catlin (Catlin BW. (1973) J. Infec. Dis. 128: 178-194), за. допомогою заміни декількох індивідуальних амінокислот на 1% казамінокислоти (сертифіковані, Difco Laboratories). Середовище містило на літр: 0,4 г NH 4Cl, 0,168 г KCl, 5,85 г NaCl, 1,065 г Na2HPO4, 0,17 г KH2PO4, 0,647 г цитрат натрію, 6,25 г лактату натрію (60% сироп), 0,037 г СаСl22Н2О, 0,0013 г MnSO4H2O, 5 г гліцерину, 0,02 г цистеїну, 10 г казамінокислот, 0,616 г MgSO4 і дистильовану воду до одного літра. Таке ж середовище з дефіцитом заліза використовували для вихідних флаконів і для флаконів або ферментерів з кінцевою культурою. Композиція вакцини за даним винаходом, що містить NOMV щонайменше з трьох різних генетично модифікованих штамів підгрупи В, може забезпечувати три потенційні рівні захисту або три типи антигенів, кожний з яких потенційно індукує захисну відповідь антитіл. Три антигени являють собою білок porA (шість різних підтипів porA присутні у вакцині, два в кожному з трьох вакцинних штамів); ліпоолігосахариди (три різних корових структури LOS присутні у вакцині, одна з кожного штаму); і консервативні мінорні білки NadA, варіанти 1 і 2 FHBP, і Орc, надекспресовані у вакцинних штамах. Хоча porA має відносно високий рівень антигенної 7 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мінливості з ідентифікованими сотнями різних варіантів послідовності, конкретні серопідтипи porA зустрічаються набагато більш часто, ніж інші, і помірна кількість різних серопідтипів потенційно може захищати проти більше, ніж половини захворювань, викликаних групою В. Наявність більше одного антигену, здатного індукувати бактерицидні антитіла, у вакцині є важливим, оскільки показано, що коли поверхнева щільність антигену є низькою, антитіла проти нього можуть не бути здатними ініціювати подію опосередкованого комплементом лізису. Але якщо присутні антитіла проти двох або більше таких антигенів, антитіла разом можуть ініціювати опосередкований комплементом лізис. Генетично модифіковані штами за даним винаходом включають як необмежувальні приклади три штами, зображені на фігурі 18, включаючи штами B1 (44/76 HOPS-D), В2 (8570 HOPS-G1) і В3 (В16В6 HPS-G2). Даний винахід належить до вакцини, що забезпечує широкий спектр захисту проти менінгококової інфекції, особливо менінгококовими інфекціями, що викликаються Neisseria meningitidis підгрупи В. Композицію вакцини за даним винаходом можна комбінувати з існуючою тетравалентною вакциною A, C, Y і W-135 для забезпечення захисту проти більшості патогенних серогруп N. meningitidis. Не обмежуючись межами будь-якої конкретної теорії, вакцина за даним винаходом може також забезпечувати допоміжний захист проти інших патогенних серогруп, так само як проти мінорних серогруп менінгококів, оскільки субкапсульні антигени, на яких вона основана, поширені серед всіх серогруп менінгококів. У переважних варіантах здійснення даного винаходу, гени, що представляють інтерес, або ДНК, що представляє інтерес, доставляють і інтегрують в бактеріальну хромосому за допомогою гомологічної і/або сайт-специфічної рекомбінації. Інтегративні вектори, що використовуються для доставки таких генів і/або оперонів, можуть являти собою реплікативні в певних умовах або суїцидальні плазміди, бактеріофаги, транспозони або лінійні фрагменти ДНК, одержані рестрикційним гідролізом або ампліфікацією ПЛР, як відомо фахівцеві в даній галузі. У деяких варіантах здійснення інтеграція націлена на хромосомні ділянки, необов'язкові для росту in vitro. B інших варіантах здійснення цікавлячий ген або цікавлячу ДНК можна доставляти в бактерію за допомогою епісомальних векторів, таких як кільцеві/лінійні реплікативні плазміди, косміди, плазміди, лізогенні бактеріофаги або бактеріальні штучні хромосоми. Відбір по подіях рекомбінації можна здійснювати за допомогою селективних генетичних маркерів, таких як гени, що додають стійкість до антибіотиків (наприклад, канаміцину, зеоміцину, еритроміцину, хлорамфеніколу, гентаміцину і т. д.), гени, що надають стійкість до важких металів і/або токсичних сполук, або гени, що комплементують ауксотрофні мутації. Альтернативно, можна провести скринінг за допомогою ампліфікації ПЛР, секвенування, рестрикційного розщеплення або інших способів, відомих фахівцеві в даній галузі. «Вакцина», як вказано в цьому документі, визначена як фармацевтична або терапевтична композиція, що використовується для інокуляції тварини для імунізації проти інфекції організмом, переважно, патогенним організмом. Вакцини як правило, містять один або декілька антигенів, одержаних з одного або декількох організмів, які при введенні тварині можуть стимулювати активний імунітет і захищати цю тварину від інфекції цими або спорідненими патогенними організмами. Очищені NOMV одержують для введення ссавцям, відповідно, людині, мишам, щурам або кроликам, способами, відомими в даній галузі, які можуть включати фільтрацію для стерилізації розчину, розведення розчину, додавання ад'юванту і стабілізацію розчину. Вакцини за даним винаходом можна вводити людині або тварині множиною способів, включаючи як необмежувальні приклади, наприклад, парентеральний (наприклад, внутрішньом'язовий, черезшкірний), інтраназальний, пероральний, місцевий або інші способи, відомі фахівцеві в даній галузі. Термін парентеральний, як використовують в цьому документі далі, включає способи внутрішньовенної, підшкірної, внутрішньошкірної, внутрішньом'язової, внутрішньоартеріальної ін'єкції або інфузії. Вакцина може бути в формі препарату для однократної дози або представлена у флаконах для множинних доз, які можна використовувати для програм масової вакцинації. Прийнятні способи одержання і використання вакцин можна знайти в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., Osol (ed.) (1980) and New Trends in Developments in Vaccines, Volleret al. (eds.), University Park Press, Baltimore, Md. (1978), вміст якого наведений в цьому документі як посилання. Композицію вакцини за даним винаходом, як правило, вводять парентерально в одиничних дозованих складах, що містять загальноприйняті, добре відомі нетоксичні фізіологічно прийнятні носії, ад'юванти і/або наповнювачі. Композиції вакцини за даним винаходом можуть додатково містити один або декілька ад'ювантів. «Ад'ювант» являє собою речовину, яка служить для посилення, прискорення або 8 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 продовження антиген-специфічної імунної відповіді на антиген при використанні в комбінації зі специфічними антигенами вакцини, але не стимулює імунну відповідь при самостійному використанні. Прийнятні ад'юванти включають неорганічні або органічні ад'юванти. Прийнятні неорганічні ад'юванти включають як необмежувальні приклади сіль алюмінію, таку як гель гідроксиду алюмінію (галуни) або фосфат алюмінію (переважно, гідроксид алюмінію), але можуть також являти собою сіль кальцію (зокрема, карбонат кальцію), заліза або цинку, або можуть являти собою нерозчинну суспензію ацильованого тирозину, або ацильованих цукрів, дериватизованих катіонами або аніонами полісахаридів або поліфосфазенів. Інші прийнятні ад'юванти відомі фахівцеві в даній галузі. Можна використовувати також системи ад'ювантів Th1, і вони включають як необмежувальні приклади, наприклад, монофосфорилліпід А, інші нетоксичні похідні LPS і комбінацію монофосфорилліпіду А, такого як 3-де-О-акрильований монофосфорилліпід A (#D-MPL), разом з сіллю алюмінію. Інші відповідні ад'юванти включають як необмежувальні приклади MF59, MPLA, Mycobacterium tuberculosis, Bordetella pertussis, бактеріальні ліпополісахариди, сполуки аміноалкілглюкозамінфосфату (AGP), або їх похідні або аналоги, які є доступними з Corixa (Hamilton, Mont.) і які описані в патенті США No. 6113918; наприклад, 2-[(R)-3тетрадеканоїлокситетрадеканоїламіно]етил, 2-дезокси-4-О-фосфоно-3-О-[(R)-3тетрадеканоїокситетрадеканоїл]-2-[(R)-3-тетрадеканоїокситетрадеканоїламіно]-b-Dглюкопіранозид, MPL™ (3-O-деацильований монофосфорилліпід А) (доступний з Corixa), описаний в патенті США No. 4912094, синтетичні полінуклеотиди, такі як олігонуклеотиди, що містять мотив CpG (патент США No. 6207646), COG-ODN (CpG олігодезоксинуклеотиди), поліпептиди, сапоніни, такі як Quil A або STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, Mass.), описаний в патенті США No. 5057540, токсин коклюшу (PT), або термолабільний токсин E. coli (LT), зокрема, LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; див., наприклад, Міжнародні публікації патентів No. WO 93/13302 і WO 92/19265, холерний токсин (в формі дикого типу або в мутантній формі). Альтернативно, різні масляні склади, такі як стеарилтирозин (ST, див. патент США No. 4258029), дипептид, відомий як MDP, сапонін, субодиниця В холерного токсину (CTB), термолабільний ентеротоксин (LT) з E. coli (розроблений генетично токсоїдований мутант LT) і емульсоми (Pharmos, LTD., Rehovot, Israel). Різні цитокіни і лімфокіни є прийнятними для використання як ад'ювантів. Одним таким ад'ювантом є гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (GM-CSF), що має нуклеотидну послідовність, як описано в патенті США No. 5078996. Цитокін інтерлейкін-12 (IL-12) являє собою інший ад'ювант, описаний в патенті США No. 5723127. Показано, що інші цитокіни або лімфокіни мають імуномодулюючу активність, включаючи, як необмежувальні приклади, інтерлейкіни 1-, 1-, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 і 18, інтерферони-,  і , гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор і фактори некрозу пухлини  і , і є прийнятними для використання як ад'ювантів. Композиції вакцини можна ліофілізувати для одержання вакцини проти N. meningitidis в суху форму для простоти транспортування і зберігання. Крім того, вакцину можна одержувати в формі змішаної вакцини, що містить NOMV, які містять білки з генетично змінених штамів, описаних вище, і щонайменше один інший антиген, за умови, що доданий антиген не заважає ефективності вакцини і побічні ефекти і несприятливі реакції не збільшуються адитивно або синергічно. Вакцину можна зв'язувати з хімічними групами, які можуть поліпшувати розчинність, поглинання, біологічний час напівжиття вакцини і т. д. Альтернативно, групи можуть зменшувати токсичність вакцини, припиняти або послаблювати будь-який небажаний побічний ефект вакцини і т. д. Групи, здатні опосередковувати такі ефекти, описані в Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Способи приєднання таких груп до молекули добре відомі в даній галузі. Вакцину можна зберігати в запечатаному флаконі, ампулі або т. п. Вакцину за даним винаходом, як правило, можна вводити в формі спрею для інтраназального введення або за допомогою крапель в ніс, інгаляцій, тампонів на мигдалини або капсул, рідин, суспензій або еліксирів для перорального введення. У випадку, коли вакцина знаходиться в сухій формі, вакцину розчиняють або суспендують в стерилізованій дистильованій воді перед введенням. Переважно, використовують будь-який інертний носій, такий як сольовий розчин, фосфатносольовий буфер, або будь-який такий носій, в якому вакцина NOMV має прийнятну розчинність. Композиції вакцини за даним винаходом можуть включати носій. У випадку розчину або рідкої аерозольної суспензії, прийнятні носії можуть включати як необмежувальні приклади, сольовий розчин, розчин сахарози або інші розчини фармацевтично прийнятних буферів. Аерозольні розчини можуть додатково містити поверхнево-активну речовину. Прийнятними наповнювачами і розчинниками, які можна використовувати, є вода, розчин Рінгера і ізотонічний розчин хлориду натрію, включаючи сольові розчини, забуферені фосфатом, лактатом, Tris і т. п. Крім того, стерильні нелеткі масла є загальноприйнятими як 9 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розчинник або суспендувальне середовище, включаючи, як необмежувальні приклади, синтетичні моно- або ди-гліцериди. Крім того, жирні кислоти, такі як олеїнова кислота, знаходять застосування в одержанні прийнятних для ін'єкції лікарських засобів. Прийнятні для ін'єкції препарати, наприклад, стерильні прийнятні для ін'єкції водні або масляні суспензії, складають, як відомо в даній галузі, з використанням прийнятних диспергувальних або зволожувальних речовин і суспендувальних речовин. Стерильні прийнятні для ін'єкції препарати являють собою також стерильний прийнятний для ін'єкції розчин або суспензію в нетоксичному, прийнятному для парентерального введення розріджувачі або розчиннику, наприклад, в формі розчину в 1,3-бутандіолі. Описаний в даний час спосіб і його переваги будуть краще зрозумілі з посиланням на наступні приклади. Ці приклади представлені для опису конкретних варіантів здійснення даного винаходу. Наданням цих конкретних прикладів заявники не обмежують обсяг і вміст даного способу. Фахівцям в даній галузі зрозуміло, що повний обсяг описаного в даний час способу включає об'єкт, визначений формулою винаходу, прикладеною до цього опису, і будь-які зміни, модифікації, або еквіваленти цих пунктів формули винаходу. ПРИКЛАДИ Приклад 1: Розробка генетично модифікованого вакцинного штаму N. meningitidis і одержання NOMV, що містять білки зовнішньої мембрани генетично модифікованого вакцинного штаму. Генетично модифікований штам 8570 HOPS-G1 модифікували за допомогою п'яти генетичних модифікацій з батьківського штаму 8570, який аналізували мультилокусним ферментативним електрофорезом в лабораторії, з якої одержаний цей штам, і визначили, що він належить до клонального комплексу ЕТ-5 (Caugant, et al). Варіабельні ділянки porA були типовані за послідовністю, і імунотип LOS був верифікований перед виконанням генетичних модифікацій. Штам 8570 являв собою клон ЕТ-5 4:Р1.19, 15:L7v, ProB3 (ST4) Tbp2 типи II. Серії з п'яти послідовних генетичних модифікацій виконували для штаму, як описано нижче: 1) Другий, який відрізняється ген porA вставляли в локус opaD, нокаутуючи ген opaD. Основану на pUC 19 плазміду рА 18.4, що не має маркера стійкості до антибіотика у вставці, використовували для інсерції другого гена porA в хромосому в локус opaD, інактивуючи гени opaD заміною послідовності 100 п.о. в середині гена на вставку. Інсерція містила новий ген porA, взятий зі штаму М4410 (В:15:Р1.22,14) і вміщений під промотор porA, взятий зі штаму Н44/76. Одержаний тип porA являв собою P1.19,15: P1.22,14, що містить два гени порину А. 2) Починаючи зі штаму, одержаного із 1, з другим експресованим porA, експресію білка зовнішньої мембрани ОрсА стабілізували заміною послідовності полі-С 12 п.о. в промоторі орсА новою послідовністю такої ж довжини, що містить як C, так і G нуклеотиди. Оригінальну послідовність промотору (SEQ ID NO:1) (послідовність полі-G виділена курсивом і жирним шрифтом) 5'. CATAGTTAAAACCTCTAAAATTTGGATTGTAGTCGGATATGGTAACATAACG TAAATAATCGTTACGCTTACAATTATATTCTTAAGCTTTCGGGGGGGGGGGGATTT..3'. замінювали модифікованою послідовністю промотору (SEQ ID NO:2), що містить як C, так і G нуклеотиди, з ділянкою Not I (підкреслена) 5'..CATAGTTAAAACCTCTAAAATTTGGATTGTAGTCGGATATGGTAACATAACGTAAATAATCGTTA CGCTTACAATTATATTCTTAAGCTTTCGCGCGGCCGCGCАТТТТ.3'. Вибрана послідовність для заміни, що містить ділянку Not I, щоб дозволити верифікацію присутності заміненої послідовності. Плазміда, що використовується для трансформації, являла собою рОрс79 (SEQ ID NO:4). Вставка плазміди не містить маркера стійкості до антибіотика. Відбір трансформантів був оснований на блотингу колоній з моноклональним антитілом проти ОрсА. Вибирали штам, що підлягає трансформації, який є негативним за ОрсА фазовим варіантом, і сильні позитивні за ОрсА клони ідентифікували блотингом колоній. Істинні трансформанти відрізняли від позитивних за ОрсА фазових варіантів за допомогою ПЛР і аналізу рестрикційним ферментом (Not I). 3) Починаючи зі штаму, одержаного з 2, ген lpxL1, що являє собою ацилтрансферазу, відповідальну за зв'язування однієї з двох зв'язаних ацил-оксі-ацилом жирних кислот з ліпідом А з LOS, інактивували заміною послідовності 260 п.о. в середині гена lpxL1 вставкою, що містить ген стійкості до антибіотика tetM. Ген tetM одержували з плазміди pJS1934, одержаної з транспозону Tn916 (Swartley, et al. 1993. Моl. Microbiol. 10:299-310). Плазміда, що використовується для інактивації гена lpxL1, являла собою pMn5 (SEQ ID NO:5). Присутність вставки гена lpxL1 верифікували за допомогою ПЛР, що дає амплікон 3,3 т.п.о. з використанням праймерів на початку і в кінці гена lpxL1. 4) Починаючи зі штаму, одержаного зі стадії 3, експресію консервативного білка зовнішньої мембрани GNA 1870 (варіант 1) (FHBP v.1) збільшували вставкою другої копії варіанту 1 гена 10 UA 99659 C2 5 GNA 1870 в локус nspA, з нокаутом експресії NspA. Знову вставлений ген становив частину вставки, що містить ген стійкості до антибіотика гентаміцину, lac оперон E. соli з індукованим IPTG промотором, варіант 1 гена GNA 1870 і термінатор rrnB, використана плазміда зображена на фігурі 19с і SEQ ID NO:6. Плазміду на основі PUC19, pBE/GNA1870/101, використовували для трансформації і гомологічної рекомбінації для вставки варіанту 1 гена GNA 1870 в модифікований штам. Плазміду pBE/GNA 1870/101 (7687 п.о.) сконструювали з елементами, як описано в таблиці 1 (послідовність можна знайти в SEQ ID NO:6). Таблиця 1 Координати (нуклеотиди ##) *) PUC19 1-191 Ділянка Sac I (унікальна) 192-197 Послідовність для накопичення 198-212 5'-некодуюча ділянка NspA (NCR) 213-1248 Ділянка Bam HI 1249-1254 R Ген Gent 1255-2104 Sac II (унікальний) 2105-2110 5'-фрагмент промотору Rmp 2111-2230 (інший) Ділянка Mfe I (унікальний) 2231-2236 q Lac оперон 2237-3641 Промотор Ptac 3642-3673 Оператор Lac 3674-3702 RBS 3750-3755 Ділянка Nde I (унікальний) 3761-3766 Лідерний пептид fHBP (варіант 1) 3764-3823 ORF зі стоп-кодоном fHBP 3824-4588 (варіант 1) Ділянка SgrAI (унікальна) 4589-4596 Елемент 3'NspA і 3'NspA NCR Термінатори транскрипції rrnB 3' NspA NCR Послідовність для накопичення Hind III pUC19 10 15 20 4597-4638 4639-4945 4946-5432 5433-5447 5448-5453 5454-7687 кінець Джерело New England Biolabs (NEB) Ділянка клонування pUC 19 Конструкт ПЛР N. mening., 44-76, конструкт ПЛР R Ділянка клонування гена Gent R Конструкт ПЛР гена Gent Конструкт ПЛР Попередня плазміда для експресії NspA Конструкт ПЛР pMAL-p2X (New England Biolabs) pMAL-p2X, конструкт ПЛР pMAL-p2X, конструкт ПЛР pMAL-p2X, конструкт ПЛР Конструкт ПЛР N. mening., 44-76, конструкт ПЛР N. mening., 44-76, конструкт ПЛР N. mening., 44-76, конструкт ПЛР Попередня плазміда для експресії NspA pBAD/Thio-E (Invitrogen), ПЛР N. mening., конструкт ПЛР конструкт ПЛР Ділянка клонування pUC19 R NEB (Amp. ) *) Старт від нуклеотиду 1 pUC 19. Плазміду модифікували для видалення ділянки Nde І для подальшого зручного клонування таким чином: її розщеплювали Nde I-EcoR I і видаляли фрагмент 213 п.о. Липкі кінці заповнювали і лігували для відновлення плазміди. В результаті ділянки Nde I (183) і EcoRI (395) були знищені. Для клонування конструкцій для експресії цільового білка автори даного винаходу використовували ділянки клонування Sac I і Hind III з pUC 19. 5) Штам, одержаний на стадії 4, трансформували плазмідою на основі pUC19, що містить ген synX, в якому послідовність 200 п.о. замінювали на ген стійкості до канаміцину. Відбирали стійкі до Kan трансформанти і тестували за допомогою ПЛР на присутність інактивованого гена synX i негативний капсульний фенотип. Результати верифікували нокаут гена synX. 6) Штам, одержаний на стадії 4, трансформували плазмідою рВЕ-501, що містить ген стійкості до зеоміцину, що нокаутує ген lgtA (SEQ ID NO:9). Плазміда рВЕ-501 містила елементи, які можна знайти в таблиці 2. Нокаутом гена lgtA одержували експресію укороченого або усіченого LOS з відсутністю тетрасахариду лакто-N-неотетраози (LNnT) (див. фігуру 20). 25 11 UA 99659 C2 Таблиця 2 Елемент Клонуючий вектор pCR 4ТОРО ТА Послідовність для накопичення 5'-ділянка lgtA Координати (нуклеотиди ##) 1-3667 Джерело Invitrogen. Тип: точка початку реплікації pUC Послідовність для накопичення Клонуючий вектор pCR 4ТОРО ТА 5 10 15 20 25 30 Конструкт ПЛР 3683-4037 4123-4497 4498-4633 4634-5448 Фрагмент pEM7/Zeo 3668-3682 N. mening., 2996, конструкт ПЛР Invitrogen. Ділянка клонування і промотор ЕМ7 гена стійктості до зеоцину Ген ZeocinR, що дає AlgtA pEM7/Zeo Фрагмент ділянки клонування lgtA з pEM7/Zeo N. mening., 2996, конструкт ПЛР 5449-5463 Послідовність для накопичення 4038-4122 5464-5759 кінець Invitrogen *) кДНК lgtA розщеплювали BssH II. Одержані 3'- і 5'- липкі кінці заповнювали, і ген стійкості до зеоцину вставляли в цю кДНК з тупими кінцями. У випадку вирізання інактивуючого гена стійкості до зеоцину, що може відбуватися під час репарації бактеріальної ДНК, резервні 3'- і 5'фрагменти lgtA несуть послідовність, що не піддається репарації Цей генетично модифікований штам тестували, щоб пересвідчитися в збереженні всіх п'яти мутацій і експресії всіх очікуваних антигенів. Приклад 2: Одержання вакцинних кількостей генетично модифікованого штаму Потім генетично модифіковані штами використовували для одержання основного банку клітин і банку клітин для продукції для використання для виготовлення вакцини, як детально описано на схемах технологічного процесу на фігурах 1-5 для одержання композиції NOMV. Культуру NOMV тестують по експресії білків зовнішньої мембрани і LOS. Приклад 3: Характеризація вакцин Кінцевий продукт, одержаний з прикладу 2, піддавали тестуванню для контролю якості і доклінічному тестуванню безпеки і імуногенності на мишах і кроликах. Склад кінцевого продукту вакцини являв собою: Білок 200 лаг/мл Ліпоолігосахарід 36 тг/мл Нуклеїнова кислота 2,5 мкг/мл Хлорид натрію 0,9% Буфер Tris-HCl 0,01 M pH 7,6 Композицію вакцини далі аналізували електрофорезом в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію і Вестерн-блотингом. На фігурі 6 зображений гель, забарвлений Кумасі синім, що показує білковий вміст у вакцині (доріжка 4) в порівнянні з контролем (доріжка 2) і партією фільтрованої неочищеної вакцини (доріжка 3). На фігурі 7 зображений гель, забарвлений сріблом, що показує ліпоолігосахаридний компонент вакцини (доріжка 3) в порівнянні з контролем (ML5 LPS, доріжка 1) і партією фільтрованої неочищеної вакцини (доріжка 2). На фігурі 8 зображені результати тестування ідентичності вакцини за головними компонентами вакцини NOMV відповідно до антитіл, як перераховано в таблиці 3. 12 UA 99659 C2 Таблиця 3 Доріжка 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 5 Специфічність антитіл Моноклональне антитіло Попередньо забарвлений стандарт L8 LOS L8v LOS L3,7 LOS Lip (H8) Ора Р5.10 Ора Р5.11 Орc (Р5.С) FHBP І (GNA1870) Rmp PorB P4 PorA Р1.14 PorA Р1.15 PorA Р1.19 ТВР2 Полісахарид групи В забарвлювання амідо чорним Очікувана реакція Результат тесту Слідова Позитивна Слідова Позитивна Негативна Негативна Позитивна Позитивна Позитивна Позитивна Позитивна Позитивна Позитивна Позитивна Негативна Слідова Позитивна Слідова Позитивна Негативна Негативна Позитивна Позитивна Позитивна Позитивна Позитивна Позитивна Позитивна Позитивна Негативна NA 2-1 L8 25-1-LC1 9-2-L379 2-1-СА2 23-1-Р5.10 MF7-1-P5.11 В306-Р5С JAR 4 9F5 15-1-Р4 MN21G3.17 MN3C5C 2-1-Р1.19 476C2G2 2-2-В NA Результати, які можна знайти на фігурах 6, 7 і 8, показують білки, виявлені у вакцинах NOMV з генетично модифікованого штаму 8570 HOPS-G NOMV, містять білки і LOS, як описано. Приклад 4: Тест загальної безпеки вакцини Вакцину тестували в Тесті загальної безпеки вакцини, як наказано в 21 CFR 610.11. Результати для вакцини наведені в таблиці 4. Таблиця 4 Тестований препарат 15 Коментарі Вакцина 8570 HOPS-G NOMV, Партія № 1289 10 Результат тесту Пройдений Всі тварини залишилися нормальними і здоровими, і набирали масу Приклад 5: Тест пірогенності на кроликах* Результати тесту пірогенності на кроликах за активністю ендотоксину наведені в таблиці 3 для генетично модифікованої вакцини 8570 HOPS-G NOMV окремо і для вакцини, адсорбованої на ад'юванті - гідроксиді алюмінію. Наведені значення являють собою найвищі тестовані кількості, які не викликали лихоманку у кроликів (збільшення температури >0,5°С), результати можна знайти в таблиці 5. Таблиця 5 Тестована концентрація Тестований препарат Вакцина 8570 HOPS-G NOMV, Партія № 1289 Вакцина 8570 HOPS-G NOMV, Партія № 1289, адсорбована на Rehydragel HPA алюмінію, партія № 1347 20 0,4 пг/кг 0,5 мкг/кг Підвищення температури у вказаного кролика 1 2 3 0,1 0,2 0,2 0 0 0 * Ці тести проводили в BioReliance, Inc. Згідно з GLP, дотримуючись протокола, вказаного в CFR. ** Кількість гідроксиду алюмінію/кг, призначена для використання в дослідженні на людині для всіх складів (доз). 13 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 Загалом, вакцина окремо пройшла тест при 0,4 пг/кг, ад'ювант гідроксид алюмінію пройшов тест при 15 пг/кг (найбільша кількість на кг, що підлягає використанню в клінічному дослідженні), і вакцина адсорбована на гідроксиді алюмінію, пройшла тест при 0,5 лаг/кг, але не пройшла при 1,0 пг/кг. Екстраполяція цих результатів на основі пг/кг дозволяє передбачати, що адсорбована вакцина може є не пірогенною для людини аж до дози в діапазоні 25-50 мкг. Приклад 6: Вивільнення цитокінів з цільної крові людини Вакцину тестували на вміст ендотоксину за допомогою вимірювання її здатності індукувати протизапальні цитокіни TNF-альфа і IL-6, зі свіжої цільної крові людини. Результати показані на фігурах 9 і 10. Дані являють собою середнє з 3 (стандарт LPS E. CoIi і вакцина NOMV партії 1119 з lpxL2 LOS) або 5 (партія 0832 NOMV з LOS дикого типу і вакцина партії 1289 NOMV з lpxL1 LOS) тестів. Планки похибок являють собою стандартну помилку середнього. Концентрація NOMV основана на білку, але стандарт LPS E. CoIi оснований на LPS за масою. Не обмежуючись межами будь-якої конкретної теорії, ці результати дозволяють передбачати, що дана вакцина може мати профіль безпеки у добровольців-людей, схожий з тим, який спостерігали для вакцини, що містить lpxL2 LOS (Менінгококова вакцина 44/76 MOS 5D NOMV, партія № 1119, BB-IND 12687). Активність вакцини 8570 HOPS-G NOMV партії № 1289 порівнювали з активністю екстрагованих дезоксихолатом везикул зовнішньої мембрани (OMV). Везикули одержували з використанням основного способу, описаного Fredriksen JH, et al. NIPH Annals, 14:67-80, 1991, за винятком того, що протягом процедури використовували 0,5% дезоксихолат (DOC) замість використання 1,2% DOC для ресуспендування осадів після ультрацентрифугування. Результати цього порівняння показані на фігурі 11. Приклад 7: Імуногенність у мишей і відповідь бактерицидних антитіл Мишам вводили три дози генетично модифікованого вакцинного штаму 8570 HOPS-G з інтервалами в чотири тижні з адсорбцією або без на ад'юванті - гідроксиді алюмінію (Rehydragel LV). Групи з 10 мишей вакцинували внутрішньоочеревинно на 0, 4 і 8 тижні за допомогою 0,1, 0,3, 1,0 або 3,0 мкг NOMV, де групи вакцин перераховані в таблиці 6. Сироватку відбирали на 0, 7 і 10 тижні. Сироватку тестували на бактерицидні антитіла проти чотирьох різних штамів, батьківського штаму вакцини і декількох споріднених штамів з використанням нормальної сироватки людини як джерела комплементу. У сироватці до вакцинації однаково була відсутня бактерицидна активність. Таблиця 8 Група вакцини 1 2 3 4 5 6 7 8 9 35 40 45 Ін'єктована кількість вакцини 0,1 мкг 0,3 мкг 1,0 мкг 3,0 мкг 0,1 мкг+Rehydragel LV 0,3 мкг+Rehydragel LV 1,0 мкг+Rehydragel LV 3,0 мкг+Rehydragel LV 1,0 мкг+Rehydragel HPA Результати, одержані за допомогою 10-тижневої сироватки (три дози вакцини) показані на фігурі 12, що показує бактерицидний титр різних груп вакцини для генетично модифікованих штамів. Два з штамів, що тестуються, були ізогенними з батьківським штамом вакцини. Вони одержані з батьківського штаму заміною гена porА зміненим porA, що має відмінну специфічність серопідтипу. Два з білків porA, експресованих в цих тестованих штамах, присутні у вакцині (P1.19,15 і P 1.22,14), але третій (P 1.22-1,4) не присутній. Четвертий штам, 44/76, має відмінний porA відмінний porВ, і відмінну корову структуру LOS в порівнянні з вакцинним штамом. Несподівано, на відміну від опублікованих досліджень, в яких для екстрагованих дезоксихолатом везикулярних вакцин показують, що антиген porA, як правило, є домінантним антигеном, для одержаних за даним винаходом вакцин показали, що основна частина бактерицидної активності не залежала від серопідтипу штаму-мішені, і таким чином, не спрямована проти porA. Для бактерицидних антитіл, індукованих у мишей за допомогою вакцини 8570 HOPS-G NOMV, не показали специфічності для серопідтипу, але, мабуть, вони в основному є незалежними від серопідтипу і серотипу (Фігура 13). Виявлено, що антитіла, що знищують штам 14 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 44/76, в основному спрямовані проти LOS. Планки являють собою стандартну помилку середнього. Вакцину вводили з і без адсорбції на ад'юванті гідроксиді алюмінію Rehydragel LV. Аналіз специфічності відповіді бактерицидних антитіл проти гетерологічного штаму 44/76 проводили виснаженням бактерицидної активності за допомогою різних виділених антигенів. Сироватку мишей після вакцинації розводили до бактерицидної кінцевої точки (-50% знищення) і інкубували в ямку 96-ямкового планшета для мікротитрування, покритих різними концентраціями декількох антигенів. Після 4-год інкубації, сироватку тестували за бактеріцидною активністю і визначали процент видалення бактерицидного антитіла. Очищений LOS, одержаний зі штаму-мішені, (імунотип L3,7) був здатним видаляти майже все антитіло. Очищений LOS (імунотип L8v) одержаний з вакцинного штаму, був здатним видаляти приблизно 70% антитіла. Консервативний білок GNA 1870 (очищений, рекомбінантний білок), очевидно, видаляв приблизно 20% бактерицидної активності, що, без зв'язку з будь-якою конкретною теорією, може вказувати на деяке кооперативне знищення, що залучає як анти-LOS антитіло, так і анти-GNA1870 антитіло, як показано на фігурі 14. Приклад 8: Імуногенність у кроликів Вакцину тестували також за імуногенністю у кроликів. Групи з чотирьох кроликів вакцинували внутрішньом'язово за допомогою різних доз вакцини, з адсорбцією або без на ад'юванті - гідроксиді алюмінію. Три дози вводили з інтервалами по шість тижнів, і кров відбирали через два тижні після останньої ін'єкції. Визначали відповідь бактерицидного антитіла у кроликів на чотири штами, що тестуються. Штами, що тестуються, включали 3 ізогенні варіанти 8570, що експресують різні білки porA і L3,7v LOS, і штам 44/76, що має гетерологічний porA і LOS з відмінною коровою структурою. Білки porA P1.19,15 і Р1.22,14 були присутніми у вакцині, але P 1.22-1,4 не був присутнім. Результати бактерицидних тестів наведені на фігурі 15. Аналіз перехресно реактивної бактерицидної активності проти штаму 44/76 проводили таким самим способом, як для сироватки мишей і результати були в основному такими ж. Більшість перехресно-реактивних бактерицидних антитіл можна було видалити за допомогою очищеного LOS, гомологічного штаму, що тестується. Приклад 9: Одержання і тестування на тваринах лабораторної партії повної мультивалентної NOMV вакцини. На додаток до штаму 8570 HOPS-G1, який описаний в прикладах вище, два додаткові вакцинні штами були вибрані і генетично модифіковані. Перший являв собою штам В 16В6 (В:2а:Р 1.5,2:L2). Цей штам належить до генетичної групи ET-37 і має білок porВ класу 2 і білок В типу І, що зв'язує трансферин. Другий являв собою штам 44/76 (B:15:P1.7,16:L3,7), який належить до генетичної групи ЕТ-5 і є представником епідемічного штаму, що відповідає за епідемію, викликану менінгококами групи В в Норвегії в 1970 pp. і 1980 pp. Він експресує білок porВ класу 3 і зв'язувальний трансферин білок В типу II. Штам В16В6 генетично модифікували в основному таким самим способом, як описано для штаму 8570 HOPS-G1. Два гени інактивували, synX і lpxL1, для запобігання синтезу капсули і сіалуванню LOS, і для зменшення токсичності LOS. Другий ген PorA (підтип Р1.22-4) вставляли замість гена opaD. Варіант 2 GNA 1870 (FHBP) з IPTG промотором Ptac E. coli, що індукується,вставляли замість гена nspA як другу копію з використанням плазміди рВЕ-201 (SEQ ID NO:7). Плазміду рВЕ-201 (7687 п.о. для додаткової експресії fHBP (варіант 2)) сконструювали з елементами, як описано в таблиці 7. Таблиця 7 Елемент *) PUC19 Ділянка Sac I (унікальна) Послідовність для накопичення 5'-NCR NspA Ділянка Bam H І R Ген Gent Sac II (унікальна) 5'-фрагмент промотору (інший) Ділянка Mfe I (унікальна) Rmp Координати (нуклеотиди Джерело ##) 1-191 New England Biolabs (NEB) 192-197 pUC19 198-212 Конструкт ПЛР N. mening., 44-76, конструкт 213-1248 ПЛР R 1249-1254 Ділянка клонування гена Gent R 1255-2104 Конструкт ПЛР гена Gent 2105-2110 Конструкт ПЛР 2111-2230 N. mening., конструкт ПЛР 2231-2236 Конструкт ПЛР 45 15 UA 99659 C2 Продовження таблиці 7 Елемент q Lac оперон Промотор Ptac Оператор Lac RBS Ділянка Nde I (унікальна) Лідерний пептид fHBP (варіант 2) ORF зі стоп-кодоном fHBP (варіант 2) Координати (нуклеотиди ##) 2237-3641 3642-3673 3674-3702 3750-3755 3761-3766 3764-3823 pMAL-p2X (New England Biolabs) pMAL-p2X, конструкт ПЛР pMAL-p2X, конструкт ПЛР pMAL-p2X, конструкт ПЛР Конструкт ПЛР N. mening., 2996, конструкт ПЛР 3824-4588 N. mening., 2996, конструкт ПЛР Ділянка SgrAI (унікальна) 4589-4596 3'NspA і 3'NspA NCR 4597-4638 Термінатори транскрипції rrnB 3'NspA NCR Послідовність для накопичення Hind III pUC19 5 10 15 4639-4945 4946-5432 5433-5447 5448-5453 5454-7687 кінець Джерело N. mening., 44-76, конструкт ПЛР Попередня плазміда для експресії NspA pBAD/Thio-E (Invitrogen), ПЛР N. mening., конструкт ПЛР конструкт ПЛР Ділянка клонування pUC19 R NEB (Amp ) *) Старт від нуклеотиду 1 pUC 19. Плазміду модифікували для видалення ділянки Nde I для наступного зручного клонування наступним чином: її розщеплювали Nde I-EcoR I і видаляли фрагмент 213 п.о. Липкі кінці заповнювали і лігували для відновлення плазміди. В результаті ділянки Nde I (183) і EcoRI (395) були знищені. Для клонування конструкцій для експресії цільового білка автори даного винаходу використовували ділянки клонування Sac I і Hind III з pUC 19. Фазовий варіант одержаного штаму, що експресує усічений альфа-ланцюг, який складається з глюкози і галактози, L2 LOS, відбирали блотингом колоній. Одержаний генетично модифікований штам визначили В16В6 HPS-G2, див. фігуру 18. Штам 44/76 також генетично модифікували, за тим самим принципом, як описано для штаму 8570 HOPS-G1. Два гени, synX і lpxL1, інактивували інсерційним мутагенезом, другий ген porA (підтип Р1.7-1,1) вставляли разом з його промотором замість гена opaD, і другу копію nadA вставляли під промотором porА замість гена nspA. Плазміду рВЕ-311 використовували для гомологічної рекомбінації для вставки гена NadA, плазміду 3-11 сконструювали з елементами, як описано в таблиці 8, і послідовність можна знайти в SEQ ID NO:8. Таблиця 8 Координати (нуклеотиди ##) 1-191 192-197 198-212 Елемент *) pUC19 Ділянка Sac I (унікальна) Послідовність для накопичення 5'-NCR NspA 213-1248 Ділянка Bam H I 1249-1254 R Ген Gent Sac II (унікальна) Промотор porА (модифікований)** Ділянка Nde I (унікальна) Лідерний пептид NadA (алель 3) 1255-2104 2105-2110 (44-76) 2111-3266 3267-3272 3270-3338 20 16 Джерело New England Biolabs (NEB) Ділянка клонування pUC19 Конструкт ПЛР N. mening., 44-76, конструкт ПЛР Ділянка клонування гена R Gent R Конструкт ПЛР гена Gent Конструкт ПЛР N. mening., 44-76, конструкт ПЛР Конструкт ПЛР N. mening., 2996, конструкт ПЛР UA 99659 C2 Продовження таблиці 8 Елемент Координати (нуклеотиди ##) ORF зі стоп-кодоном NadA (алель 3) 3339-4487 Ділянка SgrAI (унікальна) 4488-4495 Термінатор porА (44-76) 4496-4910 Bsml 3' NspA NCR Послідовність для накопичення Hind III pUC19 5 10 15 20 25 30 35 40 4911-4916 4917-5329 5330-5344 5345-5350 5351-7584 кінець Джерело N. mening., 2996, конструкт ПЛР N. mening., 44-76, конструкт ПЛР N. mening., 44-76, конструкт ПЛР Конструкт ПЛР N. mening., конструкт ПЛР Конструкт ПЛР Ділянка клонування pUC19 R NEB (Amp ) *) Старт від нуклеотиду 1 pUC 19. Плазміду модифікували для видалення ділянки Nde I для наступного зручного клонування наступним чином: її розщеплювали Nde I-EcoR I і видаляли фрагмент 213 п.о. Липкі кінці заповнювали і лігували для відновлення плазміди. В результаті ділянки Nde I (183) і EcoRI (395) були знищені. Для клонування конструкцій для експресії цільового білка автори даного винаходу використовували ділянки клонування Sac I і Hind III з pUC 19. **) Ділянка полі G з 14G промотору 44-76 модифікували заміною оптимальними для експресії 11 G. Крім того, експресію ОрсА стабілізували виправленням фазової мінливості, пов'язаної з його геном. Це виконано, як описане для штаму 8570 HOPS-G1, за допомогою переривання полі-G ділянки в її промоторі в прикладі 1. Ген lgtA переривали, як в прикладі 1, одержуючи усічений LOS. Фазовий варіант одержаного штаму, що експресує імунотип L8, відбирали блотингом колоній за допомогою специфічних для L8 моноклональних антитіл. Цей генетично модифікований штам визначили 44/76 HOPS-D, як показано на фігурі 18. Два додаткові штами охарактеризували для підтвердження стабільності всіх генетичних модифікацій, і культури кожного для зберігання заморозили. Приклад 10: Одержання NOMV вакцини зі штамів В16В6 HPS-G2 і 44/76 HOPS-D. Три генетично модифіковані штами використовували для одержання лабораторних партій композицій вакцин NOMV. Штами вирощували в модифікованому середовищі Кетліна у вигляді культур по одному літру в колбах Фернбаха з обертанням і гойданням. Клітини збирали центрифугуванням, зважували, і клітинну масу заморожували. Клітинну масу відтавали і використовували для одержання NOMV, дотримуючись в основному такого ж способу, як описано для клінічної партії вакцини зі штаму 8570 HOPS-G1, як описано в прикладі 2. Процес доводили до меншого масштабу і ультрацентрифугування проводили двічі при 225000g протягом 60 хв при 2-8°С для видалення нуклеїнових кислот і всього розчинного матеріалу, що не належить до везикул. Приклад 11: Імунізація мишей повною мультивалентною вакциною Групи з десяти мишей CD-1 вакцинували внутрішньочеревинно двома пг вакцини NOMV з кожного генетично модифікованого вакцинного штаму (всього 6 пг для комбінованої вакцини з NOMV з трьох штамів). Три дози вводили на 0, 4 і 8 тижні. Кров відбирали перед вакцинацією і через 2 тижні після останньої вакцинації (на 10 тижнів). Сироватку від індивідуальних мишей тестували на бактерицидні антитіла проти гомологічних штамів, і об'єднану сироватку від кожної групи з 10 мишей тестували проти панелі з 14 гетерологічних штамів групи В і штаму групи 1 C, що експресують широкий діапазон різних субкапсульних антигенів. Комбінована мультивалентна вакцина індукувала титр з середнім геометричним 1:256 проти кожного з трьох вакцинних штамів і 4-кратним або більшим збільшенням кількості бактерицидних антитіл проти 13 з 15 гетерологічних штамів. Два з тестованих штамів не піддавалися знищенню, незважаючи на наявність антигену, загального з одним з вакцинних штамів. Бактерицидні титри, що спостерігаються, проти панелі штамів наведені в таблиці 9. 17 UA 99659 C2 Таблиця 9 Бактерицидні титри об'єднаної сироватки мишей проти різноманітної панелі тестованих штамів Тестований на бактерицидність штам 44/76 8570 816136 9162 M1080 3576 8047 9547 531 7608 6940 1901 99M 6275 126E 2981 M4720 6557 5 10 15 20 Титр об'єднаної сироватки від мишей, вакцинованих вказаною вакциною В1+В2+В3 В2+В3 B1 В2 В3 256 256 256 25 6 1 256 256 256 256 2 256 256 1 1 25 6 16 16 8 2 1 2 1 1 1 1 128 128 4 2 16 64 128 1 1 12 8 256 256 128 2 64 256 256 256 1 25 6 256 128 1 1 12 8 4 4 1 1 1 256 32 128 1 8 512 512 16 8 25 6 512 32 1 512 256 256 4 2 64 32 8 4 64 2 1 1 1 1 1 32 16 1 32 16 Експресовані антигени B:15:P1.7.16:P5.11,C:L3.7 B:4:P1.19,15:P5.5:L3,7v B:2a:P1.5,2:P5.1a:L2 B:15:P1.7-2,3 :P5.10,11:L3,7* B:1,19:P1.1:P5.3:L1,3,7 B:NT:P1.22-1:L3,7 B:2b:P1.5,2:L3,4,7 B:4:P1.4:L1 B:2a:P1.5,2:P5.1a, b,4,5:L3,7 B:2b:P1.5,2:P5.2,c:L4 B:8,19:P1.NT:L1 B:8,19:P1.NT:P5.C:L1,3,7 B:2a:P1.2:P5.1a,1b,5:L3,7 B:2a:P1.2:P5.1a,4,5:L3,7 C:8,19:P1.5,2:L1:P5.C B:8,19:P1.14:L1 B:19:P1.22,14:L2 B:17:P1.14:L1(3,7) Позначення вакцин: В1=44/76 HOPS-D NOMV B2=8570 HOS-G1 NOMV В3=В16В6 HPS-G2 NOMV Ці результати показують здатність комбінованої вакцини індукувати бактерицидні (захисні) антитіла проти широкого діапазону штамів групи В і, потенційно, також проти штамів інших серогруп. Аналізом бактерицидних антитіл з використанням бактерицидного виснаження показали, що антитіла проти всіх трьох наборів антигенів залучені до знищення щонайменше деяких з тестованих штамів. У деяких випадках, очевидно, антитіла проти більше ніж одного антигену були залучені і діяли спільно для одержання бактерицидної активності проти даного штаму. Додаткові групи мишей вакцинували вакциною NOMV, одержаною з ізогенних мутантів штаму 8570 HOPS-G1. Мутантні штами відрізнялися за експресією porA. Два мутанти експресували один porA (один або інший з двох в мультивалентному вакцинному штамі), і третій являв собою мутант з нокаутом PorA, не що експресує білка porA. Бактерицидні титри, що індукуються кожним з чотирьох штамів проти декількох різних тестованих штамів, показані в таблиці 10. Таблиця 10 Тестований штам 8570 44/76 В16В6 3576 9547 2981 6557 Мутант 8570 HOPS-G1, з якого одержана вакцина NOMV 8570 (P1.19,15 і P1.22,141) 8570 (P1.19,15) 8570 (Р1.22,14) 8570 АPorA 256 256 256 256 256 256 256 256 1 1 1 1 2 8 8 8 2 4 4 2 64 1 16 1 32 1 128 1 18 UA 99659 C2 5 10 Для перших п'яти тестованих штамів в таблиці 10 експресія porA не надавала ефекту на титр бактерицидних антитіл, індукованих вакциною. Для останніх двох штамів, які обидва експресували P1.14, присутність епітопу P1.14 у вакцині корелювала зі здатністю відповідної сироватки знищувати штам. Це показує, що антитіла проти porA залучені до знищення, що спостерігається, деяких штамів. Для інших штамів, таких як гомологічний штам і штам 44/76, інші антигени є відповідальними за більшу частину бактерицидної активності. Це показано аналізом з дослідженням бактерицидного виснаження. Результати одного такого аналізу наведені на фігурі 16. Результати, показані на фігурі 17, показують, що антитіла проти LOS і FHBP (GNA1870) були залучені до знищення штаму 8570 антисироваткою проти мутанта з нокаутом porA 8570 HOPS-G1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1. Вакцина, що містить нативні везикули зовнішньої мембрани (NOMV), одержані щонайменше з двох штамів менінгококів, які були генетично модифіковані для широкого спектра захисту, де нативні везикули зовнішньої мембрани включають три різних набори антигенів на основі PorА, LOS і консервативних білків зовнішньої мембрани; де генетично модифіковані штами були модифіковані для посилення безпеки шляхом інактивації генів ipxL1, synX і lgtA; і де щонайменше один генетично модифікований штам експресує щонайменше два різних підтипи білків або підтипи епітопів РоrА. 2. Вакцина за п. 1, де LOS, експресований кожним штамом, має відмінну корову структуру LOS і має альфа-ланцюг, що складається з глюкози і галактози. 3. Вакцина за п. 1, де кожний підтип білків або підтип епітопів РоrА містить щонайменше один, найбільш переважний підтип РоrА з ізолятів групи В. 4. Вакцина за п. 1, де в кожному штамі надекспресований інший консервативний поверхневий білок з відомою здатністю індукувати бактерицидні антитіла, і він вибраний з групи, що складається з варіанта 1 FHBP, варіанта 2 FHBP і варіанта 3 FHBP; NadA; App; NspA; TbpA і TbpB. 5. Комбінація NOMV трьох генетично модифікованих штамів Neisseria meningitidis з антигенною мінливістю, де щонайменше один із штамів вибраний з: (1) штаму Н44/76 HOPS-DL з наступними генетичними модифікаціями або характеристиками: інактивацією генів synX, lpxL1 і lgtA; інсерцією другого гена роrА (підтип Р1.7-1,1) замість opaD; підвищеною експресією NadA; і стабільною високою експресією Орc і РоrА; (2) штаму 8570 HOPS-GAL з наступними генетичними модифікаціями або характеристиками: інактивацією генів synX, lpxL1 і lgtA; інсерцією другого гена РоrА замість opaD; підвищеною експресією варіанта 1 білка, що зв'язує фактор Н; і стабільною високою експресією РоrА і Орc; і (3) штаму В16В6 HPS-G2A з наступними генетичними модифікаціями або характеристиками: інактивацією генів synX, lpxL1 і lgtA; інсерцією другого гена роrА замість opaD; підвищеною експресією варіанта 2 білка, що зв'язує фактор Н; і стабільною високою експресією Роr А і Орc. 6. Комбінація вакцинних штамів за п. 5, де штам Н44/76 HOPS-DL одержаний із штаму дикого типу ET-5 Н44/76 (В:15: Р1.7,16: L, 3,7:Р5.5, С). 7. Комбінація вакцинних штамів за п. 5, де штам 8570 HOPS-G1L одержаний із штаму дикого типу ET-5 8570 (В:4: Р1.19,15: L3,7v: Р5.5,11, С). 8. Комбінація вакцинних штамів за п. 5, де штам В16В6 HPS-G2L одержаний із штаму дикого типу ET-37 В16В6 (В:2а:Р 1.5,2: L2:P5.1,2,5). 9. Вакцина за п. 1, де NOMV одержані без обробки детергентом або денатуруючими розчинниками з клітинної маси або виснаженого культурального середовища. 10. Вакцина за п. 1, де вакцину суспендують в 5 %-ій глюкозі, що використовується як наповнювач. 11. Вакцина за п. 1, де NOMV комбінують з одним або декількома ад'ювантами, наприклад гідроксидом алюмінію або фосфатом алюмінію, MF 59, CPG-ODN або MPLA. 12. Вакцина за п. 1, де композиція проти менінгококової інфекції містить нативні везикули зовнішньої мембрани менінгококів (NOMV) одного або декількох генетично модифікованих 19 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 штамів Neisseria meningitidis, де один або декілька генетично модифікованих штамів модифіковані шляхом: і) інактивації гена synX, іі) інактивації гена lpxL1, ііі) інактивації гена lgtA в кожному штамі, що призводить до експресії укорочених або усічених ліпоолігосахаридів (LOS) без тетрасахариду лакто-N-неотетраози, і iv) інсерції щонайменше одного другого гена роrА, який відрізняється антигенними властивостями, замість гена opa. 13. Вакцина за п. 12, де генетично модифікований штам додатково стабільно експресує щонайменше один мінорний консервативний білок зовнішньої мембрани або його експресія підвищена. 14. Вакцина за п. 12, де генетично модифікований штам додатково стабільно експресує щонайменше один білок зовнішньої мембрани, де білок зовнішньої мембрани вибраний з групи, що містить Орc і РоrА. 15. Вакцина за п. 12, де щонайменше один другий ген роrА, який відрізняється антигенними властивостями, експресує щонайменше один підтип білка або підтип епітопа РоrА, вибраний з поширених підтипів РоrА ізолятів Meningitidis групи В. 16. Вакцина за п. 13, де щонайменше один мінорний консервативний білок зовнішньої мембрани вибраний з групи, що складається з: варіантів 1 FHBP (GNA 1870), варіанта 2 FHBP, варіанта 3 FHBP; NadA; App, NspA, TbpA і В. 17. Вакцина за п. 1, де вакцина містить генетично модифікований вакцинний штам із штаму Neisseria meningitidis підтипу В, включаючи штам Н44/76 HOPS-D. 18. Вакцина за п. 17, де вакцина містить генетично модифікований вакцинний штам Neisseria meningitidis підтипу В, одержаний із штаму Н44/76, який містить наступні генетичні модифікації: і) ген synX інактивований, іі) ген lрхL1 інактивований, ііі) ген lgtA інактивований, iv) проведена інсерція другого гена роrА замість гена opaD, v) підвищена експресія NadA в порівнянні з нативним штамом, і vi) відмічається стабільна підвищена експресія білків Орc і РоrА. 19. Вакцина за п. 17, де генетично модифікований штам Н44/76 HOPS-DL одержаний із штаму дикого типу ET-5 Н44/76 (В:15: P1.7,16: L, 3,7:Р5.5, С). 20. Вакцина за п. 1, де вакцина містить генетично модифікований вакцинний штам Neisseria meningitidis підтипу В, включаючи штам 8570 HOS-G1. 21. Вакцина за п. 20, де генетично модифікований вакцинний штам Neisseria meningitidis підтипу В одержаний з 8570, який містить наступні генетичні модифікації: і) ген synX інактивований, іі) ген lpxL1 інактивований, ііі) ген lgtA інактивований, iv) проведена інсерція другого гена роrА замість opaD; v) підвищена експресія варіанта 1 білка, що зв'язує фактор Н; і vi) відмічається стабільна підвищена експресія білків РоrА і Орc. 22. Вакцина за п. 20, де генетично модифікований штам одержаний із штаму дикого типу ET-5 8570 (В:4: Р 1.19,15: L3,7v: Р5.5,11 С). 23. Вакцина за п. 1, де вакцина містить генетично модифікований вакцинний штам Neisseria meningitidis підтипу В, включаючи штам В16В6 HPS-G2A. 24. Вакцина за п. 23, де генетично модифікований вакцинний штам Neisseria meningitidis підтипу В одержаний з В16В6, який містить наступні генетичні модифікації: і) ген synX інактивований, іі) ген lpxL1 інактивований, ііі) ген lgtA інактивований, iv) проведена інсерція другого гена роrА (підтип Р1.22-1,4) замість opaD; v) підвищена експресія варіанта 2 білка, що зв'язує фактор Н; і vi) відмічається стабільна підвищена експресія білків РоrА і Орc. 25. Вакцина за п. 23, де генетично модифікований штам одержаний із штаму дикого типу ET-37 В16В6 (В:2а:Р 1.5,2: L2:P5.1,2,5). 26. Вакцина за будь-яким з пп. 17-25, де штам вирощують на середовищі з дефіцитом заліза. 27. Вакцина за будь-яким з пп. 17-25, де інактивацію гена synX, гена lpxL1 або гена lgtA здійснюють за допомогою вставки гена стійкості до лікарського засобу в послідовність інактивованого гена. 20 UA 99659 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 28. Композиція вакцини, що містить NOMV з одного або декількох генетично модифікованих штамів Neisseria meningitides, вибраний з групи, яка складається з: а) генетично модифікованого вакцинного штаму Neisseria meningitidis підтипу В, одержаного із штаму Н44/76, який містить наступні генетичні модифікації: і) ген synX інактивований, іі) ген lpxL1 інактивований, ііі) ген lgtA інактивований, iv) вбудований другий ген роrА замість гена opaD; v) підвищена експресія NadA в порівнянні з природним штамом, і vi) стабілізована підвищена експресія білків Орc і РоrА; b) генетично модифікованого вакцинного штаму Neisseria meningitidis підтипу В, одержаного із 8570, який містить наступні генетичні модифікації: і) ген synX інактивований, іі) ген lpxL1 інактивований, ііі) ген lgtA інактивований, iv) вбудований другий ген роrА (підтип Р1.22-1,4) замість гена opaD; v) підвищена експресія варіанта 2 білка, що зв'язує фактор Н; і vi) стабілізована підвищена експресія білків РоrА і Орc; і c) генетично модифікованого вакцинного штаму Neisseria meningitidis підтипу В, одержаного з В16В6, який містить наступні генетичні модифікації: і) ген synX інактивований, іі) ген lpxL1 інактивований, ііі) ген lgtA інактивований, iv) проведена інсерція другого гена роrА (підтип Р1.22-1,4) замість opaD; v) підвищена експресія варіанта 2 білка, що зв'язує фактор Н; і vi) відмічається стабільна підвищена експресія білків РоrА і Орc. 29. Композиція вакцини за п. 28, де композиція вакцини містить NOMV з двох або більше генетично модифікованих штамів. 30. Композиція вакцини за п. 28, де композиція вакцини містить NOMV з трьох або більше генетично модифікованих штамів. 31. Композиція вакцини за будь-яким з пп. 1-4 і 9-30, де NOMV одержують з клітинної маси або з виснаженого культурального середовища без обробки детергентом або денатуруючим розчинником. 32. Композиція вакцини за будь-яким з пп. 1-4 і 9-30, де композицію вакцини суспендують в 5 %ій глюкозі, що використовується як наповнювач. 33. Композиція вакцини за будь-яким з пп. 1-4 і 9-30, де NOMV комбінують з одним або декількома ад'ювантами. 34. Композиція вакцини за будь-яким з пп. 1-4 і 9-30, де генетично змінений штам модифікований так, що експресує білки накопичення заліза. 35. Спосіб стимуляції імунної відповіді на менінгококову інфекцію у тварини або людини, що включає введення композиції за будь-яким з пп. 1-4 і 9-30 тварині або людині для імунізації проти менінгококової інфекції. 36. Спосіб за п. 35, де вакцину використовують для імунізації проти інфекції, що викликається менінгококами групи В. 37. Спосіб за п. 35, де вакцину вводять внутрішньом'язово і/або інтраназально для імунізації проти менінгококової інфекції. 21 UA 99659 C2 22 UA 99659 C2 23 UA 99659 C2 24 UA 99659 C2 25 UA 99659 C2 26 UA 99659 C2 27 UA 99659 C2 28