Вектор та послідовність для лікування мукополісахаридозів

Реферат: Винахід стосується нуклеотидної послідовності, генного конструкту, вектора та фармацевтичної композиції для лікування мукополісахаридозів. UA 112841 C2 (12) UA 112841 C2 UA 112841 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Представлений винахід стосується векторів, придатних для експресії протеїнів, що представляють інтерес, та їх застосування в генній терапії. Представлений винахід, крім того, стосується векторів та послідовностей нуклеїнових кислот корисних для лікування мукополісахаридозів (MPS), та, зокрема, для лікування мукополісахаридозів типу III або синдрому Санфіліппо. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Лізосома є органелою, знайденою в цитоплазмі еукаріотичних клітин, які використовують як вмістилище багатьох гідролітичних ферментів та як центр розкладання та рециклінгу клітинних компонентів. Дана органела містить декілька типів гідролітичних ферментів, включаючи протеази, нуклеази, глікозидази, ліпази, фосфоліпази, фосфатази та сульфатази. Всі ферменти є кислотними гідролазами. Лізосомні захворювання накопичення (LSD) викликаються генетичними дефектами, що вражають один або більше лізосомальних ферментів. Дані генетичні захворювання в результаті призводять, як правило, до дефіциту зокрема активності ферменту присутнього в ліпосомі. У меншій мірі, дані захворювання можуть бути результатом недостачі протеїнів, які є включеними в лізосомальний біогенез. LSD є особливо рідкісними, не зважаючи на те, що як група дані розлади є досить поширеними серед населення в цілому. Сукупна поширеність LSD становить приблизно 1 на 5000 живонароджених дітей. Дивись Meikle P, et al, JAMA 1999; 281: 249-254. Незважаючи на це, деякі групи населення в цілому особливо страждають від високого рівня виникнення LSD. Наприклад, показники поширеності захворювання Гоше та Тея-Сакса у нащадків від єврейських індивідуумів Центральної та Східної Європи (ашкеназі) складає 1 на 600 та 1 на 3900 новонароджених, відповідно. Фінське населення також страждає від незвичайно високого рівня поширеності LSD. Тип III мукополісахаридозів (MPSIII), відомих в загальному значенні як синдром Санфіліппо, є LSD викликаним дефіцитом одного з ферментів, які приймають участь в розкладанні сульфату гепарину, що призводить до його патологічного накопичення. MPSIII розділяють на чотири підтипи в залежності від ферментного дефіциту. Втрата активності сульфамідази викликає підтип IIIA та, як доповідалось, є найбільш важким, з найбільш раннім початком захворювання та найкоротшою тривалістю життя. Симптоми MPSIIIA виникають на першому році життя та характеризуються важкою нейродегенерацією, яка призводить до глибокої затримки розумового розвитку, агресивності, гіперактивності та розладів сну. Пацієнти поступово втрачають здатність розмовляти, ковтати та основну моторну координацію. В доповнення до неврологічних симптомів пацієнти з MPSIIIA страждають на не-неврологічні порушення, включаючи гепато- та спленомегалію, скелетні та суглобні деформації, а також часті діарею та інфекції дихальних шляхів. Поступове погіршення симптомів в результаті призводить до смерті пацієнта в підлітковому віці. Дивись Neufeld E, Muenzer J, "The mucopolysaccharidoses" in Scriver C, et al., Eds., "The metabolic and molecular basis of inherited disease" (McGraw-Hill Publishing Co., New York, NY, US, 2001, pp. 3421 -3452). На даний момент не існує лікування для MPSIIIA, по цій причині, існуючі методи лікування націлені на контролювання симптомів захворювання для того, щоб покращити низьку якість життя пацієнтів. MPS розлади можуть лікуватися шляхом трансплантації кісткового мозку або застосовуючи ферментзамісну терапію (ERT). Обидва підходи ґрунтуються на ендоцитозі лізосомальних ферментів з позаклітинного середовища та їх націлювання на лізосоми через рецептор маноза-6-фосфат (M6PR), присутній на клітинній мембрані. Однак, показано, що трансплантація кісткового мозку є неефективною при лікуванні пацієнтів з MPSIII. Дивись Sivakamur P, Wraith J, J. Inherit. Metab. Dis. 1999; 22:849-850. В значній мірі доведено, що ERT є ефективним в протидії не-неврологічному накопиченні при інших захворюваннях лізосомного накопичення, включаючи MPSI, II та VI. Дивись Harmatz P, et al., J. Mol. Genet. Metab. 2008; 94:469-475; Muenzer J, et al., Genet. Med. 2006; 8:465-473 and Wraith J, et al., J. Pediatr. 2004; 144:581-588. На додаток до високої вартості даного лікування, показано, що ERT не призводить в результаті до коректування або попередження нейронної функції, що обумовлено недостатньою поставкою екзогенно передбачуваного ферменту через гематоенцефалічний бар’єр (ГЕБ). Дивись Enns G, Huhn S, Neurosurg. Focus 2008; 24:E12. Зовсім недавно, показано, що високо-дозована ERT є частково успішною в очистці ЦНС вмістилищ при MPS VII, можливо завдяки насиченню M6PR та рецепторів занози, що призводить до більш довгого періоду напіврозпаду протеїну при циркуляції. Дивись Vogler C, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005; 102:14777-14782. Дане дослідження демонструє, що високі рівні ферментів при циркуляції в кровообігу протягом довгих періодів часу корелюють з кращим корегуванням патології. 1 UA 112841 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Внутрішньомозкова та внутрішньо-CSF доставка ферменту, як було доведено, є, крім того, ефективною в з зниженні ЦНС патології у мишей з MPS IIIA. Дивись Hemsley K, et al., Genes Brain Behav. 2008; 53(2):161-8 and Savas P, et al., Mol. Genet. Metab. 2004; 82:273-285. Однак, даний підхід є високо інвазивним завдяки необхідності багаторазового повторення введення ін’єкцій та могло б підвищити ризик пошкодження та/або інфекційного зараження в мозку. Встановленні обмеження поточних терапевтичних варіантів для MPSIII зумовлюють необхідність альтернативних підходів. Перенос генів міг би забезпечити можливість досягати постійне продукування відсутнього ферменту з одноразового втручання. Адено-асоційовані вектори (AAV) є швидко виникаючими, як вектор відбору для багатьох застосувань генної терапії, завдяки високій ефективності їх трансдукції та відсутності їх патогенності. AAV вектори ефективно перетворюють постмітотичні клітини, та деякі доклінічні та клінічні випробування продемонстрували потенційний AAV вектор-опосередкований генний перенос до ефективно керованої стабільної експресії терапевтичних трансгенів для різноманітних захворювань. Дивись Daya S, Berns K, Clin. Microbiol. Rev. 2008; 21: 583-593. Показано, що введення AAV5 вектору спів-експресування активатору SUMF1 сульфамідази та сульфатази в латеральні шлуночки новонароджених мишей з MPSIIIA має здатність корегувати багато неврологічних та поведінкових змін. Дивись Fraldi A, et al., Hum. Mol. Genet. 2007; 16:2693-2702. Однак, даний запропонований напрямок лікування має декілька недоліків. По-перше, CMV промотор, як доповідалось, застосовували за замовчуванням. По-друге, довго тривалі ефекти спів-експресії сульфамідази та SUMF1 ще не були оцінені. Не є очевидним, що спів-експресія SUMF є навіть необхідною та забезпечує будь-які додаткові довготривалі ефекти в порівнянні з лікуванням тільки сульфамідазою. По-третє, AAV5 вектори мають низький внесок в паренхіму, та більш важливо, доставка сульфамідази в мозок шляхом застосування даних векторів не призводить в результаті до будь-якої трансдукції церебральної тканини, таким чином, ніякого корегування соматичного фенотипу не досягається шляхом наступного даного підходу. На завершення, Fraldi, 2007, зазначене вище продемонструвало ефективність генного переносу тільки у новонароджених мишей з MPSIIIA. Про експерименти на більш старших мишах не доповідалось. Як наслідок MPSIIIA, як правило, діагностують у віці після 3-4 років, моделі на новонароджених тваринах не є такими, що відповідають вимогам для прогнозування ефектів від лікування, що будуть проявлятися у людини. У зв'язку з труднощами діагностики MPSIIIA при народженні, було запропоновано розробку терапевтичних заходів, починаючи зі старшого підліткового віку. Повідомлялось, що внутрішньовенна доставка лентивірусних векторів, які експресують сульфамідазу у дорослих мишей, призвела в результаті до незначного покращення фенотипу ЦНС, ймовірно, це пов'язано з відносно низькою продуктивністю трансдукції даних векторів in vivo. Дивись Mclntyre C, et al., Mol. Genet. Metab. 2008; 93:41 1-418. Таким чином, застосування вірусних векторів з більш високою ефективністю трансдукції in vivo, таких як AAV вектори, може забезпечити більш високі рівні сульфамідази, що циркулюють, які могли б потенційно покращити або скорегувати неврологічну патологію. Лікування MPSIIIA шляхом генної терапії вимагає більш ефективні вектори та сульфамід азу, що кодує послідовності. Таким чином, давно існує необхідність ефективного лікування MPSIIIA. Крім того, існує необхідність в нових підходах до лікування даного захворювання, яке матиме покращені властивості з точки зору безпеки. MPSIIIA є рідкісним захворюванням і тому є орфанним захворюванням. Фармацевтичні засоби розроблені спеціально для лікування даного рідкісного медичного стану будуть орфанними лікарськими засобами. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Представлений винахід передбачає нову нуклеотидну послідовність для лікування захворювань, переважно для лікування мукополісахаридозів (MPS). Таким чином, перший аспект винаходу стосується нуклеотидної послідовності, яка є кодоном оптимізованої послідовності сульфамідази людини, що передбачає транскрипцію більш стабільної мРНК. Дану послідовність транскрибують на більш високих швидкостях, та тому одержують більш високі виходи ферменту сульфамідази. Послідовність демонструє кращий профіль експресії та є більш терапевтично ефективною ніж інші спроби оптимізації кодону нуклеотидної послідовності сульфамідази. Дані підвищені рівні в експресії ферменту супроводжуються підвищенням активності сироваткової сульфамідази, забезпечуючи зниження накопичення гліокосаміноглікану (GAG), який викликає захворювання. Згаданою послідовністю є SEQ ID NO: 1 або послідовність, яка має, щонайменше 85% ідентичності послідовності до SEQ ID NO: 1, що кодує протеїнову SEQ ID NO: 2. В другому аспекті винахід стосується конструкту гена, яка включає нуклеотидну послідовність за першим аспектом винаходу. 2 UA 112841 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Представлений винахід, крім того, передбачає нові AAV вектори з серотипом 9, який є здатним до проходження через гематоенцефалічний бар’єр (ГЕБ) та демонструє більший тропізм для різних структур мозку. Це передбачає, що активність сульфамідази буде зростати зокрема в мозку, знижуючи накопичення GAG та, таким чином, покращуючи неврологічні симптоми при MPS. AAV серотип 9 демонструє, крім того, неочікувано високий тропізм для серця, підшлункової залози та м’язової тканини, таким чином, потенціюючи скрізь терапевтичні переваги винаходу. Наприклад, після введення векторів AAV серотипів 8 та 9 (AAV8 та AAV9) дорослим мишам з MPSIIIA шляхом внутрішньовенної (iv) ін’єкції, до мішені печінки, або шляхом внутрішньом’язової (im) ін’єкції, до мішені скелетного м’язу, або інтрацистернально (ic), до мішені центральної нервової системи, рівні експресії сульфамідази, що досягалися шляхом imвекторної доставки, не були терапевтичними. Інтрацистернальне введення здатне не тільки підвищити рівень циркулюючої сульфамідази, але й також повернути до вихідного стану соматичний фенотип MPSIIIA в деяких типах тканини, в тому числі тканину мозку. Підхід спрямований на печінку також давав змогу одержувати високі рівні активності сульфамідази, що циркулює, яка неочикувано корегувала соматичний фенотип накопичення при MPSIIIA при повній та значно пов’язаній зі захворюванням невропатології. Дані результати забезпечують доказ ефективності AAV- опосередкованого генного переносу сульфамідази у дорослих мишей з MPSIIIA, близьку схожість моделі захворювання з клінічними проявами у людини. Винахідникам вдалося відкоригувати як соматичні, так і неврологічні зміни при MPSIIIA. Конструкти генів за представленим винаходом можуть, крім того, включати відповідні промотори, такі як CAG або hAAT промотори, щоб контролювати та потенціювати експресію сульфамідази. Наприклад, CAG промотор є більш стабільним, ніж CMV промотор, та є, таким чином, більш прийнятним для індукування експресії сульфамідази протягом довших періодів часу. З іншого боку, безпечність та ефективність hAAT промотору робить його ідеальним носієм для доставки з наступним спостереженням або підтриманням доз сульфамідази. Контроль експресії SEQ ID NO: 1 за допомогою CAG або hAAT промоторів, в значній мірі, потенціював його терапевтичні ефекти. Крім того, AAV вектори представленого винаходу підвищують активність сульфамідази, яка знижує накопичення GAG та покращує клінічний результати індивідуумів, що страждають на MPS. Тільки одне введення може бути достатнім, тому що промотор та нуклеотидна послідовність сульфамідази, розташована між зворотними термінальними повторюваннями (ITR), є включеними в геном клітин індивідууму. В наслідок цього, одне парентеральне введення є достатнім, щоб одержати довготривалий ефект. В третьому аспекті, винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить нуклеотидну послідовність з першого аспекту винаходу, генний конструкт або вектор експресії за винаходом. В четвертому аспекті, винахід стосується нуклеотидної послідовності, генного конструкту, вектору експресії або фармацевтичної композиції за винаходом для застосування як лікарського засобу. Лікарський засіб можуть застосовувати для підвищення активності сульфамідази в організмі, для фермент замісної терапії, для генної терапії або для лікування MPS. В п’ятому аспекті, винахід стосується способу одержання векторів експресії з першого та другого аспектів винаходу. В шостому аспекті, винахід стосується способу виробництва фармацевтичних композицій з третього аспекту винаходу. В сьомому аспекті, винахід стосується способу лікування суб’єкту, що має мукополісахаридоз типу IIIA з першим, другим та третім аспектами винаходу. Представлений винахід, крім того, стосується застосування нуклеотидної послідовності, генного конструкту, вектору експресії або фармацевтичних композицій за винаходом при виробництві лікарського засобу для підвищення активності сульфамідази в організмі, для фермент замісної терапії, для генної терапії або для лікування мукополісахаридозів або мукополісахаридозу типу IIIA. Короткий опис креслень Фігура 1. Внутрішньом’язова доставка AAV1-CAG-mu-SFMD-WPRE. (A) Активність сульфамідази в скелетному м’язі контролю, MPS та оброблених мишей. (B) Активність сульфамідази в сироватці контролю, MPS та оброблених мишей. (C) Визначення кількості глікозаміноглікану (GAG) в печінці контролю, MPS та оброблених мишей. Значення є середніми ± SEM від 4 до 8 мишей в групі. ¥ P