Антитіло, яке специфічно зв’язує людський альфа5бета1 (alpha5beta1)
Номер патенту: 100969
Опубліковано: 25.02.2013
Автори: Чунтхарапай Анан, Тесс'є-Лавін Марк, У Янь, Плауман Грег, Е Вейлань
Формула / Реферат
1. Антитіло, що може зв'язувати людський альфа5бета1, причому антитіло включає варіабельний домен легкого ланцюга та варіабельний домен важкого ланцюга, що містять шість ділянок, які визначають комплементарність ("CDR"), анти-альфа5бета1 антитіла, продукованого гібридомою, вибраною із групи, що складається з гібридоми, депонованої як ATCC № РТА-7421, і гібридоми, депонованої як ATCC № РТА-7420 в ATCC 7 березня, 2006.
2. Антитіло за пунктом 1, причому антитіло включає послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (VH) та послідовність варіабельного домену легкого ланцюга (VL) антитіла, що продукується гібридомою, депонованою як ATCC № РТА-7421 в ATCC 7 березня, 2006.
3. Антитіло за пунктом 1, причому антитіло включає послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (VH) та послідовність варіабельного домену легкого ланцюга (VL) антитіла, що продукується гібридомою, депонованою як ATCC № РТА-7420 в ATCC 7 березня, 2006.
4. Антитіло за пунктом 1, причому антитіло є гуманізованим або химерним антитілом.
5. Антитіло за пунктом 1, причому антитіло включає Fc послідовність людського IgG.
6. Антитіло за пунктом 5, причому людський IgG являє собою IgG1 або IgG4.
7. Антитіло за пунктом 5 або 6, причому антитіло включає Fc послідовність, що не має ефекторної функції антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ADCC).
8. Антитіло за пунктом 1, причому антитіло вибране із групи, що складаєтьсяіз Fab, Fab', F(ab)'2, одноланцюгового Fv (scFv), Fv фрагмента; діатіла і лінійного антитіла.
9. Антитіло за пунктом 1, причому антитіло продукується гібридомою, відібраною із групи, що складається з гібридоми, депонованої як ATCC № РТА-7421, і гібридоми, депонованої як ATCC № РТА-7420 в ATCC 7 березня 2006 р.
10. Антитіло за будь-яким з пунктів 1-9, кон'юговане із терапевтичним агентом.
11. Антитіло за пунктом 10, причому терапевтичний агент вибирають із групи, що складається із цитотоксичного агента, радіоізотопу й хіміотерапевтичного агента.
12. Антитіло за пунктом 11, причому цитотоксичний агент являє собою токсин.
13. Антитіло за будь-яким з пунктів 1-9, кон'юговане з міткою.
14. Антитіло за пунктом 13, причому мітку вибирають із групи, що складається з радіоізотопу, флуоресцентного барвника й ферменту.
15. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельний домен важкого ланцюга (VH) або варіабельний домен легкого ланцюга (VL) або обидва як VH, так і VL домени антитіла за будь-яким із пунктів 1-9.
16. Клітина, що включає молекулу нуклеїнової кислоти за пунктом 15.
17. Клітина за пунктом 16, причому клітина являє собою гібридому, депоновану як ATCC № РТА-7421 або гібридому, депоновану як ATCC № РТА-7420 в ATCC 7 березня 2006 р.
18. Спосіб виявлення альфа5бета1 білка у зразку від пацієнта шляхом контактування антитіла за будь-яким з пунктів 1-9, 13 та 14 зі зразком й виявлення анти-альфа5бета1 антитіла, зв'язаного з альфа5бета1 білком.
19. Спосіб за пунктом 18, причому антитіло використовується у імуногістохімічному випробуванні (IHC) або у випробуванні ELISA.
20. Композиція, що включає антитіло за будь-яким з пунктів 1-14, і фармацевтично прийнятний носій.
21. Композиція за пунктом 20, яка додатково включає VEGF антагоніст.
22. Спосіб інгібування ангіогенезу і/або судинної проникності у суб'єкта, який включає введення суб'єкту антитіла за будь-яким з пунктів 1-12.
23. Спосіб інгібування ангіогенезу і/або судинної проникності у суб'єкта, який страждає від хвороби, що включає введення суб'єкту антитіла за будь-яким з пунктів 1-12 і VEGF антагоніста.
24. Спосіб за пунктом 23, у якому суб'єкт страждає від хвороби, що має патологічний ангіогенез або судинну проникність.
25. Спосіб за пунктом 23 або 24, у якому хворобу вибирають із групи, що складається з пухлини, хвороби очей або аутоімунної хвороби.
26. Спосіб лікування раку у суб'єкта, що включає введення суб'єкту антитіла за будь-яким з пунктів 1-12 і VEGF антагоніста.
27. Спосіб за будь-яким з пунктів 22-26, у якому у суб'єкта відзначаються підвищені рівні альфа5бета1 у хворій тканині в порівнянні із тканиною від суб'єкта, який не страждає від хвороби.
28. Спосіб за будь-яким з пунктів 23-27, у якому суб'єкту вводиться VEGF антагоніст і згодом вводиться анти-альфа5бета1 антитіло.
29. Спосіб за будь-яким з пунктів 23-27, у якому суб'єкту вводиться VEGF антагоніст і анти-альфа5бета1 антитіло одночасно.
30. Спосіб за будь-яким з пунктів 23-27, у якому суб'єкт лікують VEGF антагоністом до відсутності у суб'єкта відповіді на лікування VEGF антагоністом, і після цього суб'єкт лікують анти-альфа5бета1 антитілом.
31. Спосіб за пунктом 26, у якому суб'єкт при неінвазивному раку лікують VEGF антагоністом і при інвазивному раку лікують анти-альфа5бета1 антитілом.
32. Спосіб за будь-яким з пунктів 22-31, у якому суб'єкту додатково вводять терапевтичний агент, вибраний із групи, що складається із антинеопластичного агента, хіміотерапевтичного агента, рістінгібуючого агента і цитотоксичного агента.
33. Спосіб за будь-яким з пунктів 23-32, у якому VEGF антагоніст являє собою анти-VEGF антитіло.
34. Спосіб за пунктом 33, у якому можна конкурентно інгібувати зв'язування анти-VEGF антитіла з людським VEGF за допомогою бевацизумабу.
35. Спосіб за пунктом 33 або 34, у якому анти-VEGF антитіло являє собою гуманізоване або людське антитіло.
36. Спосіб за пунктом 35, у якому анти-VEGF антитіло являє собою бевацизумаб.
37. Спосіб за будь-яким з пунктів 23, 24, 27-30 та 32-36, у якому захворювання вибирають із групи, що складається із солідної пухлини, метастатичної пухлини, пухлини м'яких тканин, хвороби, що має неоваскуляризацію в очах, запальної хвороби, що має патологічний ангіогенез, хвороби, що виникає після трансплантації у суб'єкта, й хвороби, що має патологічну проліферацію фібрoваскулярної тканини.
38. Спосіб за будь-яким з пунктів 25-36, у якому захворювання являє собою рак і рак вибирають із групи, що складається з раку молочної залози, раку шийки матки, колоректального раку, раку легені, неходжкінської лімфоми (НХЛ), нирковоклітинного раку, раку простати, раку печінки, раку голови й шиї, меланоми, раку яєчника, мезотеліоми, раку м'яких тканин і множинної мієломи.
39. Спосіб за будь-яким з пунктів 23, 24, 27-30 та 32-36, у якому захворювання вибирають із групи, що складається з ретинопатії, вікової макулярної дегенерації, рубеозу; псоріазу, псоріатичного артриту, запальної хвороби нирок, гемолітичного уремічного синдрому, діабетичної нефропaтії, артриту, запальної хвороби кишечнику, хронічного запалення, хронічного відшарування сітківки, хронічного увеїту, хронічного вітриту, відторгнення трансплантату рогівки, неоваскуляризації рогівки, неоваскуляризації трансплантату рогівки, хвороби Крона, міопії, офтальмологічної неоваскулярної хвороби, остеоатриту, хвороби Паджета, пемфігоїду, поліартеріїту, післялазерної радіальної кератотомії, неоваскуляризації сітківки, синдрому Шегрена, виразкового коліту, відторгнення трансплантата, запалення легені, нефротичного синдрому, набряку, асцитів, пов'язаних зі злоякісними новоутвореннями, інсульту, ангіофіброми і неоваскулярної глаукоми.
40. Набір для визначення alpha5beta1 у суб'єкта, якого лікували за допомогою VEGF антагоніста, де набір містить
антитіло за будь-яким з пунктів 1-9, 13 та 14; і
інструкції з застосування антитіла для виявлення alpha5beta1 у суб'єкта, якого лікували за допомогою VEGF антагоніста.
Текст
Реферат: Винахід належить до антитіла, яке специфічно зв'язує людський альфа5бета1 (alpha5beta1), продукованого гібридомою, вибраної з групи, яка складається з гібридоми АТСС № РТА-7421 та гібридоми, депонованої як АТСС № РТА-7420. Винахід також належить до молекули нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло, клітини-хазяїна, способу виявлення альфа5бета1 у зразку, композиції, що містить антитіло, способу інгібування ангіогенезу і/або судинної проникності у суб'єкта, способу лікування раку та набору для визначення альфа5бета1 у суб'єкта. UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Даний винахід стосується застосування антагоністів VEGF і антагоністів альфа5бета1 для лікування раку та інгібування ангіогінезу і/або інгібування судинної проникності, включаючи патологічний ангіогінез при хворобах. Даний винахід також стосується застосування агоністів VEGFR і агоністів альфа5бета1 для сприяння ангіогінезу і судинній проникності. Даний винахід також стосується анти-альфа5бета1 антитіл, композицій й наборів, що їх включають, і способів їх отримання й застосування. Передумови створення винаходу Важлива роль VEGF-A при патологічному й непатологічному ангіогінезі добре встановлена. Введення VEGF на моделях in vivo викликає потужну ангіогенну відповідь (Plouet, J et al., (1989) EMBO J. 8:3801-3808; Leung, D.W., et al., (1989) Science 246:1306-1309). Втрата одного алеля VEGF-A провокувала ембріональну смертність у мишей (Carmeliet, P., et al., (1996) Nature 380:435-439; Ferrara, N et al., (1996) Nature 380:439-442). VEGF також відомий як фактор судинної проникності через його здатність викликати судинний витік (Senger, D.R. et al., (1995) Science 219:983-985; Dvorak, H.F., et al., (1995) Am. J. Pathol. 146:1029-1039). Таким чином, VEGF-A залучений у пов'язаний з розвитком, репродуктивний і кістковий ангіогінез на додаток до іншого непатологічного ангіогінезу. VEGF-A зв'язується із двома рецепторними тирозинкіназами (RTK), VEGFR-1 (Flt-1) і VEGFR-2 (KDR, Flk-1). VEGFR-2, як взагалі вважається, є головним медіатором мітогенетичного, ангіогенного і збільшуючого проникність ефектів VEGF-A. У лютому 2004 р. Управління з контролю за якістю харчових продуктів і лікарських засобів США (FDA) схвалило бевацизумаб, гуманізоване анти-VEGF (судинний ендотеліальний фактор росту)-A моноклональне антитіло, для лікування метастатичного колоректального раку в комбінації з режимами хіміотерапії на основі 5-фтороурацилу (FU). Згодом, FDA схвалило пегаптиніб, аптамер, що блокує 165 амінокислотну ізоформуVEGF-A для лікування вологої форми (неваскулярної) форми вікової макулярної дегенерації (AMD). Незважаючи на ці успіхи багато пацієнтів, які отримували лікування антагоністами VEGF, остаточно стають жертвою їхньої хвороби. Отже, існує потреба в розробці нових лікарських засобів й терапій для лікування хвороб, для яких терапія антагоністами VEGF більше не є ефективною або є тільки частково ефективною. Також існує потреба в розробці альтернативних й/або кращих видів терапії для того, щоб лікувати рак і загострення хвороб, викликаних патологічним ангіогінезом або на які він чинить вплив. Короткий опис винаходу Даний винахід стосується лікарських засобів й способів лікування пацієнтів, які отримають користь внаслідок зниження ангіогінезу, які страждають на патологічний ангіогінез і/або які страждають на неоплазію. Відповідно до одного варіанта втілення даний винахід пропонує спосіб для інгібування ангіогінезу і/або судинної проникності у суб'єкта, що включає стадію введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості антагоніста VEGF і антагоніста альфа5бета1 одночасно або послідовно. Відповідно до іншого варіанта втілення, даний винахід пропонує спосіб лікування суб'єкта, який страждає на хворобу, в якому лікування хвороби антагоністом VEGF було ефективним, проте зараз ефективність лікування антагоністом VEGF є частковою або відсутня, що включає стадію введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості антагоніста альфа5бета. Відповідно до іншого варіанта втілення даний винахід пропонує спосіб лікування суб'єкта, який страждає на хвороби, в якому хвороба була резистентною або рефрактерною до терапії антагоністом альфа5бета, окремо або в комбінації з хіміотерапією, що включає стадію введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості антагоніста VEGF. Даний винахід також стосується нових анти-альфа5бета1 антитіл, наборів й композицій, що їх включають, і способів їх отримання або застосування. Відповідно до одного варіанта втілення нове анти-альфа5бета1 антитіло - 7H5 антитіло або 7H12 антитіло, описане авторами, або його гуманізована чи химерна форма. Відповідно до іншого специфічного варіанта втілення 7H5 антитіло або 7H12 антитіло чи його гуманізована або химерна форма може бути у вигляді Fab, Fab", a F(ab)’2, одноланцюгового Fv (scFv), Fv фрагмента; діатіла, мультиспецифічного антитіла й лінійного антитіла. Відповідно до іншого варіанта втілення нові анти-альфа5бета1 антитіла можуть бути кон'юговані з іншим засобом, таким як, крім інших, терапевтичний агент або флуоресцентний барвник або інший маркер, щоб виявляти альфа5бета1 у пацієнтів або у зразках від пацієнтів. Такі нові альфа5бета1 антитіла можуть використовуватися в низці терапевтичних і діагностичних методів. Наприклад, такі анти-альфа5бета1 антитіла можуть використовуватися в лікуванні патологічного ангіогінезу, неоплазій, хвороб очей і аутоімунних хвороб. Такі антитіла можуть використовуватися для виявлення альфа5бета1 білка у пацієнтів 1 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або зразках від пацієнтів шляхом контактування таких антитіл з альфа5бета1 білком у пацієнтів або в зразках від пацієнтів і визначення якісно або кількісно анти-альфа5бета1 антитіла, зв'язаного з альфа5бета1 білком. Згідно із ще одним варіантом втілення даний винахід пропонує спосіб лікування рака у суб'єкта, що включає стадію введення антагоніста VEGF і антагоніста альфа5бета1 одночасно або послідовно. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення рак є сприйнятливим до терапій антагоністом VEGF. В іншому варіанті втілення пропонується спосіб лікування вікової дегенерації сітківки (AMD), включаючи вологу форму вікової макулярної дегенерації, у суб'єкта, який страждає на AMD, що включає стадію введення терапевтично ефективної кількості антагоніста VEGF і антагоніста альфа5бета1 одночасно або послідовно. У ще одному варіанті втілення пропонується спосіб лікування аутоімунної хвороби у суб'єкта, що включає стадію введення терапевтично ефективної кількості антагоніста VEGF і антагоніста альфа5бета1 одночасно або послідовно. В одному варіанті втілення суб'єктові, який буде отримувати лікування, може спочатку вводитись антагоніст VEGF й згодом застосовуватись лікування антагоністом альфа5бета1. В іншому варіанті втіленні, суб'єкт отримує лікування антагоністом VEGF і антагоністом альфа5бета1 одночасно. Відповідно до іншого варіанта втілення суб'єкт отримує лікування антагоністом VEGF доти, доки відповідь суб'єкта на лікування антагоністом VEGF припиняється, і потім суб'єкт отримує лікування антагоністом альфа5бета1. В одному специфічному варіанті втілення суб'єкт отримує лікування антагоністом VEGF при неінвазивному раку або на ранній стадії й суб'єкт отримує лікування антагоністом альфа5бета1 при інвазивному раку. В іншому варіанті втілення суб'єкт, який отримує лікування антагоністом альфа5бета1, має підвищені рівні альфа5бета1 в уражених тканинах в порівнянні із тканиною від суб'єкта, який не страждає на хворобу. У цьому випадку спосіб може додатково включати стадію виявлення альфа5бета1 у суб'єкта, наприклад, в ураженій тканині після лікування антагоністом VEGF. Відповідно до одного варіанта втілення інвазивний рак є метастатичним раком. Відповідно до іншого варіанта втілення рак на ранній стадії є рак, що лікується ад'ювантною терапією (наприклад, хіміотерапією або хірургічним видаленням). В одному оптимальному варіанті втілення суб'єкт страждає на хворобу, що має патологічний ангіогінез. Відповідно до іншого варіанта втілення хвороба відбирається із групи, що складається з раку, імунної хвороби або офтальмологічної хвороби. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення хвороба відбирається із групи, що складається із солідної пухлини, метастатичної пухлини, пухлини м'яких тканин, хвороби, що має неоваскуляризацію в очах, запальної хвороби, що має патологічний ангіогінез, хвороби, що виникає внаслідок трансплантації у суб'єкта, і хвороби, що має патологічну проліферацію фіброваскулярної тканини. Відповідно до іншого оптимального варіанта втілення рак відбирається із групи, що складається з раку молочної залози (включаючи метастатичний рак молочної залози), раку шийки матки, колоректального раку (включаючи метастатичний колоректальний рак), раку легені (включаючи немілкоклітинний рак легені), неходжкінської лімфоми (НХЛ), хронічної лімфоцитарної лейкемії, нирковоклітинного раку, раку простати, включаючи рефрактерний до гормонів рак простати, раку печінки, раку голови й шиї, меланоми, раку яєчників, мезотеліоми, раку м'яких тканин, шлунковокишкової стромальної пухлини, мультиформної гліобластоми і множинної мієломи. Відповідно до іншого оптимального варіанта втілення хвороба відбирається із групи, що складається з ретинопатії, вікової макулярної дегенерації (наприклад, вологої форми AMD), діабетичного набряку сітківки, рубеозу; псоріазу, запальної хвороби нирок, гемолітичного уремічного синдрому, діабетичної нефропaтії (наприклад, проліферативної діабетичної ретинопатії), артриту (наприклад, псоріатичного артриту, остеоартриту, ревматоїдного артриту), запальної хвороби кишечника, хронічного запалення, хронічного відшарування сітківки, хронічного увеїту, хронічного вітриту, відторгнення трансплатату рогівки, неоваскуляризації рогівки, неоваскуляризації трансплантату рогівки, хвороби Крона, міопії, офтальмологічної неоваскулярної хвороби, хвороби Паджета, пемфігоїду, поліартериїту, післялазерної радіальної кератотомії, неоваскуляризації сітківки, синдрома Шегрена, виразкового коліту, відторгнення трансплантата, запалення легені, нефротичного синдрому, набряку, асцитів, пов'язаних зі злоякісними новоутвореннями, інсульту, ангіофіброми і неоваскулярної глаукоми. В одному варіанті втілення суб'єкту додатково вводять терапевтичний агент, відібраний із групи, що складається із антинеопластичного агента, хіміотерапевтичного агента й цитотоксичного агента. Відповідно до одного оптимального втілення цього винаходу, суб'єкт, який отримує лікування антагоністом альфа5бета1, страждає на рецидив після лікування антагоніста VEGF або став рефрактерним до лікування антагоністом VEGF. Відповідно до іншого варіанта 2 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 втілення суб'єкт, який отримує лікування антагоністом альфа5бета1 і антагоністом VEGF, страждає на метастатичний рак або попередньо отримував лікування ад'ювантною терапією. В одному варіанті втілення у пацієнта-кандидата спостерігається рецидив, рефрактерність або резистентність до хіміотерапевтичних агентів, таких як ірінотекан. Приклади таких хвороб, включають, крім інших, метастатичний колоректальний рак, рецидивуючий метастатичний колоректальний рак, метастатичний рак молочної залози, рецидивуючий метастатичний рак молочної залози, метастатичний HER2+ рак молочної залози, ад'ювантний рак молочної залози, ад'ювантний HER2+ рак молочної залози, метастатичний панкреатичний рак, ад'ювантний рак кишечнику, ад'ювантний немілкоклітинний рак легені, ад'ювантний ректальний рак, ад'ювантний немілкоклітинний рак легені, метастатичний немілкоклітинний рак легені, метастатичний рак яєчника, метастатичний нирковоклітинний рак й ад'ювантний нирковоклітинний рак. Відповідно до одного варіанта втілення суб'єктові, який страждає на хворобу, описану авторами, вводять підтримуючу терапію після лікування хвороби антагоністом VEGF, причому підтримуюча терапія - антагоніст альфа5бета1 окремо або послідовно чи одночасно з антагоністом VEGF. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення антагоніст VEGF може бути відібраний із групи, що складається з антитіла, імуноадгезину, пептитіла, малої молекули й нуклеїнової кислоти, що гібридизується з молекулою нуклеїновой кислоти, яка кодує VEGF при жорстких умовах (наприклад, рибозим siРНК і аптамер). Відповідно до одного оптимального варіанта втілення антагоніст VEGF - антитіло. Відповідно до іншого варіанта втілення антитіло моноклональне антитіло. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення анти-VEGF антитіло має здатність до конкурентного інгібування зв'язування з людським VEGF антитілом Авастин®. Відповідно до іншого варіанта втілення анти-VEGF антитіло є людським, гуманізованим або химерним. Відповідно до одного специфічного варіанта втілення анти-VEGF антитіло - антитіло Авастин®. Відповідно до іншого варіанта втілення анти-VEGF антитіло відібране із групи, що складається із Fab, Fab", a F(ab)’2, одноланцюгового Fv (scFv), Fv фрагмента; діатіла і лінійного антитіла. Відповідно до іншого варіанта втілення антагоніст VEGF - біспецифічне антитіло, що зв'язує VEGF і альфа5бета1 і є антагоністом альфа5бета1. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення антагоніст альфа5бета1 може бути відібраний із групи, що складається з антитіла, імуноадгезина, пептитіла, малої молекули й нуклеїнової кислоти, що гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує альфа5бета1 при жорстких умовах. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення альфа5бета1 антагоніст - антитіло. Відповідно до іншого варіанта втілення антитіло моноклональне антитіло. Відповідно до подальшого варіанта втілення, моноклональне антитіло - химерне антитіло, таке як антилюдське альфа5бета1 антитіло, відоме як M200 або F200.Відповідно до одного варіанта втілення, анти-альфа5бета1 антитіло включає VН послідовність SEQ ID NO:1 і VL послідовність SEQ ID NO:2. Відповідно до іншого втілення анти-альфа5бета1 антитіло включає послідовність SEQ ID NO:3 і послідовність SEQ ID NO:4. Відповідно до іншого варіанта втілення анти-альфа5бета1 антитіло включає послідовність SEQ ID NO:4 і послідовність SEQ ID NO:5. Відповідно до одного оптимального втілення анти-альфа5бета1 антитіло має здатність до конкурентного інгібування зв'язування з людським альфа5бета1 7H5 антитілом або 7H12 антитілом. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення антиальфа5бета1 антитіло є людським, гуманізованим або химерним. Відповідно до одного певного варіанта втілення анти-альфа5бета1 антитіло - 7H5 антитіло, 7H12 антитіло або їх химерне чи гуманізоване антитіло. Відповідно до іншого варіанта втілення анти-альфа5бета1 антитіло відібране із групи, що складається із Fab, Fab", a F(ab)’2, одноланцюгового Fv (scFv), Fv фрагмента; діатіла і лінійного антитіла. Відповідно до іншого варіанта втілення альфа5бета1 антагоніст - біспецифічне антитіло, що зв'язує VEGF і альфа5бета1 і є антагоністом VEGF. Згідно із ще одним варіантом втілення анти-альфа5бета1 антагоніст має змінену ефекторну функцію. Відповідно до одного варіанта втілення анти-альфа5бета1 антитіло змінене, щоб зменшити або запобігти активності антитіло-залежної клітинної цитотоксичності (ADCC) або комплемент-залежної цитотоксичності (CDC) (наприклад, шляхом зміни нуклеїновокислотної послідовності, яка кодує частину Fc антитіла). Згідно із ще одним варіантом втілення антиальфа5бета1 антитіло було змінене для покращення його періоду напіввиведення у людей (наприклад, шляхом зміни нуклеїновокислотної послідовності, яка кодує частину Fc антитіла). Відповідно до одного варіанта втілення антагоніст VEGF або антагоніст альфа5бета1 кон'югований із цитотоксичним агентом або хіміотерапевтичним агентом. Відповідно до іншого варіанта втілення цитотоксичний агент - радіоактивний ізотоп або токсин. Даний винахід пропонує композиції, що включають антагоніст VEGF, антагоніст альфа5бета1 й фармацевтично прийнятний носій. Даний винахід також пропонує вироби, що 3 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включають інструкції для виявлення альфа5бета1 у суб'єкта, який отримує лікування антагоністом VEGF. Даний винахід також стосується застосування агоністів VEGFR і агоністів альфа5бета1 для сприяння ангіогінезу і судинній проникності і композиції, що включають агоністи VEGF і агоністи альфа5бета1 й фармацевтично прийнятний носій. Комбінаторні терапії агоністами VEGFR і агоністами альфа5бета1 можуть використовуватися при лікуванні низки хвороб, які отримали б користь внаслідок збільшення ангіогінезу і судинної проникності, включаючи, наприклад, загоєння ран, так як при лікуванні хронічних ран, гострих ран і звичайних ран. Короткий опис фігур Фіг. 1 показує збільшення залучення стромальних клітин, що експресують альфа5бета 1 після лікування HT29 ксенотрансплантатних пухлин за допомогою анти-VEGF антитіла, B20-4.1. Фіг. 2 – графік, що показує зв'язування 7H5 і 7H12 антитіл з клітинами HUVEC у випробуванні на пряме зв'язування. Фіг. 3 показує зв'язування 7H5 і 7H12 антитіл з HUVEC, але не клітинами RAJI шляхом аналізу FACS. Фіг. 4 - графік, що показує адгезію HUVEC до фібронектину у присутності очищених 7H5 і 7H12 моноклональних антитіл. Фіг. 5 - (A) гістограма, що показує ефект 7H5 і 7H12 на проліферацію клітин HUVEC шляхом підрахунку загальної кількості клітин й (B) гістограма, що показує ефект 7H5 і 7H12 на проліферацію клітин HUVEC шляхом фарбування Alamar blue в іншому випробуванні. Фіг. 6 - фотографії міграції клітини HUVEC після лікування за допомогою 7H5 в 0 год. і 30 год. у порівнянні з негативним контролем (IgG). Фіг. 7 - гістограма, що кількісно показує міграцію клітини HUVEC після лікування за допомогою 7H5 і 7H12. Фіг. 8 - гістограма, що показує відсоток клітин HUVEC, які експресують активовану каспазу-3 у випробуванні на апоптоз після лікування за допомогою 7H5 і 7H12. Фіг. 9 - гістограма, що показує активність HUVEC Каспази 3/7 після лікування за допомогою 7H5 і 7H12. Фіг. 10 – графік, що показує активність 7H12 і/або Бевацизумаба на моделі загоєння рани кролячого вуха. Фіг. 11 показує результати для мишей, які отримували лікування анти-VEGF антитілом +/анти-альфа5бета1 антитілом на моделі раку молочної залози у вигляді (A) графіка, що показує груповий медіанний об'єм пухлини мишей, які отримували лікування або (B) кривої КапланаMайєра, що показує відсоток тварин, що залишаються в дослідженні, як функцію часу. Тварини 3 були виключені із дослідження, коли їх пухлини досягли або перевищили 1500 мм . Фіг. 12 показує результати для мишей, які отримували лікування анти-VEGF антитілом +/анти-альфа5бета1 антитілом на моделі раку кишечнику у вигляді (A) графіка, що показує груповий медіанний об'єм пухлини мишей, які отримували лікування або (B) кривої КапланаMайєра, що показує відсоток тварин, що залишаються в дослідженні, як функцію часу. Тварини 3 були виключені із дослідження, коли їх пухлини досягли або перевищили 1500 мм . Фіг. 13 показує результати для мишей, які отримували лікування анти-альфа5бета1 антитілом або хіміотерапевтичним агентом на моделі раку кишечнику у вигляді (A) графіка, що показує груповий медіанний об'єм пухлини мишей, які отримували лікування або (B) кривої Каплана-Mайєра, що показує відсоток тварин, що залишаються в дослідженні, як функцію часу. 3 Тварини були виключені із дослідження, коли їх пухлини досягли або перевищили 1500 мм . 125 Фіг. 14 показує графік Скетчарда I-7H5 зв'язування із альфа5бета1 на R9ab, клітинній лінії фібробластів кролика. 125 Фіг. 15 показує графік Скетчарда I-7H12 зв'язування з альфа5бета1 на R9ab, клітинній лінії фібробластів кролика. Фіг. 16 показує результати випробувань меппінгу/конкурентного зв'язування анти-інтегрин альфа5бета1 IgG епітопу з різними анти-альфа5бета1 антитілами. Детальний опис винаходу Не обмежуючись теорією ми пропонуємо, що збільшення залучення стромальних клітин може приносити інші судинні фактори росту до хворих ділянок, які можуть компенсувати втрату активності VEGF у пацієнтів, які отримують лікування терапіями антагоністами VEGF. Націлювання a5b1-експресуючих стромальних клітин за допомогою анти-a5b1 антитіла може призвести до скорочення стромальних клітин, у такий спосіб зменшуючи виробництво потенційних компенсаторних судинних факторів росту. Альтернативно, або додатково, ми пропонуємо, що інгібування ендотеліально-позаклітинних матричних взаємодій, і особливо інгібування взаємодій альфа5бета1 зв'язування, буде потенціювати терапії антагоністами VEGF 4 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 шляхом інгібування повернення ангіогінезу шляхами позаклітинної матриці, залишеними регресуючими судинами через терапію антагоністом VEGF. Тому, лікування антагоністами альфа5бета1 одночасно або після будь-якого лікування антагоністом VEGF може інгібувати відновлення судини внаслідок лікування антагоністом VEGF і, отже, повернення неоваскулярного росту. "Альфа5бета1" або “α5β1" або "a5b1" – інтегрин, що включає два різних білки (тобто, субодиниці Альфа5 і бета1). Показано, що Альфа5бета1 зв'язується з фібронектином, L1-CAM і фібриногеном. Альфа5бета1 інтегрин також має назву Дуже Пізньої Активації-5, VLA-5, альфа5бета1, CD49e/CD29, фібронектинового рецептора, FNR і GPIc-IIa. Відповідно до оптимального варіанта втілення альфа5бета1 - людський альфа5бета1. "Aльфа5" також відомий як CD49e, альфа5, інтегринова альфа5 субодиниця, VLA-5 альфа субодиниця, ІС субодиниця GPIc-IIa і FNR альфа ланцюг має чотири ізоформи, отримані альтернативним сплайсингом (A-D). Вони відрізняються в межах їх цитоплазматичних доменів. Амінокислотні послідовності для людських ізоформ альфа5 можуть бути знайдені в, наприклад, Genbank за номерами надходження: X07979, U33879, U33882 і U33880, відповідно. "Бета1" також має назву CD29, бета1, Тромбоцитарний GPIIa; VLA-бета ланцюг; бета-1 інтегриновий ланцюг, CD29; FNRB; MDF2; VLAB; GPIIA; MSK12 і VLA5B. Амінокислотні послідовності для людского Бета1 можуть бути знайдені, наприклад, у Genbank за № надходження X06256. Вжитий авторами термін "VEGF" або "VEGF" стосується 165-амінокислотного людського судинного ендотеліального клітинного фактора росту й споріднених 121-, 189- і 206амінокислотних людських судинних ендотеліальних клітинних факторів росту, як описано в Leung et al. Science, 246:1306 (1989) і Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), разом із природними алельними і їх обробленими формами. Термін "VEGF" також стосується VEGF від нелюдських видів, таких як миша, щур або примат. Іноді VEGF від певного виду позначені відповідно до термінів, так як hVEGF для людського VEGF, mVEGF для мишачого VEGF, і т.д. Термін "VEGF" також вживається для позначення обрізаних форм поліпептиду, що включає амінокислоти 8-109 або 1-109 з 165-амінокислотного людського судинного ендотеліального клітинного фактора росту. Посилання на будь-які такі форми VEGF можуть бути ідентифіковані в даній заявці, наприклад, "VEGF (8-109),” "VEGF (1-109)” або "VEGF165". Амінокислотні положення для "обрізаного" нативного VEGF пронумеровані як позначено в нативній послідовності VEGF. Наприклад, амінокислотне положення 17 (метіонін) в обрізаному нативному VEGF є також положення 17 (метіонін) у нативному VEGF. Обрізаний нативний VEGF має зв'язувальну афінність до рецепторів KDR і Flt-1, порівнянну з нативним VEGF. Відповідно до оптимального варіанта втілення, VEGF - людський VEGF. "Антагоніст VEGF" стосується молекули, здатної до нейтралізації, блокування, інгібування, відміни, скорочення або перешкоджання активностям VEGF, включаючи його зв'язування з VEGF або одним чи кількома рецепторами VEGF або нуклеїновою кислотою, яка їх кодує. Оптимально, антагоніст VEGF зв'язує VEGF або рецептор VEGF. Антагоністи VEGF включають анти-VEGF антитіла та їх антиген-зв'язуючі фрагменти, поліпептиди, які зв'язують VEGF і рецептори VEGF і блокують взаємодію ліганд-рецептор (наприклад, імуноадгезини, пептитіла), анти-VEGF рецепторні антитіла й антагоністи рецептора VEGF, такі як малі молекули інгібітори VEGFR тирозинкіназ, аптамери, які зв'язують VEGF і нуклеїнові кислоти, які гібридизуються при жорстких умовах з нуклеїновокислотними послідовностями, які кодують VEGF або рецептор VEGF (наприклад, RNAi). Відповідно до одного оптимального варіанта втілення антагоніст VEGF зв'язується з VEGF та інгібує VEGF-індуковану проліферацію ендотеліальних клітин in vitro. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення антагоніст VEGF зв'язується з VEGF або рецептором VEGF з більшою афінністю ніж не-VEGF або не-VEGF рецептор. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення антагоніст VEG зв'язується з VEGF або рецептором VEGF з Kd, що становить 1 мкM – 1 пкM. Відповідно до іншого оптимального варіанта втілення антагоніст VEGF зв'язується з VEGF або рецептором VEGF між 500 нM і 1 пкM. Відповідно до оптимального варіанта втілення антагоніст VEGF відібраний із групи, що складається із поліпептида, такого як антитіло, пептитіло, імуноадгезин, мала молекула або аптамер. В оптимальному варіанті втілення антитіло - анти-VEGF антитіло, таке як антитіло АВАСТИН® або анти-VEGF рецепторне антитіло, таке як анти-VEGFR2 або анти-VEGFR3 антитіло. Інші приклади антагоністів VEGF включають: VEGF-Trap, Mucagen, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (сорафеніб), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ417975/CT6758 і KRN-633. 5 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Анти-VEGF антитіло" є антитілом, що зв'язується з VEGF з достатньою афінністю й специфічністю. Переважно, анти-VEGF антитіло винаходу може використовуватися у якості терапевтичного агента у націлюванні й перешкоджанні хворобам або станам, в яких залучена активність VEGF. Анти-VEGF антитіло не буде зазвичай зв'язуватися з іншими гомологами VEGF, такими як VEGF-B або VEGF-C, ні з іншими факторами росту, такими як PlGF, PDGF або bFGF. Оптимальне анти-VEGF антитіло - моноклональне антитіло, що зв'язується з тим же епітопом, що і моноклональне анти-VEGF антитіло A4.6.1, отримане за допомогою гібридоми ATCC HB 10709. Більш оптимально анти-VEGF антитіло - рекомбинантне гуманізоване антиVEGF моноклональне антитіло, отримане згідно Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599, включаючи, крім інших, антитіло, відоме як бевацизумаб (BV; Авастин®). Відповідно до іншого варіанта втілення анти-VEGF антитіла, які можуть використовуватися, включають, крім інших, антитіла, описані в, WO 2005/012359. Відповідно до одного варіанта втілення анти-VEGF антитіло включає варіабельну важку й варіабельну легку ділянку кожного з антитіл, описаних в Фігурах 24, 25, 26, 27, і 29 із WO 2005/012359 (наприклад, G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 і B20.4.1). В іншому оптимальному варіанті втілення анти-VEGF антитіло, відоме як ранібізумаб - антагоніст VEGF, який вводять для лікування хвороби очей, такої які діабетична невропатія й AMD. Анти-VEGF антитіло "Бевацизумаб (BV)”, також відоме як "rhuMAb VEGF" або "Авастин®”, є рекомбінантним гуманізованим анти-VEGF моноклональним антитілом, отриманим згідно Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599. Воно включає мутовані каркасні ділянки людського IgG1й антиген-зв'язувальні ділянки, що визначають комплементарність із мишачого анти-hVEGF моноклонального антитіла А.4.6.1, що блокує зв'язування людського VEGF з його рецепторами. Приблизно 93 % амінокислотної послідовності Бевацизумаба, включаючи більшість каркасних ділянок, отримані від людського IgG1, і приблизно 7 % послідовності отримано із мишачого антитіла A4.6.1. Бевацизумаб має молекулярну масу, що становить приблизно 149 000 дальтон і є глікозильованим. Інші анти-VEGF антитіла включають антитіла, описані в Патенті США № 6884879 і WO 2005/044853. Анти-VEGF антитіло Ранібізумаб або антитіло Lуцентіс® або rhuFab V2 є гуманізованим, афіннозрілим антилюдським Fab фрагментом VEGF. Ранібізумаб отримують стандартними методами рекомбінантної технології у векторі експресії Escherichia coli й бактеріальній ферментації. Ранібізумаб не є глікозильованим і має молекулярну масу ~48 000 дальтон. Див. WO98/45331 і US20030190317. "Антагоніст альфа5бета1" стосується будь-якої молекули, що інгібуєбіологічну активність альфа5бета1. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення молекула антагоніста специфічно зв'язується з альфа5бета1. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення молекула антагоніста зв'язується з альфа5. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення антагоніст альфа5бета1 переважно зв'язується з альфа5бета1 з більшою афінністю відносно не-альфа5бета1 інтегрину. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення антагоніст відібраний із групи, що складається із поліпептида, такого як антитіло, пептитіло або імуноадгезин, малої молекули або аптамеру, що інгібує зв'язування альфа5бета1 з його лігандом (особливо, фібронектином) або нуклеїновою кислотою, що гібридизується при жорстких умовах з молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує альфа5бета1 (наприклад, RNAi, що перешкоджає експресії альфа5). Біологічна активність альфа5бета1 може бути будь-яким одним, комбінацією або всіма ефектами, відібраними із групи, що складається зі (1) зв'язування з фібронектином, (2) підвищення міграції клітин на фібронектин, (3) збільшення виживання клітин, що включають альфа5бета1, у присутності фібронектину, (4) збільшення проліферації клітин, що включають альфа5бета1 у присутності фібронектину, і (5) збільшення формування трубок клітин, що включають альфа5бета1, у присутності фібронектина. Приклади анти-альфа5бета1 антагоніста антитіл включають M200 і F200 (WO 2004/089988A2), 7H5 антитіло й 7H12 антитіло, описане авторами, та їх химерні, повністю людські й гуманізовані антитіла. Наприклад, антитіла M200 і F200 можуть бути отримані з варіабельних важких й варіабельних легких ланцюгів альфа5бета1 антитіла миша антилюдина, IIA1 (Pharmingen, Сан-Дієго, Каліфорнія). Приклади малих молекул інгібіторів альфа5бета1 включають Ac-PHSCN-NH2 (WO-9822617A1) і (S)-2-[(2,4,6-триметилфеніл)сульфоніл] аміно-3-[7бензилоксикарбоніл-8-(2-піридиніламінометил)-1-оксa-2,7-діазаспіро-(4,4)-нон-2-ен-3-іл] карбоніламіно] пропіонову кислоту. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення антагоніст альфа5бета1 зв'язується з альфа5бета1, а не альфаVбета3 або альфаVбета5 або альфаVбета1. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення антагоніст альфа5бета1 зв'язується з альфа5бета1 з Kd, що становить від 1 мкM до 1 пкM. Відповідно до іншого оптимального варіанта втілення антагоніст альфа5бета1 зв'язується з альфа5 з Kd, що 6 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 становить 500 нM – 1 пкM. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення альфа5бета1 антитіло - антитіло, що може конкурувати з 7H5 антитілом або 7H12 антитілом за зв'язування з альфа5бета1 у випробуванні конкурентного зв'язування. Відповідно до іншого оптимального варіанта втілення антитіло - антитіло, яке можна конкурентно інгібувати зв'язуванням з альфа5бета1 антитілом, отриманим від гібридоми, внесеної як Альфа5/бета1 7H5.4.2.8 (ATCC № РТА 7421) або гібридоми, внесеної як Альфа5/ бета1 7H12.5.1.4 (ATCC № РТА 7420) 7 березня 2006 р. "Агоніст VEGFR" стосується молекули, що може активізувати рецептор VEGF або збільшити його експресію. Агоністи VEGFR включають, крім інших, наприклад, лігандні агоністи VEGFR, варіанти VEGF, антитіла і активні фрагменти. "Агоніст альфа5бета1" стосується молекули, що може активувати альфа5бета1 або збільшити його експресію. Агоністи альфа5бета1 включають, крім інших, наприклад, лігандні агоністи альфа5бета1. Молекули, такі як антитіла, що характеризуються зв'язуванням до перекривання або подібними областями на мішені можуть бути ідентифіковані шляхом випробувань конкурентного інгібування/зв'язування. В одному варіанті втілення HUVEC або інші клітини, що експресують альфа5бета1, використовуються у випробуванні конкурентного інгібування, і FACS використовується для оцінки положень зв'язування двох анти-альфа5бета1 антитіл одне щодо іншого. Наприклад, клітини HUVEC можна промивати в конічній колбі й обертати упродовж 5 хвилин при 1000 об/хв. Пелета як правило промивається два рази. Тоді, клітини можна повторно суспендувати, підрахувати й зберігати на льоді до застосування. 100 мкл першого анти-альфа5бета1 антитіла (наприклад, початок при концентрації 1 мкг/мл або нижчій концентрації) можна додати в лунку. ^5 Потім, 100 мкл (наприклад, 20 × 10 клітин) клітин можна додати у лунку й інкубувати на льоді упродовж 30 хв… Потім, 100 мкл біотинильованого анти-альфа5бета1 антитіла (5 мкг/мл вихідного розчину) можна додати у кожну лунку й інкубувати на льоді упродовж 30 хв… Після цього клітини промивають й дражирують упродовж 5 хв. при 1000 об/хв. Супернатант аспірують. 2-е антитіло R-Фікоеритрин-кон'югований стрептавідин (Jackson 016-110-084) додають у лунку (100 мкл при 1:1000). Потім, пластину можна загорнути у фольгу й інкубувати на льоді упродовж 30 хв… Після інкубації, пелета може бути промита і дражируватись упродовж 5 хв. при 1000 об/хв. Пелета може бути повторно суспендована і перенесена у мікротитрувальні бюретки для аналізу FACS. "Ангіогенний фактор або агент" є фактором росту, що стимулює розвиток кровоносних судин, наприклад, сприяє ангіогінезу, росту ендотеліальних клітин, стабільності кровоносних судин, і/або васкулогенезу і т.д. Наприклад, ангіогенні фактори, включають, крім інших, наприклад, VEGF і членів родини VEGF, PlGF, родину PDGF, родину факторів росту фібробластів (FGFs), ТІЕ ліганди (Aнгіопоетини), ефрини, Del-1, фактори росту фібробластів: кислий (aFGF) і основний (bFGF), Фолістатин, фактор, що стимулює колонії гранулоцитів (GCSF), фактор росту гепатоцитів (HGF) / розсіюючий фактор (SF), Інтерлeйкін-8 (IL-8), Лептин, Мідкін, плацентарний фактор росту, тромбоцитарний ендотеліальний клітинний фактор росту (PD-ECGF), тромбоцитарний фактор росту, особливо PDGF-BB або PDGFR-бета, Плейотрофін (PTN), Програнулін, Проліферин, перетворювальний фактор росту-альфа (TGF-альфа), перетворювальний фактор росту-бета (TGF-Бета), фактор некрозу пухлини-альфа (TNFальфа), судинний ендотеліальний фактор росту (VEGF)/фактор судинної проникності (VPF) і т.д. Він також включає фактори, які прискорюють загоєння рани, такі як гормон росту, інсуліноподібний фактор росту -I (IGF-I), VIGF, епідермальний фактор росту (EGF), CTGF і члени його родини, і TGF-альфа й TGF-бета. Див., наприклад, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (наприклад, Таблиця 1 перелічує відомі ангіогенні фактори); і, Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003). "Kd" або "величина Kd" для анти-VEGF антитіла відповідно до цього винаходу в одному оптимальному варіанті втілення визначається випробуванням на зв'язування радіоміченим VEGF (RIA), що виконується із версією Fab антитіла й молекулою VEGF як описано наступним випробуванням, що визначає в афінність зв'язування Fab в розчині для VEGF шляхом 125 урівноважування Fab з мінімальною концентрацією ( I)-міченого VEGF (109) у присутності серії титрування неміченого VEGF, потім захоплення зв'язаного VEGF за допомогою покритого антиFab антитілом планшета (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Щоб установити умови для випробування, мікротитрувальні планшети (Dynex) покривають упродовж ночі за допомогою 5 мкг/мл захоплюючого анти-Fab антитіла (Cappel Labs) у 50 мМ карбонату натрію (pH 9,6), і 7 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 згодом блокують 2 % (м/об) бичачого сироваткового альбуміну у PBS протягом двох - п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23 °C). В не адсорбуючому планшеті (Nunc 125 #269620) 100 пкМ або 26 пкМ [ I] VEGF (109) змішують з серійними розведеннями Fab, що розглядається, наприклад, Fab-12 (Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Потім Fab, що розглядається, інкубують упродовж ночі; однак, інкубація може продовжуватись упродовж 65 годин для забезпечення досягнення рівноваги. Після того суміші переносять у планшет для захоплення для інкубації при кімнатній температурі протягом однієї години. Після цього розчин відбирають, і планшет промивають вісім разів за допомогою 0.1 % Твін 20 у PBS. Коли планшети висохли, додають 150 мкг/лунку сцинтиляційної речовини (MicroScint-20; Packard), і планшети підраховують на лічильникові Тopcount gamma (Packard) протягом десяти хвилин. Концентрації кожного Fab, які обумовлюють менше ніж або рівну 20 % максимального зв'язування, обираються для застосування у випробуванні на конкурентне зв'язування. Відповідно до іншого варіанта втілення величину Kd або Kd визначають при використанні TM випробування поверхневого плазмонного резонансу за допомогою BIAcore -2000 або TM BIAcore -3000 (BIAcore, Inc, Piscataway, NJ) при 25 °C з імобілізованими hVEGF (8-109) CM5 чіпами при ~10 одиниць відповіді (ВО). Стисло, біосенсорні чіпи з карбоксиметильованого декстрану (CM5, BIAcore Inc) активують за допомогою N-етил-N’-(3-диметиламінопропіл)карбодиіміду гідрохлориду (EDC) і N-гідроксисукциніміду (NHS) відповідно до інструкцій постачальника. Людський VEGF розводять за допомогою 10 мM ацетату натрію, pH 4,8, в 5 мкг/мл (~0.2 мкM) перед ін'єкцією при швидкості потоку, що становить 5 мкл/хв, щоб досягти приблизно 10 одиниць відповіді (ВО) спареного білка. Після ін'єкції людського VEGF 1M етаноламіну вводять, щоб блокувати групи, які не прореагували. Для кінетичних вимірів подвійні серійні розведення Fab (0,78 нМ - 500 нМ) вводять в PBS з 0,05 % Твін 20 (PBST) при 25 °C при швидкості потоку, що становить 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (k on) і швидкості дисоціації (k off) обчислюють, використовуючи просту модель зв'язування Langmuir (Програмне забезпечення для Оцінки BIAcore версія 3.2) шляхом одночасного пристосування сенсограми асоціації й дисоціації. Рівноважна константа дисоціації (Kd) була обчислена як співвідношення k off/kon. Див., наприклад, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Якщо швидкість асоціації перевищує 6 -1 -1 10 M S за допомогою випробування поверхневого плазмонного резонансу, описаного вище, тоді швидкість асоціації може бути визначена при використанні техніки гасіння флуоресценції, що вимірює збільшення або зменшення інтенсивності емісії флюоресценції (збудження = 295 нм; емісія = 340 нм, 16 нм смуга-проходження) при 25 °C 20 нM анти-VEGF антитіла (Fab форма) у PBS, pH 7,2, у присутності концентрацій, що збільшуються, короткої форми людського VEGF (8-109) або мишачого VEGF, як визначається в спектрометрі, такому як обладнаний зупинкою потоку спектофотометр (Aviv Instruments) або спектрофотометр SLM-Aminco 8000серії (ThermoSpectronic) з кюветою, що перемішується. Подібне випробування на зв'язування може бути виконане для визначення Kd анти-альфа5бета1 Fab або антитіла, використовуючи альфа5бета1 у якості мішені. Як вжито авторами, суб'єкт, що підлягає лікуванню - ссавець (наприклад, людина, нелюдський примат, щур, миша, корова, кінь, свиня, вівця, коза, собака, кіт і т.д.). Суб'єкт може бути клінічним пацієнтом, добровольцем у клінічному дослідженні, експериментальною твариною і т.д. У суб'єкта може підозрюватися наявність або він належить до групи ризику наявності раку, імунної хвороби або будь-якої іншої хвороби, що має патологічний ангіогінез, діагностований рак, імунна хвороба або будь-яка інша хвороба, що має патологічний ангіогінез. В даній галузі відомо багато діагностичних методів для раку, імунної хвороби або будь-якої іншої хвороби, що показує патологічний ангіогінез, і клінічну картину тих хвороб. Відповідно до одного оптимального варіанта втілення, суб'єкт, що підлягає лікуванню відповідно до цього винаходу - людина. Термін патологічний ангіогінез має місце, коли нові кровоносні судини ростуть надмірно або невідповідним чином (наприклад, місце розташування, періоди часу або початок ангіогінезу, що є небажані з медичної точки зору) при хворобливому стані або такому, що викликає хворобливий стан. Надмірний, невідповідний або неконтрольований ангіогінез відбувається у випадку, коли є ріст нової кровоносної судини, що вносить свій внесок у погіршення хворобливого стану або причину хворобливого стану, такому як при раку, особливо васкуляризованих солідних пухлинах й метастатичних пухлинах (включаючи рак кишечника, легені (особливо мілкоклітинний рак легені), або рак простати), хворобах, викликаних неоваскуляризацією в очах, особливо діабетичній сліпоті, ретинопатіях, насамперед діабетичній ретинопатії або віковій макулярній дегенерації, хориоїдальній неоваскуляризації (CNV), діабетичному макулярному набряку, патологічній короткозорості, хворобі фон Хіппеля-Ліндау, гістоплазмозі ока, Оклюзії центральної вени сітківки (CRVO), неоваскуляризації рогівки, 8 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 неоваскуляризації сітківки і рубеозі; псоріазі, псоріатичному артриті, гемангіобластомі, такій як гемангіомі; запальних хворобах нирок, таких як гломерулонефрит, особливо мезангіопроліферативний гломерулонефрит, гемолітичному уремічному синдромі, діабетичній нефропaтії або гіпертензивному нефросклерозі; різних запальних хворобах, таких як артрит, особливо ревматоїдному артриті, запальній хворобі кишечника, псоріазі, саркоїдозі, артеріальному артеріосклерозі й хворобах, що трапляються після трансплантацій, ендометріозі або хронічній астмі й більш ніж 70 інших станів. Нові кровоносні судини можуть годувати хворі тканини, руйнувати нормальні тканини і, у випадку раку, нові судини можуть дозволити пухлинним клітиннам потрапляти у кровообіг і осідати в інших органах (метастази пухлини). Даний винахід забезпечує лікування тих пацієнтів, які належать до групи ризику розвитку вищезгаданих хвороб. Інші пацієнти, які є кандидатами для одержання антитіл або поліпептидів цього винаходу, мають патологічну проліферацію фіброваскулярної тканини, акне, розацеа, синдром набутого імунодефіциту, оклюзію артерії, атопічний кератит, бактеріальні виразки, хворобу Бeше, пухлини, що переносяться кров'ю, обструкційну хворобу сонної артерії, хориоїдальну неоваскуляризацію, хронічне запалення, хронічне відшарування сітківки, хронічний увеїт, хронічний вітрит, надмірне носіння контактних лінз, відторгнення трансплантату рогівки, неоваскуляризацію рогівки, неоваскуляризацію трансплантата рогівки, хворобу Крона, хворобу Іла, епідемічний кератокон'юнктивіт, грибкові виразки, інфекції, викликані герпесом простим, інфекції, викликані опоясувальним лишаєм, синдроми гіперв'язкості, саркому Капоші, лейкемію, дегенерацію ліпідів, хворобу Ліма, маргінальний кератоліз, виразку Moрена, інфекції, викликані Mycobacteria крім лепри, міопію, неоваскулярні хвороби очей, набяки дисків зорового нерва, синдром Ослера-Вебера (Ослера-Вебера-Рандю, остеоартирит, хвороба Паджета, pars planitis, пемфігоїд, філектенульоз, поліартериїт, післялазерні ускладнення, протозойні інфекції, pseudoxanthoma elasticum, pterygium keratitis sicca, радіальну кератотомію, неоваскуляризацію сітківки, ретинопатію плода, ретролентальний фіброплазіаз, саркоїд, склерит, серпоподібноклітинну анемію, синдром Шегрена, солідні пухлини, хворобу Штaргарта, хворобу Стівена-Джонсона, кератит верхніх кінцівок, сифіліс, системний червоний вовчак, маргінальну дегенерацію Terrien, токсоплазмоз, травми, пухлини саркоми Eвінга, пухлини нейробластоми, пухлини oстеосаркоми, пухлини ретинобластоми, пухлини рабдоміосаркоми, виразковий коліт, оклюзію вени, дефіцит Вітаміну А и саркоїдоз Вегенера, патологічий ангіогінез, пов'язаний з діабетом, паразитарними хворобами, патологічним загоєнням рани, гіпертрофією після хірургії, рани або травми, пригнічення росту волосся, пригнічення овуляції й формування corpus luteum, пригнічення імплантації й пригнічення розвитку ембріона в матці, або належать до групи ризику їх розвитку. Протиангіогенні терапії корисні при загальному лікування відторгнення трансплантата, запалення легені, нефротичного синдрому, прееклампсії, перикардіального випоту, такого як пов'язаний з перикардитом, і плеврального випоту, хвороб й розладів, що характеризуються небажаною судинною проникністю, наприклад, набряку, пов'язаного з пухлинами головного мозку, асцитів, пов'язаних зі злоякісними новоутвореннями, синдрому Мейга, запалення легені, нефротичного синдрому, перикардіального випоту, плеврального випоту, проникності, пов'язаної із серцево-судинними хворобами, такого як стан після інфарктів міокарда та інсультів і т.п… Інші ангіогінез-залежні хвороби відповідно до цього винаходу включають ангіофіброму (патологічні кровоносні судини, які є схильними до кровотечі), неоваскулярну глаукому (ріст кровоносних судин в оці), артеріовенозні мальформації (патологічний зв'язок між артеріями і венами), переломи, що не складаються (переломи, які не загоюються), атеросклеротичні бляшки (зменшення еластичності артерій), піогенну гранульому (загальне ураження шкіри, що складається із кровоносних судин), склеродерму (форма хвороби сполучної тканини), гемангіому (пухлина, що складається із кровоносних судин), трахому (ведучу причину сліпоти в країнах третього світу), гемофілічні суглоби, судинну адгезію й гіпертрофічні шрами (патологічне формування шраму). "Лікування" стосується терапевтичного лікування й профілактичних або запобіжних заходів. Пацієнти, які потребують лікування, включають тих, хто вже має розлад, а також тих, у яких необхідно запобігти розвитку розладу. Терміни "повторення", "рецидив" або "що рецидивував" стосуються повернення раку або хвороби після клінічної оцінки зникнення хвороби. Діагностування віддалених метастазів або місцевого рецидиву можна вважати рецидивом. Термін "рефрактерний" або "резистентний" стосується раку або хвороби, у яких не відзначається відповіді на лікування. 9 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "ад'ювантна терапія" стосується лікування, що проводиться після первинної терапії, звичайно хірургії. Ад'ювантна терапія для раку або хвороби може включати імунну терапію, хіміотерапію, променеву терапію або гормональну терапію. Термін "підтримуюча терапія" стосується запланованого повторного лікування, що дається, щоб допомогти підтримати ефекти попереднього лікування. Підтримуюча терапія часто дається, щоб допомогти підтримувати рак у ремісії або продовжити відповідь на специфічну терапію незалежно від прогресії хвороби. Термін "інвазивний рак" стосується раку, що поширився за межі шару тканини, у якій він розпочався, в нормальні прилеглі тканини. Інвазивні ракові утворення можуть бути метастатичними або, можливо, й ні. Термін "неінвазивний рак" стосується дуже раннього раку або раку, що не поширився поза тканиною походження. Термін "виживання без прогресії" в онкології стосується проміжка часу упродовж і після лікування, упродовж якого рак не росте. Виживання без прогресії включає пацієнтів-час, у яких відзначалася повна відповідь або часткова відповідь, а також кількість пацієнтів-час, у яких відзначалася стабільна хвороба. Термін "прогресуюча хвороба" в онкології може стосуватися росту пухлини більше ніж на 20 відсотків з моменту початку лікування - або внаслідок збільшення маси або розповсюдження пухлини. "Розлад" - будь-який стан, що отримав би користь внаслідок лікування антитілом. Наприклад, ссавці, які страждають на патологічний ангіогінез (надмірний, невідповідний або неконтрольований ангіогінез) або судинну проникність або мають потребу в їх профілактиці. Він включає хронічні й гострі розлади або хвороби, включаючи ті патологічні стани, які зумовлюють схильність ссавця до розладу, що розглядається. Необмежуючі приклади розладів, які будуть лікуватися авторами, включають злоякісні й доброякісні пухлини; нелейкемічні й лімфоїдні злоякісні новоутворення; нейрональні, гліальні, aстроцитальні, гіпоталамічні та інші залозисті, макрофагальні, епітеліальні, стромальні й бластоцельні розлади; і запальні, ангіогенні та імунологічні розлади. Терміни "рак" і "раковий" стосуються або описують фізіологічний стан у ссавців, що типово характеризується нерегульованим ростом клітин. Приклади раку включають, крім інших, карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкемію. Більш специфічні приклади таких ракових утворень включають плоскоклітинний рак, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчників, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак кишечника, колоректальний рак, ендометріальну карциному, карциному слинної залози, рак нирки, нирковий рак, рак простати, рак вульви, рак щитовидної залози, карциному печінки, рак голови й шиї, ректальний рак, колоректальний рак, рак легені, включаючи мілкоклітинний рак легені, немілкоклітинний рак легені, аденокарциному легені й плоскоклітинну карциному легені, плоскоклітинний рак (наприклад, епітеліальний плоскоклітинний рак), рак простати, рак черевної порожнини, гепатоцелюлярний рак, рак шлунку, включаючи шлунковокишковий рак, рак підшлункової залози, гліобластому, ретинобластому, астроцитому, текоми, арренобластоми, гепатоми, гематологічні злоякісні новоутворення, включаючи неходжкінську лімфому (НХЛ), множинну мієлому й гострі гематологічні злоякісні новоутворення, карциному ендометрія або матки, eндометріоз, фібросаркоми, хоріокарциному, карциному слинної залози, рак вульви, рак щитовидної залози, карциноми стравоходу, карциному печінки, анальну карциному, карциному чоловічого статевого органу, карциному носоглотки, карциноми гортані, саркому Капоші, меланому, карциноми шкіри, шваному, oлігoдендрoгліому, нейробластоми, рабдоміосаркому, остеогенну саркому, лейоміосаркоми, карциноми сечових шляхів, карциноми щитовидної залози, пухлину Вільма, а також B-клітинну лімфому (включаючи низького ступеня злоякісності/ фолікулярну неходжкінську лімфому (НХЛ); мілку лимфоцитарну НХЛ (SL); середнього ступеня злоякісності/ фолікулярну НХЛ; дифузну НХЛ середнього ступеня злоякісності; імунобластну НХЛ високого ступеня злоякісності; лімфобластну НХЛ високого ступеня злоякісності; мілку нерозколотоклітинну НХЛ високого ступеня злоякісності; НХЛ з масивним ураженням; мантійноклітинну лімфому; пов'язану зі СПІДом лімфому; і Mакроглобулінемію Вальденстрема); хронічну лімфоцитарну лейкемію (ХЛЛ); гостру лімфобластну лейкемію (ГЛЛ); волосатоклітинну лейкемію; хронічну мієлобластну лейкемію; і посттрансплантаційний лімфопроліферативний розлад (PTLD), а також патологічну судинну проліферацію, пов'язану з факоматозом, і синдром Мейгса. Вжитий авторами термін "пухлина" стосується росту й проліферації всіх неопластичних клітин, злоякісних або доброякісних, і всіх передракових і ракових клітин і тканин. 10 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "антинеопластична композиція" або "антинеопластичний агент" стосується композиції, корисної для лікування раку, що включає принаймні один активний терапевтичний агент, наприклад, "протираковий агент.” Приклади терапевтичних агентів (протиракових агентів) включають, крім інших, наприклад, хіміотерапевтичні агенти, інгібуючі ріст агенти, цитотоксичні агенти, агенти, що використовуються в променевій терапії, протиангіогенні агенти, апоптозні агенти, антитубулінові агенти та інші агенти для лікування раку, такі як анти-HER-2 антитіла, анти-CD20 антитіла, антагоніст рецептора епідермального фактора росту (EGFR) (наприклад, TM інгібітор тирозинкінази), інгібітор HER1/EGFR (наприклад, ерлотиніб (Tарцевa ), інгібітори TM тромбоцитарного фактора росту (наприклад, Глівек (Iматинібу Meзилат)), інгібітор ЦОГ-2 (наприклад, целекоксиб), інтерферони, цитокіни, антагоністи (наприклад, нейтралізуючі антитіла), які зв'язуються з однією або кількома з наступних мішеней ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-бета, BR3, APRIL, BCMA або VEGF рецептор (и), TRAIL/Apo2, та інші біологічно активні й органічні хімічні речовини, і т.д. Їх комбінації також розглянуті в цьому винаході. Вжитий авторами термін "інгібуючий ріст агент" стосується сполуки або композиції, що інгібує ріст клітини in vitro й/або in vivo. Таким чином, інгібуючий ріст агент може бути тим, що значно зменшує відсоток клітин у фазі S. Приклади інгібуючих ріст агентів включають агенти, які блокують прогресію клітинного циклу (у місці, відмінному від фази S), такі як агенти, що викликають зупинку G1 і зупинку М-фази. Класичні блокатори М-фази включають сполуки барвінку (вінкристин і вінбластин), TAКСОЛ®, та інгібітори топо II, такі як доксорубіцин, eпiрубіцин, дaунoрубіцин, етопозид і блeoміцин. Такі агенти, які зупиняють G1, також зумовлюють зупинку S-Фази, наприклад, ДНК-алкілюючі агенти, такі як тамоксифен, преднізон, дакарбазин, мехлоретамін, цисплатин, метотрексат, 5-фтороурацил і aрa-C. Подальша інформація може бути знайдена в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds.,, Розділ 1, під назвою'Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особливо ст. 13. Вжитий авторами термін "цитотоксичний агент" стосується речовини, що пригнічує або запобігає функції клітин і/або викликає руйнування клітин. Термін включає радіоактивні ізотопи 131 125 90 186 (наприклад, I , I , Y і Re ), хіміотерапевтичні агенти і токсини, такі як ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження чи їх фрагменти. "Хіміотерапевтичний агент" є хімічною сполукою, корисною для лікування раку. Приклади хіміотерапевтичних агентів включають хімічну сполуку, корисну для лікування раку. Приклади хіміотерапевтичних агентів включають алкілюючі агенти, такі як тіотепа і ЦИТОКСAН® циклофосфамід; алкілсульфонати, такі як бусульфан, iмпрoсульфан і пiпoсульфан; азиридини, такі як бeнзoдoпa, карбохон, метуредoпa, і урeдoпa; етиленіміни і метилaмeламіни, включаючи aлтрeтамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметилoломеламін; aцeтoгеніни (особливо буллатацин і буллатацинон); кaмптoтeкiн (включаючи синтетичний аналог топотекан); бріoстатин; каллістатин; CC-1065 (включаючи його синтетичні аналоги aдoзeлезин, кaрзeлезин і бiзeлезин); кріптoфіцини (особливо кріптoфіцин 1 і кріптoфіцин 8); дoлaстатин; дуoкaрміцин (включаючи синтетичні аналоги, KW-2189 і CB1-TM1); eлeйтeрoбiн; пaнкрaтистатин; сaркoдiктиїн; спoнгiстатин; азотні гірчиці, такі як хлoрaмбуцил, хлoрнaфaзин, хлoрoфoсфaмiд, eстрaмустин, iфoсфaмiд, мeхлoрeтамін, мeхлoрeтаміну окиду гідрохлорид, мeлфaлaн, нoвeмбiхiн, фeнeстeрин, прeднiмустин, трoфoсфaмiд, урацильна гірчиця; нiтрoзосечовини, такі як кaрмустин, хлoрoзoтoкiн, фoтeмустин, лoмустин, нiмустин і рaнiмустин; антибіотики, такі як енедиїнові антибіотики (наприклад, кaлiхeaміцин, особливо кaлiхeaміцин гaммa1I і кaлiхeaміцин oмeгaI1 (див., наприклад, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динеміцин, включаючи динеміцин A; бiсфoсфoнати, такі клодронат; eспeрaміцин; а також хромофор нeoкaрцiнoстатин і споріднені хромoпротеїнові хромофори eнeдиїнових антибіотиків), aклaцинoмізини, aктинoміцин, аутрaміцин, aзaзeрін, блeoміцини, кaктинoміцин, кaрaбіцин, кaрмiнoміцин, кaрзинoфiлiн, хрoмoміцини, дaктинoміцин, дaунoрубіцин, дeтoрубіцин, 6-дiaзo-5-oксo-L-нoрлейкiн, доксорубіцин AДРIAМІЦИН® (включаючи мoрфoлiнoдоксорубіцин, ціaнoмoрфoлiнo-доксорубіцин, 2-піррoлiнo-доксорубіцин і дeзoксидоксорубіцин), eпiрубіцин, eзoрубіцин, iдaрубіцин, мaркeллoміцин, мiтoміцини, такі як мiтoміцин C, мікoфeнолова кислота, нoгaлaміцин, oлівoміцини, пeплoміцин, пoтфiрoміцин, пурoміцин, хeлaміцин, рoдoрубіцин, стрeптoнiгрiн, стрeптoзoцин, тубeрцидин, убeнiмeкс, зинoстатин, зoпибіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат й 5-фтороурацил (5-FU); аналоги фолієвої кислоти, такі як дeнoптeрин, метотрексат, птeрoптeрин, тримeтрeксaт; пуринові аналоги, такі як флудaрaбін, 6-мeркaптoпурин, тiaмiприн, тioгуанін; піримідинові аналоги, такі як aнцитaбін, aзaцитидин, 6-aзaурідин, кaрмoфур, цитарaбін, дідeзoксиурідин, дoксифлурідин, eнoцитaбін, флoксурідин; андрогени, такі як кaлустерон, дрoмoстaнoлону пропіонат, eпiтioстaнoл, 11 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мeпiтioстан, тeстoлaктoн; засоби, що пригнічують кору наднирників, такі як aмiнoглутeтимід, мiтoтан, трiлoстaн; поповнювач фолієвої кислоти, такий як фролiнова кислота; aкeглaтoн; aльдoфoсфaміду глікозид; aмiнoлeвулінова кислота; eнiлурaцил; aмсaкрин; бестрaбуцил; бiзaнтрен; eдaтрaксaт; дeфoфамін; дeмeкoльцин; дiaзiхон; eлфoрнiтін; ацетат eллiптинію; eпoтiлон; eтoглуцид; галію нітрат; гідроксисечовина; лeнтiнaн; лoнiдaїнін; мaйтaнсиноїди, такі як мaйтaнсин і aнзaмiтоцини; мiтoгуaзон; мiтoксaнтрон; мoпiдaнмoл; нiтрaeрин; пeнтoстатин; фeнaмeт; пiрaрубіцин; лoзoксaнтрoн; подофілінова кислота; 2-eтилгідразид; прoкaрбaзин; полісахаридний комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); рaзoксaн; рiзoксин; сiзoфiрaн; спiрoгeрманій; тенуазонова кислота; трiaзихон; 2,2',2"-трихлоротриетиламін; трихотекени (особливо T-2 токсин, верракурин A, рорідин A і ангуідин); уретан; вiндeзин; дакарбазин; мaннoмустин; мiтoбрoнiтoл; мiтoлaктoл; пiпoбрoмaн; гaцитозин; арабінозид ("AraC"); циклофосфамід; тіотепa; таксоїди, наприклад, паклітаксель TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANETM Cremophor-free, сформований альбуміно наночастинковий препарат паклітакселю (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), і доцетаксель TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Франція); хлорамбуцил; гемцитабін GEMZAR®; 6-тioгуанін; меркаптопурин; метотрексат; платинові аналоги, такі як цисплатин й карбоплатин; вінбластин; платина; етопозид (VP-16); iфoсфaмід; мiтoксантрон; вінкристин; вінорелбін NAVELBINE®; новантрон; теніпозид; eдaтрeксaт; дауноміцин; aмiнoптерин; ксeлoдa; iбaндрoнат; ірінотекан (Camptosar, СРТ_11) (включаючи режим лікування ірінотекан з 5-FU й лейковорином); інгібітор топоізомерази RFS 2000; дифторометилорнітин (DMFO); ретиноїди, такі як ретинойна кислота; капецитабін; кoмбрeтaстатин; лейковорин (LV); oксaліплатин, включаючи режим лікування з оксаліплатином (FOLFOX); інгібітори PKC-альфа, TM Raf, H-Ras і EGFR (наприклад, eрлотиніб (Taрцeвa )), які зменшують проліферацію клітин та фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні кожної з вищезгаданих сполук. Також в це визначення включені антигормональні агенти, які функціонують для регуляції або пригнічення гормональної дії на пухлини, такі як антиестрогени і селективні модулятори естрогенних рецепторів (SERM), включаючи, наприклад, тамоксифен (включаючи тамоксифен НOЛВАДЕКС®), рaлoксифен, дрoлoксифен, 4-гідрокситамоксифен, трioксифен, кeoксифен, LY117018, oнaпристон і ФAРEСТOН · тoрeмiфeн; інгібітори ароматази, які інгібують фермент ароматазу, який регулює продукцію естрогену в наднирниках, такі як, наприклад, 4(5)-імідазоли, аміноглутетимід, MEГАЗ® мегестролу ацетат, AРOMAЗИН® eксeмeстaн, фoрмeстaн, фaдрoзoл, РIВI30Р® вoрoзoл, ФEMAРA® лeтрoзoл і AРIMIДEКС® aнaстрoзoл; і антиандрогени, такі як флутaмiд, нiлутaмiд, бiкaлутaмiд, лейпролід і гoзeрeлін; а також трoксaцитабін (1,3дioксoлановий аналог нуклеозиду цитозин); антисмислові олігонуклеотиди, особливо ті, які інгібують експресію генів в сигнальних шляхах, залучених в аберантну клітинну проліферацію, такі як, наприклад, PKC-альфа, Raf і H-Ras; рибозими, такі як інгібітор експресії VEGF (наприклад, AНГІОЗИМ®рибозим) та інгібітор експресії HER2; вакцини, такі як вакцини генотерапії, наприклад, вакцини AЛЛOВEКTИН®, вакцини ЛЕЙВЕКTИН®, і вакцини ВAКСИД®; ПРOЛЕЙKIН® rIL-2; ЛУРTOTEКAН® інгібітор топоiзoмерази 1; AБAРEЛIКС® rmRH; Vінорелбін і Eспeрaміцини (ди. Пат. США № 4 675 187), та фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні кожної з вищезгаданих сполук. Термін "проліки", вжитий в цій заявці, стосується попередника або похідної форми фармацевтично активної речовини (наприклад, малої молекули), що є менш цитотоксичною для хворих клітин у порівнянні з материнським препаратом і має здатність до ферментативної активації або перетворення у більш активну материнську форму. Див., наприклад, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, ст. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) і Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, " Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), ст. 247-267, Humana Press (1985). Проліки цього винаходу включають, крім інших, фосфат-вмісні проліки, тioфосфат-вмісні проліки, сульфатвмісні проліки, пептид-вмісні проліки, D-амінокислото-модифіковані проліки, глікозильовані проліки, β-лактамовмісні проліки, довільно заміщені феноксиацетамід-вмісні проліки або довільно заміщені фенілaцeтaмід-вмісні проліки, 5-фторoцитозинові та інші 5-фторoуридинові проліки, які можуть бути перетворені в більш активну цитотоксичну незв'язану речовину. Приклади цитотоксичних препаратів, які можуть бути дериватизовані у вигляді проліків для застосування в цьому винаході, включають, крім інших, хіміотерапевтичні агенти, описані вище. "Ізольований", коли вживається для описання різних поліпептидів, описаних авторами, означає поліпептид, що був ідентифікований та відділений і/або вивільнений із клітини або клітинної культури, з якої він був експресований. Забруднюючі компоненти його природного навколишнього середовища являють собою матеріали, які типово заважали б діагностичним або терапевтичним застосуванням для поліпептида, і можуть включати ферменти, гормони та 12 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інші білкові або небілкові солюти. В оптимальних варіантах втілення поліпептид буде очищений (1) до ступеня, достатнього, щоб одержати принаймні 15 залишків N-термінальної або внутрішньої амінокислотної послідовності за допомогою секвенатора з чашкою, що обертається, або (2) до гомогенності за допомогою ДСН-ПАГ за невідновлюючих або відновлюючих умов, використовуючи Кумасі блакитний або, бажано, забарвлювання сріблом. Ізольований поліпептид включає поліпептид in situ в рекомбінантних клітинах, оскільки принаймні один компонент природного середовища поліпептида не буде присутній. Однак, звичайно, ізольований поліпептид отримують принаймні за допомогою однієї стадії очищення. "Ізольована" нуклеїнова кислота, що кодує поліпептид, або інша нуклеїнова кислота, що кодує поліпептид - молекула нуклеїнової кислоти, яка ідентифікована й відділена принаймні від однієї забруднюючої молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона звичайно асоційована в природному джерелі нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид є відмінної від тієї, що перебуває у вигляді або розміщенні, у яких вона виявляється в природі. Тому ізольовані молекули нуклеїнової кислоти, що кодують поліпептид, відрізняють від специфічної молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, оскільки вона існує в природних клітинах. Однак, ізольована молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, включає молекули нуклеїнової кислоти, що кодують поліпептид, які містяться в клітинах, що звичайно експресують поліпептид, де, наприклад, молекула нуклеїнової кислоти перебуває в хромосомному розташуванні, відмінному від такого для природних клітин. Термін "контрольні послідовності" стосується ДНК послідовностей, необхідних для експресії оперативно зв'язаної кодуючої послідовності у певному організмі-хазяїні. Контрольні послідовності, які підходять для прокаріот, наприклад, включають промотер, довільно послідовність оператора і рибосом-зв'язувальну ділянку. Eукаріотичні клітини, як відомо, використовують промотери, сигнали пoліaдeниляції і посилюючі агенти. Нуклеїнова кислота "оперативно зв'язана", коли вона знаходиться у функціональному взаємозв'язку з іншою нуклеїновокислотною послідовністю. Наприклад, ДНК для передпослідовності або секреторного лідера є оперативно зв'язаною з ДНК для поліпептида, якщо він експресується як передбілок, що бере участь у секреції поліпептида; промотер або посилюючий агент є оперативно зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності; або рибосом-зв'язувальна ділянка є оперативно зв'язаною з кодуючою послідовністю, якщо вона розташована таким чином, щоб полегшити трансляцію. Взагалі, "оперативно зв'язаний" означає те, що ДНК послідовності, будучи зв'язаними, є суміжними, і, у випадку секреторного лідера, суміжними й у фазі зчитування. Однак, підсилюючі агенти не повинні бути суміжними. З'єднання досягається шляхом лігації на зручних сайтах рестрикції. Якщо таких сайтів не існує, відповідно до звичайної практики використовуються синтетичні олігонуклеотидні адаптери або лінкери. "Жорсткі умови" або "умови високої жорсткості", визначені авторами, можуть бути ідентифіковані як ті, що: (1) використовують низьку іонну силу й високу температуру для промивання, наприклад 0,015 М натрію хлорид/0,0015 М натрію цитрат %/0,1 натрію дoдецилсульфат при 50C; (2) застосовують протягом гібридизації денатуруючий агент, такий як фoрмaмiд, наприклад, 50 % (об/об) фoрмaмiд з 0,1 % бичачим сироватковим альбуміном / 0,1 % % Ficoll/0,1 % полівiнілпіролідон/50 мM натрієфосфатний буфер при pH 6,5 з 750 мМ натрію хлориду, 75 мМ натрію цитрат при 42C; або (3) гібридизація упродовж ночі в розчині, що використовує 50 % фoрмaмiд, 5 x SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М натрію цитрат), 50 мМ фосфат натрію (pH 6,8), 0,1 % пірофосфат натрію, 5 x розчин Денгардта, оброблена ультразвуком ДНК сперми лосося (50 мкг/мл), 0,1 % SDS і 10 % декстрану сульфат при 42C, з 10-хвилинним промиванням при 42C в 0.2 x SSC (натрію хлорид/натрію цитрат), що супроводжується 10хвилинним промиванням високої жорсткості, що складається з 0,1 x SSC, що містить EDTA при 55C. "Відсоток (%) ідентичності амінокислотної послідовності" щодо поліпептидних послідовностей, ідентифікованих авторами, визначається як відсоток амінокислотних залишків в послідовності-кандидаті, які є ідентичними амінокислотним залишкам в порівнюваному поліпептиді, після вирівнювання послідовностей і введення проміжків, у разі потреби, для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовності, і не враховуючи будь-яких консервативних заміщень як частини ідентичності послідовності. Вирівнювання з метою визначення відсотка ідентичності амінокислотної послідовності можна досягти різними способами, які є в межах навичок в даній галузі, наприклад, використовуючи загально доступне програмне забезпечення, таке як програмне забезпечення BLAST, BLAST-2, ALIGN або Megalign (DNASTAR). Кваліфіковані спеціалісти в даній галузі можуть визначити відповідні 13 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 параметри для виміру вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по повній довжині порівнюваних послідовностей. Однак, з цією метою, % значення ідентичності амінокислотної послідовності отримують, використовуючи комп'ютерну програму порівняння послідовності ALIGN-2. Комп'ютерна програма порівняння послідовності ALIGN-2 була авторизована Genentech, Inc, і вихідний код (Таблиця 1) був поданий з документацією користувача в Бюро реєстрації авторських прав США, Вашингтон D.C., 20559, де вона зареєстрована за номером реєстрації авторських прав США TXU510087. Програма ALIGN-2 є загально доступною через Genentech, Inc, Південний Сан-Франциско, Каліфорнія. Програма ALIGN-2 повинна бути зібрана для застосування на операційній системі UNIX, переважно цифровій UNIX V4.0D. Всі параметри порівняння послідовності встановлюються програмою ALIGN-2 і не змінюються. Амінокислотні послідовності, описані авторами, є суміжними амінокислотними послідовностями, якщо не визначено інакше. Вжитий авторами термін "імуноадгезин" визначає антитілоподібні молекули, які поєднують зв'язуючу специфічність гетерологічного білка ("адгезина") з ефекторними функціями константних доменів імуноглобуліну. Структурно, імуноадгезини включають злиття амінокислотної послідовності з бажаною зв'язуючою специфічністю, що є відмінною від розпізнання антигену й зв'язуючої ділянки антитіла (тобто, є "гетерологічним"), і послідовності константної ділянки імуноглобуліну. Адгезинова частина імуноадгезинової молекули типово є суміжною амінокислотною послідовністю, що включає принаймні зв'язуючу ділянку рецептора або ліганда, таку як VEGFR або фібронектиновий ліганд. Послідовність константного домену імуноглобуліну в імуноадгезині може бути отримана із будь-якого імуноглобуліну, такого як підтипи IgG-1, IgG-2, IgG-3 або IgG-4, IgA (включаючи IgA-1 і IgA-2), IgE, IgD або IgM. Пептитіла, які часто включають послідовність, отриману з вибору фагового дисплею послідовностей, які специфічно зв'язують мішень, злиту із Fc частиною імуноглобуліну, можуть розглядатися авторами як імуноадгезини. Термін "антитіло" вживається в самому широкому змісті й специфічно охоплює, наприклад, поодинокі моноклональні антитіла (включаючи агоніста, антагоніста і нейтралізуючі антитіла), композиції антитіл з поліeпітопною специфічністю, поліклональні антитіла, одноланцюгові антиантитіла і фрагменти антитіл (див. нижче), якщо вони специфічно зв'язують нативний поліпептид і/або виявляють біологічну активність або імунологічну активність цього винаходу. Відповідно до одного варіанта втілення антитіло зв'язується з олігомерною формою мішеневого білка, наприклад, тримерною формою. Відповідно до іншого варіанта втілення антитіло специфічно зв'язується з білком, зв'язування якого може інгібуватись моноклональним антитілом цього винаходу (наприклад, осадженим антитілом цього винаходу і т.д.). Фраза "функціональний фрагмент або аналог" антитіла є сполукою, що має якісну біологічну активність спільно з антитілом, до якого він відноситься. Наприклад, функціональний фрагмент або аналог антитіла цього винаходу можуть бути таким, що може специфічно зв'язуватися з VEGF або альфа5бета1. В одному варіанті втілення антитіло може запобігти або істотно зменшити здатність VEGF індукувати проліферацію клітин. "Ізольоване антитіло" є таким, що було ідентифіковане і відділене і/або вивільнене із компонента його природного навколишнього середовища. Забруднюючі компоненти його природного навколишнього середовища являють собою матеріали, які типово заважали б діагностичним або терапевтичним застосуванням для антитіла, і можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові солюти. В оптимальних варіантах втілення антитіло буде очищене (1) до більш ніж 95 % за масою антитіла, як визначається методом Лоурі, і найбільш бажано більш ніж 99 % за масою, (2) до ступеня, достатнього, щоб одержати принаймні 15 залишків N-термінальної або внутрішньої амінокислотної послідовності за допомогою секвенатораз чашкою, що обертається, або (3) до гомогенності за допомогою ДНС-ПАГ при невідновлюючих або відновлюючих умовах, використовуючи Кумасі блакитний або, бажано, забарвлювання сріблом. Ізольоване антитіло включає антитіло in situ в рекомбінантних клітинах, тому що принаймні один компонент з природного навколишнього середовища антитіла не буде присутній. Звичайно, однак, ізольоване антитіло буде отримане за допомогою принаймні однієї стадії очищення. Основна 4 ланцюгова одиниця антитіла є гетеротетрамерним глікопротеїном, що складається із двох ідентичних легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких (H) ланцюгів (IgM антитіло складається з 5 основних гетеротетрамерних одиниць разом з додатковим поліпептидом під назвою J ланцюг, і тому містить 10 антиген-зв'язуючих ділянок, у той час як секретовані IgA антитіла можуть полімеризуватися, щоб сформувати полівалентні скупчення, що включають 2-5 основних 4-ланцюгових одиниць разом з J ланцюгом). У випадку IgG 4 14 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ланцюгової одиниці - взагалі приблизно 150 000 дaльтoн. Кожен L ланцюг зв'язаний з H ланцюгом одним ковалентним дисульфідним зв'язком, у той час як два H ланцюги зв'язані один з одним одним або більше дисульфідними зв'язками залежно від iзотипу H ланцюга. Кожен H і L ланцюг також мають регулярно розташовані внутрішньоланцюгові дисульфідні містки. Кожен H ланцюг має на N-кінці варіабельний домен (VH), що супроводжується трьома константними доменами (CH) для кожного α і γ ланцюгів і чотирьох CH доменів для µ і ε iзотипів. Кожен L ланцюг має на N-кінці варіабельний домен (VL), що супроводжується константним доменом (CL) на його іншому кінці. Цей VL вирівняний з VH, а CL вирівняний з першим константним доменом важкого ланцюга (CH1). Специфічні амінокислотні залишки, як вважається, формують інтерфейс між варіабельними доменами легкого ланцюга і важкого ланцюга. Спарювання VH й VL разом формує єдину антиген-зв'язуючу ділянку. Для ознайомлення зі структурою й властивостями різних класів антитіл, див., наприклад, Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, сторінка 71 і Розділ 6. L ланцюг від будь-яких хребетних видів може бути віднесений до одного із двох чітко відмінних типів, названих каппа і лямбда, на основі амінокислотних послідовностей їхніх константних доменів. Залежно від амінокислотної послідовності константного домену їхніх важких ланцюгів (CH) імуноглобуліни можуть бути віднесені до різних класів або ізотипів. Є п'ять класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, що мають важкі ланцюги, які позначаються як α, δ, γ, ε, і µ, відповідно. γ і α класи далі розділяють на підкласи на основі відносно незначних розходжень у CH послідовності і функції, наприклад, люди експресують наступні підкласи: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2. Термін "варіабельний" стосується факту, що певні сегменти варіабельних доменів значно відрізняються у послідовності серед антитіл. V домен опосередковує зв'язування антигену й визначає специфічність певного антитіла для його певного антигену. Однак, варіабельність рівномірно не розподілена уздовж 110-амінокислотного проміжку варіабельних доменів. Замість цього, V ділянки складаються з відносно інваріантних відрізків, названих каркасними ділянками (FRs) з 15-30 амінокислот, розділених більш короткими ділянками надзвичайної варіабельності, що названі "гіперваріабельними ділянками", довжина кожної з яких становить 9-12 амінокислот. Варіабельні домени нативних важких й легких ланцюгів включають по чотири FR, у значній мірі приймаючи бета-листову конфігурацію, зв'язану трьома гіперваріабельними ділянками, які формують з'єднання петель, і в деяких випадках формуючи частину бета-листкової структури. Гіперваріабельні ділянки в кожному ланцюзі утримуються разом у безпосередній близькості за допомогою FR і, з гіперваріабельними ділянками від іншого ланцюга, що сприяє формуванню антиген-зв'язуючої ділянки антитіл (див. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константні домени не залучені безпосередньо у зв'язування антитіла до антигену, але показують різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в антитіло-залежній клітинній цитотоксичності (ADCC). Вжитий авторами термін "гіперваріабельна ділянка" стосується амінокислотних залишків антитіла, які відповідають за зв'язування антигену. Гіперваріабельна ділянка взагалі включає амінокислотні залишки від "ділянки, що визначає комплементарність" або "CDR" (наприклад навколо залишків 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97 (L3) у VL, і навколо 31-35B (H1), 50-65 (H2) і 95102 (H3) у VH (в одному варіанті втілення H1 - навколо приблизно 31-35); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) і/або ті залишки від "гіперваріабельної петлі" (наприклад, залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 (L3) у VL, і 26-32 (H1), 53-55 (H2) і 96-101 (H3) у VH; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Вжитий авторами термін "моноклональне антитіло" стосується антитіла, отриманого із популяції практично гомогенних антитіл, тобто, індивідуальних антитіл, що входять до складу популяції, є ідентичними за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутніми у незначних кількостях. Моноклональні антитіла є високо специфічними, будучи спрямованими проти єдиної антигенної ділянки. Крім того, на відміну від препаратів поліклональних антитіл, які включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло спрямоване проти однієї детермінанти на антигені. На додаток до їхньої специфічності моноклональні антитіла мають перевагу у тому, що вони можуть бути синтезовані незабрудненими іншими антитілами. Модифікатор "моноклональний" не повинен тлумачитися як такий, що вимагає виробництва антитіла будь-яким специфічним методом. Наприклад, моноклональні антитіла, що корисні в даному винаході, можуть бути приготовані відповідно до методики гібридом, вперше описаної Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), або можуть бути 15 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зроблені, використовуючи рекомбінантні методи ДНК у бактеріальних, еукаріотичних тваринних або рослинних клітинах (див., наприклад, патент США № 4 816 567). "Моноклональні антитіла" можуть також бути ізольовані із бібліотек фагових антитіл за допомогою методів, описаних в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), і Прикладах нижче, наприклад. Моноклональні антитіла, описані авторами, включають "химерні" антитіла, у яких частина важкого й/або легкого ланцюга є ідентичною або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах, отриманих з певного виду або що належать певному класу або підкласу антитіл, у той час як залишок від ланцюга (ів) є ідентичним або гомологічним відповідним послідовностям в антитілах, отриманих з іншого виду або що належать до іншого класу або підкласу антитіл, а також фрагментів таких антитіл, якщо вони демонструють біологічну активність цього винаходу (див. патент США № 4 816 567; і Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерні антитіла, що розглядаються авторами, включають "приматизовані" антитіла, що включають антиген-зв'язуючі послідовності варіабельного домену, отримані від нелюдського примата (наприклад, древні мавпи, мавпа й т.д), і послідовності людських константних ділянок. "Інтактне" антитіло є тим, що включає антиген-зв'язуючу ділянку, а також CL і принаймні константні домени важкого ланцюга, CH1, CH2 і CH3. Константні домени можуть бути константними доменами нативної послідовності (наприклад, константні домени людської нативної послідовності) або їх варіанти амінокислотної послідовності. Бажано, щоб інтактне антитіло мало одну або кілька ефекторних функцій. "Фрагменти антитіла" включають частину інтактного антитіла, бажано антиген-зв'язуючу або варіабельну ділянку інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіла включають Fab, Fab', F(ab')2 і Fv фрагменти; діатіла; лінійні антитіла (див. патент США № 5 641 870, Приклад 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); молекули одноланцюгового антитіла; і мультиспецифічні антитіла, сформовані із фрагментів антитіл. Вираз "лінійні антитіла" загалом стосується антитіл, описаних в Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995). Стисло, ці антитіла включають пари тандемних Fd сегментів (VH-CH1VH-CH1), які, разом з комплементарними поліпептидами легкого ланцюга, формують пари антиген-зв'язуючих ділянок. Лінійні антитіла можуть бути біспецифічними або моноспецифічними. Папаїнове розщеплення антитіл створює два ідентичних антиген-зв'язуючих фрагменти під назвою "Fab" фрагменти, і залишковий "Fc" фрагмент, позначення, що відображає здатність легко кристалізуватись. Fab фрагмент складається із всього L ланцюга разом з варіабельним доменом ділянки H ланцюга (VH), і першим константним доменом одного важкого ланцюга (CH1). Кожний Fab фрагмент є одновалентним щодо зв'язування антигену, тобто, він має єдину антиген-зв'язуючу ділянку. Пепсинова обробка антитіла призводить до отримання єдиного великого F(ab')2 фрагменту, який приблизно відповідає двом дисульфіднозв'язаним Fab фрагментам, що мають двовалентну антиген-зв'язуючу активність і все ще мають здатність до поперечного з'єднання антигену. Fab' фрагменти відрізняються від Fab фрагментів наявністю кількох додаткових залишків на карбоксикінці домену CH1, що включає один або кілька цистеїнів із шарнірної ділянки антитіла. Fab'-SH - вжите авторами позначення для Fab', у якому цистеїновий(і) залишок (ки) константних доменів несуть вільну тіолову групу. F(ab') 2 фрагменти антитіла спочатку були отримані як пари Fab' фрагментів, які мають шарнірні цистеїни між ними. Також відомі інші хімічні сполучення фрагментів антитіла. Fc Фрагмент включає карбоксикінцеві частини обох H ланцюгів, що утримуються разом дисульфідами. Ефекторні функції антитіл визначаються послідовностями в Fc ділянці, ділянка якої також є частиною, що розпізнається Fc рецепторами (FcR), знайденими на певних типах клітин. "Fv" - мінімальний фрагмент антитіла, що містить повну ділянку розпізнання й зв'язування антигену. Цей фрагмент складається з димеру домена варіабельної ділянки одного важкого і одного легкого ланцюга у тісній, не ковалентній асоціації. Внаслідок згортання цих двох доменів виділяють шість гіперваріабельних петель (по 3 петлі від H і L ланцюга), які вносять амінокислотні залишки для зв'язування антигену й обумовлюють антиген-зв'язуючу специфічність антитіла. Однак, навіть єдиний варіабельний домен (або половина Fv, що включає тільки три CDR, специфічні для антигену) має здатність розпізнавати й зв'язувати антиген, хоча при нижчій афінності ніж вся зв'язуюча ділянка. "Одноланцюговий Fv", що також скорочується як "sFv" або "scFv" - фрагменти антитіла, які включають VH і VL домени антитіла, зв'язані у єдиний поліпептидний ланцюг. Бажано, щоб sFv поліпептид додатково включав поліпептидний лінкер між VH і VL доменами, що дозволяє sFv формувати бажану структуру для зв'язування антигену. Для огляду sFv, див. Pluckthun in The 16 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, ст. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, нижче. Термін "дiaтіла" стосується маленьких фрагментів антитіла, отриманих шляхом конструювання sFv фрагментів (див. попередній параграф) з короткими лінкерами (приблизно 5-10 залишків) між VH і VL доменами таким чином, щоб досягти міжланцюгового, але не внутрішньоланцюгового спарювання V доменів, що призводить до отримання двовалентного фрагмента, тобто, фрагмента, що має дві антиген-зв'язуючі ділянки. Біспецифічні дiaтіла гетеродимери двох sFv фрагментів, "що пересікаються", у яких VH і VL домени цих двох антитіл присутні на різних поліпептидних ланцюгах. Діатіла описані більш повно в, наприклад, ЕР 404 097; WO 93/11161; і Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). "Гуманізовані" форми нелюдських (наприклад, гризуна) антитіл - химерні антитіла, які містять мінімальну послідовність, отриману з нелюдського антитіла. Головним чином, гуманізовані антитіла - людські імуноглобуліни (антитіло реципієнт), у яких залишки від гіперваріабельної ділянки реципієнта замінені залишками від гіперваріабельної ділянки нелюдського виду (антитіло донор), такого як миша, щур, кролик або нелюдський примат, що має бажану специфічність, афінність, і здатність антитіла. У деяких випадках, залишки каркасної ділянки (FR) людського імуноглобуліну заміщені відповідними нелюдськими залишками. Крім того, гуманізовані антитіла можуть включати залишки, які не знайдені в антитілі донора або в антитілі реципієнта. Ці модифікації зроблені, що додатково очистити функціональність антитіла. Взагалі, гуманізоване антитіло буде включати практично всі з принаймні одного, і типово двох, варіабельних доменів, у яких всі або практично всі гіперваріабельні петлі відповідають таким з нелюдського імуноглобуліну й всі або практично всі FR є такими з людської імуноглобулінової послідовності. Гуманізоване антитіло довільно також буде включати принаймні частину імуноглобулінової константної ділянки (Fc), типово такої з людського імуноглобуліну. Для подальших деталей, див. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); і Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). "Видозалежне антитіло" є антитілом, що має більш сильну зв'язуючу афінність до антигену від першого виду ссавця, ніж воно має для гомолога того антигену від другого виду ссавця. Звичайно, видозалежне антитіло "зв'язується специфічно" з людським антигеном (тобто, має -7 величину зв'язуючої афінності (Kd), що становить не більше ніж приблизно 1×10 М, бажано не -8 -9 більше ніж приблизно 1×10 і найбільш бажано не більше ніж приблизно 1×10 M), але має зв'язуючу афінність до гомолога антигену від другого нелюдського виду ссавця, що є принаймні приблизно 50-кратно, або принаймні приблизно 500-кратно, або принаймні приблизно 1000кратно, слабшою ніж його зв'язуюча афінність до людського антигену. Видозалежне антитіло може бути будь-яким з різних типів антитіл, визначених вище, але бажано є гуманізованим або людським антитілом. У таких варіантах втілення ступінь зв'язування поліпептида, антитіла, антагоніста або композиції до "немішеневого" білка буде меншим ніж приблизно 10 % зв'язування поліпептида, антитіла, антагоніста або композиції до його специфічного мішеневого білка, що визначається аналізом сортування флюоресцентноактивованих клітин (FACS-fluorescence activated cell sorting) або радіоімунопреципітацією (RIA). Щодо зв'язування поліпептида, антитіла, антагоніста або композиції із мішеневою молекулою, термін "специфічне зв'язування" або "специфічно зв'язується з" або "специфічний для" певного поліпептида або епітопа на певній поліпептидній мішені означає зв'язування, що відомою мірою відрізняється від неспецифічної взаємодії. Специфічне зв'язування може бути визначене, наприклад, шляхом визначення зв'язування молекули в порівнянні зі зв'язуванням контрольної молекули, що взагалі є молекулою подібної структури, що не має зв'язуючої активності. Наприклад, специфічне зв'язування може бути визначене шляхом конкуренції з контрольною молекулою, що є подібною до мішені, наприклад, надлишку неміченої мішені. У цьому випадку, специфічне зв'язування відзначається, якщо зв'язування міченої мішені із зондом конкурентно інгібується надлишком неміченої мішені. Термін "специфічне зв'язування" або "специфічно зв'язується з" або "специфічний для" певного поліпептида або епітопа на певній поліпептидній мішені, що використовується авторами, може бути продемонстрований, наприклад, молекулою, що має Kd для мішені, що становить -4 -5 принаймні приблизно 10 М, альтернативно принаймні приблизно 10 М, альтернативно -6 -7 принаймні приблизно 10 М, альтернативно принаймні приблизно 10 М, альтернативно -8 -9 принаймні приблизно 10 М, альтернативно принаймні приблизно 10 М, альтернативно -10 -11 принаймні приблизно 10 М, альтернативно принаймні приблизно 10 М, альтернативно -12 принаймні приблизно 10 М або більше. В одному варіанті втілення термін "специфічне зв'язування" стосується зв'язування, при якому молекула зв'язується зі специфічним 17 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліпептидом або епітопом на специфічному поліпептиді, практично не зв'язуючись ні з яким іншим поліпептидом або поліпептидним епітопом. "Ефекторні функції" антитіла стосуються тих біологічних активностей, що відносяться до Fc ділянки (Fc ділянка нативної послідовності або Fc ділянка варіанта амінокислотної послідовності) антитіла, і відрізняється в залежності від ізотипу антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіла включають: зв'язування C1q і комплемент-залежну цитотоксичність; зв'язування Fc рецептора; антитіло-залежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; низхідну регуляцію рецепторів клітинної поверхні; і активацію B клітин. “ Fc ділянка нативної послідовності" включає амінокислотну послідовність, ідентичну амінокислотній послідовності Fc ділянки, знайденій у природі. Приклади Fc послідовностей описані в, наприклад, крім інших, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "Варіантна Fc ділянка" включає амінокислотну послідовність, що відрізняється від такої з Fc ділянки нативної послідовності на підставі принаймні однієї “ амінокислотної модифікації ” як визначено авторами. Бажано, варіантна Fc ділянка має принаймні одну заміну амінокислоти у порівнянні з Fc ділянкою нативної послідовності або Fc ділянкою батьківського поліпептида, наприклад від приблизно однієї приблизно до десяти замін амінокислот, і бажано від приблизно однієї приблизно до п'яти замін амінокислот в Fc ділянці нативної послідовності або в Fc ділянці батьківського поліпептида. В одному варіанті втілення варіантна Fc ділянка, описана авторами, буде мати принаймні приблизно 80 % гомологічність, принаймні приблизно 85 % гомологічність, принаймні приблизно 90 % гомологічність, принаймні приблизно 95 % гомологічність або принаймні приблизно 99 % гомологічність з Fc ділянкою нативної послідовності. Відповідно до іншого варіанта втілення варіантна Fc ділянка, описана авторами, буде мати принаймні приблизно 80 % гомологічність, принаймні приблизно 85 % гомологічність, принаймні приблизно 90 % гомологічність, принаймні приблизно 95 % гомологічність або принаймні приблизно 99 % гомологічність з Fc ділянкою батьківського поліпептида. "Відсоток (%) ідентичності амінокислотної послідовності" або "гомологічність" щодо поліпептидних послідовностей і послідовностей антитіл, ідентифікованих авторами, визначається як відсоток амінокислотних залишків в послідовності-кандидаті, які є ідентичними амінокислотним залишкам в порівнюваному поліпептиді, після вирівнювання послідовностей, враховуючи будь-які консервативні заміщення як частину ідентичності послідовності. Вирівнювання з метою визначення відсотка ідентичності амінокислотної послідовності можна досягти різними способами, які є в межах навичок в даній галузі, наприклад, використовуючи загально доступне програмне забезпечення, таке як програмне забезпечення BLAST, BLAST-2, ALIGN або Megalign (DNASTAR). Кваліфіковані спеціалісти в даній галузі можуть визначити відповідні параметри для виміру вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по повній довжині порівнюваних послідовностей. Однак, з цією метою, % значення ідентичності амінокислотної послідовності отримують, використовуючи комп'ютерну програму порівняння послідовності ALIGN-2. Комп'ютерна програма порівняння послідовності ALIGN-2 була авторизована Genentech, Inc, і вихідний код був поданий з документацією користувача в Бюро реєстрації авторських прав США, Вашингтон D.C., 20559, де вона зареєстрована за номером реєстрації авторських прав США TXU510087. Програма ALIGN-2 є загально доступною через Genentech, Inc, Південний Сан-Франциско, Каліфорнія. Програма ALIGN-2 повинна бути зібрана для застосування на операційній системі UNIX, переважно цифровій UNIX V4.0D. Всі параметри порівняння послідовності встановлюються програмою ALIGN-2 і не змінюються. Термін "поліпептид, що включає Fc ділянку" стосується поліпептиду, такого як антитіло або імуноадгезин (див. визначення нижче), що включає Fc ділянку. C-кінцевий лізин (залишок 447 відповідно до системи нумерації ЄС) Fc ділянки може бути вилучений, наприклад, протягом очищення поліпептида або, шляхом рекомбінантної інженерії нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид. Відповідно, композиція, що включає поліпептиди, включаючи антитіла, які мають Fc ділянку відповідно до цього винаходу може включати популяції поліпептидів з вилученими усіма залишками K447, популяції поліпептидів без вилучених залишків K447 або популяції поліпептидів, що мають суміш поліпептидов з залишком K447 і без нього. У даній специфікації й формулі винаходу, взагалі використовується система нумерації Kabat щодо залишку у варіабельному домені (приблизно, залишки 1-107 легкого ланцюга й залишки 1113 важкого ланцюга) (наприклад, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "Система нумерації ЄС" або "індекс ЄС" взагалі використовується по відношенню до залишку в константній ділянці імуноглобулінового важкого ланцюга (наприклад, індекс ЄС, що повідомляється в Kabat et al., 18 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), що спеціально включений авторами шляхом посилання). Якщо авторами не вказано інакше, посилання на номери залишків у варіабельному домені антитіл означають нумерацію залишків за системою нумерації Kabat. Якщо авторами не вказано інакше, посилання на номери залишків в константному домені антитіл означають нумерацію залишків за системою нумерації ЄС. Терміни "Fc рецептор " або "FcR" вживаються для опису рецептора, що зв'язується з Fc ділянкою антитіла. В одному варіанті втілення FcR цього винаходу - такий, що зв'язується з IgG антитілом (гама рецептор) і включає рецептори підкласів FcγRI, FcγRII і FcγRIII, включаючи алельні варіанти й альтернативно сплайсингові форми цих рецепторів. FcγRII рецептори включають FcγRIIA ("активуючий рецептор") і FcγRIIB ("інгібуючий рецептор"), які мають подібні амінокислотні послідовності, що відрізняються насамперед своїми цитоплазматичними доменами. Активуючий рецептор FcγRIIA містить імунорецепторний тирозиновий активаційний мотив (ITAM) у своєму цитоплазматичному домені. Інгібуючий рецептор FcγRIIB містить імунорецепторний тирозиновий інгібуючий мотив (ITIM) у своєму цитоплазматичному домені. (див. огляд M. в Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Термін включає аллотипи, такі як аллотипи FcγRIIIA: FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIA-Val158, FcγRIIA-R131 і/або FcγRIIA-H131. FcR розглянуті в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Інші FcR, включаючи ті, які будуть ідентифіковані у майбутньому, охоплюються авторами терміном "FcR". Термін також включає неонатальний рецептор, FcRn, що відповідає за передачу материнського IgG до плода (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). Термін "FcRn" стосується неонатального Fc рецептора (FcRn). FcRn структурно подібний до головного комплексу гістосумісності (MHC) і складається з α-ланцюга, нековалентно зв'язаного з β2-мікроглобуліном. Багаточисельні функції неонатального Fc рецептора FcRn розглянуті в Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766. FcRn відіграє роль у пасивній поставці імуноглобулінів IgG від матері до дитини й регулюванні сироваткових рівнів IgG. FcRn може діяти як рецептор порятунку, зв'язуючи й транспортуючи піноцитозовані IgG в інтактній формі у межах і крізь клітини, і рятуючи їх від дефолтного деградаційного шляху. WO00/42072 (Presta) і Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) описують варіанти антитіл з покращеним або зменшеним зв'язуванням з FcR. Зміст цих публікацій спеціально включений авторами шляхом посилання. "CH1 домен" Fc ділянки людського IgG (також зазначається як "C1" "H1" домену) звичайно простирається від приблизно амінокислоти 118 до приблизно амінокислоти 215 (система нумерації ЄС). "Шарнірна ділянка" взагалі визначається як проміжок від Glu216 до Pro230 людського IgG1 (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). Шарнірні ділянки інших ізотипів IgG можуть бути вирівняні з послідовністю IgG1 шляхом розміщення першого й останнього залишків цистеїну, що формують зв'язки S-S між тяжкими ланцюгами у тих же самих положеннях. "Нижча шарнірна ділянка" Fc ділянки звичайно визначається як проміжок залишків, одразу ж після C-кінця до шарнірної ділянки, тобто залишки 233-239 Fc ділянки. У попередніх повідомленнях, зв'язування FcR взагалі відноситься до амінокислотних залишків в нижчій шарнірній ділянці Fc ділянки IgG. "CH2 домен" Fc ділянки людського IgG (також зазначається як "C2" "H2" домену) звичайно простирається від приблизно амінокислоти 231 до приблизно амінокислоти 340. CH2 домен є унікальним в тому, він не є тісно спареним з іншим доменом. Скоріше, два N-зв'язаних розгалужених вуглеводневих ланцюга вставлені між двома CH2 доменами інтактної нативної молекули IgG. Вважалось, що вуглевод може забезпечити заміну для спарювання домен-домен, і допомагає стабілізувати CH2 домен. Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985). "CH3 домен" (також зазначається як "C2" або "H3" домен) включає проміжок C-кінця залишків до CH2 домену в Fc ділянці (тобто від приблизно амінокислотного залишку 341 до Cкінця послідовності антитіла, типово в амінокислотному залишку 446 або 447 IgG) "Функціональна Fc ділянка" має "ефекторну функцію" Fc ділянки нативної послідовності. Приклади "ефекторних функцій" включають C1q зв'язування; комплемент-залежну цитотоксичність; зв'язування Fc рецептора; антитіло-залежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; низхідну регуляції рецепторів клітинної поверхні (наприклад, B-клітинного рецептора; BCR) і т.д. Такі ефекторні функції взагалі вимагають, щоб Fc ділянка об'єднувалась зі зв'язуючим доменом (наприклад, варіабельним доменом антитіла) і можуть оцінюватись шляхом застосування різних випробувань, наприклад, розкритих авторами. 19 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "C1q" - поліпептид, що включає зв'язуючий сайт для Fc ділянки імуноглобуліну. C1q разом із двома серинпротеазами, C1r і C1s, формує комплекс C1, перший компонент шляху комплементзалежної цитотоксичності (CDC). Людський C1q може бути придбаний комерційно у, наприклад, Quidel, Сан-Дієго, Каліфорнія. Термін "зв'язуючий домен" стосується ділянки поліпептида, що зв'язується з іншою молекулою. У випадку FcR, зв'язуючий домен може включати частину його поліпептидного ланцюга (наприклад, його альфа ланцюга), що відповідає за зв'язування Fc ділянки. Один корисний зв'язуючий домен - позаклітинний домен FcR альфа ланцюга. Антитіло або пептитіло з варіантною IgG Fc зі "зміненою" FcR зв'язуючою афінністю або активністю ADCC є таким, що має збільшену або зменшену FcR зв'язуючу активність (наприклад, FcγR або FcRn) і/або активність ADCC у порівнянні з батьківським поліпептидом або поліпептидом, що включає Fc ділянку нативної послідовності. Варіантна Fc, що "показує збільшене зв'язування" з FcR, зв'язується з принаймні одним FcR з вищою афінністю (наприклад, нижчою очевидною Kd або IC50 величиною) ніж батьківський поліпептид або нативна послідовність IgG Fc. Відповідно до деяких варіантів втілення покращення зв'язування в порівнянні з батьківським поліпептидом є приблизно 3-кратним, бажано приблизно 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200, до 500-кратним, або приблизно від 25 % до 1000 % покращенням зв'язування. Поліпептидний варіант, що "показує зменшене зв'язування" з FcR, зв'язується з принаймні одним FcR з нижчою афінністю (наприклад, вищою очевидного Kd або вищою IC50 величини) ніж батьківський поліпептид. Зменшення зв'язування в порівнянні з батьківським поліпептидом може бути приблизно 40 % або більшим зменшенням зв'язування. "Антитіло-залежна клітинно-опосередкована цитотоксичність" або "ADCC" стосується форми цитотоксичності, у якій секретований Ig, зв'язаний з Fc рецепторами (FcR) присутніми на певних цитотоксичних клітинах (наприклад, природніх клітинах-кілерах (NK), нейтрофілах і макрофагах) дозволяє цим цитотоксичним ефекторним клітинам специфічно зв'язуватись із мішеневою клітиною, що несе антиген, і згодом убивати мішеневу клітину цитотоксинами. Антитіла "озброюють" цитотоксичні клітини й абсолютно необхідні для такого вбивства. Первинні клітини для опосередковування ADCC, клітини NK, експресують тільки FcγRIII, тоді як моноцити експресують FcγRI, FcγRII і FcγRIII. Експресія FcR на гематопоетичних клітинах підсумована в Таблиці 3 на сторінці 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Щоб оцінити активність ADCC молекули, що розглядається, може бути виконане випробування ADCC in vitro, таке як описане в патенті США №№ 5 500 362 або 5 821 337 або в Прикладах нижче. Корисні ефекторні клітини для такого випробування включають мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) і природні клітини-кілери (NK). Альтернативно, або додатково, активність ADCC молекули, що розглядається, може бути оцінена in vivo, наприклад, на тваринній моделі, такій як описана в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Поліпептид, що включає варіантну Fc ділянку, що "показує збільшену ADCC" або опосередковує антитіло-залежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (ADCC) у присутності людських ефекторних клітин більш ефективно ніж поліпептид, що має Fc IgG дикого типу або батьківський поліпептид є таким, котрий in vitro або in vivo є значною мірою більш ефективним при опосередковуванні ADCC, коли кількості поліпептида з варіантною Fc ділянкою і поліпептида з Fc ділянкою дикого типу (або батьківський поліпептид) у випробуванні практично ті ж самі. Взагалі, такі варіанти будуть ідентифіковані, використовуючи випробування ADCC in vitro, описане авторами, проте розглядаються інші випробування або методи для визначення активності ADCC, наприклад на тваринній моделі і т.д, . В одному варіанті втілення оптимальний варіант є приблизно від 5-кратно приблизно до 100-кратно, наприклад від приблизно 25 приблизно до 50-кратно, більш ефективним при опосередковуванні ADCC ніж Fc дикого типу (або батьківський поліпептид). "Комплемент-залежна цитотоксичність" або "CDC" стосується лізису мішеневої клітини в присутності комплементу. Активація класичного шляху комплементу ініціюється шляхом зв'язування першого компонента системи комплементу (C1q) до антитіл (відповідного підкласу), які зв'язуються з їхнім родинним антигеном. Для оцінки активації комплементу, може бути виконане випробування CDC, наприклад як описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Поліпептидні варіанти зі зміненими амінокислотними послідовностями Fc ділянки і збільшеною або зменшеною C1q зв'язуючою здатністю описані в патенті США № 6 194 551B1 і WO99/51642. Зміст цих патентних публікацій спеціально включений авторами шляхом посилання. Див., також, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). "Людські ефекторні клітини" є лейкоцитами, які експресують один або кілька FcR і виконують ефекторні функції. Відповідно до одного варіанта втілення клітини експресують 20 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 принаймні FcγRIII і виконують ADCC ефекторну функцію. Приклади людських лейкоцитів, які опосередковують ADCC, включають мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC), природні клітини-кілери (NK), моноцити, цитотоксичні T клітини і нейтрофіли; причому PBMC і NK клітини є оптимальними. Ефекторні клітини можуть бути ізольованими з їх нативного джерела, наприклад із крові або PBMC, описаних авторами. Відомі методи визначення зв'язування з FcRn (див., наприклад, Ghetie 1997, Hinton 2004), а також описані у Прикладах нижче. Зв'язування з людським FcRn in vivo і періол напіввиведення із сироватки поліпептидів, зв'язуючих людський FcRn з високою афінністю, можуть бути оцінені, наприклад, на трансгенних мишах або трансфекованих клітинних лініях людини, що експресують людський FcRn, або на приматах, яким вводять Fc варіантні поліпептиди. В одному варіанті втілення специфічно анти-альфа5бета1 антитіла винаходу, що мають варіантний IgG Fc, демонструють збільшену зв'язуючу афінність до людського FcRn у порівнянні з поліпептидом, що має IgG Fc дикого типу, принаймні 2-кратно, принаймні 5-кратно, принаймні 10-кратно, принаймні 50-кратно, принаймні 60-кратно, принаймні 70-кратно, принаймні 80кратно, принаймні 100-кратно, принаймні 125-кратно, принаймні 150-кратно. У певному варіанті втілення зв'язуюча афінність до людського FcRn збільшена приблизно 170-кратно. Для зв'язуючої афінності до FcRn в одному варіанті втілення EC50 або очевидна Kd (при pH 6.0) поліпептида є меншою ніж 1 мкM, більш бажано меншою ніж або рівною 100 нМ, більш бажано меншою ніж або рівною 10 нМ. В одному варіанті втілення для збільшеної зв'язуючої афінності до FcγRIII (F158; тобто ізотип низької афінності), EC50 або очевидна Kd є меншою ніж або рівною 10 нМ, і для FcγRIII (V158; ізотип високої афінності), EC50 або очевидна Kd є меншою ніж або рівною 3 нМ. Відповідно до іншого варіанта втілення скорочення зв'язування антитіла до Fc рецептора щодо контрольного антитіла (наприклад, антитіла Герцептин®) можна вважати значним щодо контрольного антитіла, якщо співвідношення величин абсорбції у серединних точках кривих зв'язування випробовуваного антитіла й контрольного антитіла (наприклад, A450 нм (антитіло)/A450 нм (контрольне Ab)) є меншим ніж або рівним 40 %. Відповідно до іншого варіанта втілення збільшення зв'язування антитіла з Fc рецептором щодо контрольного антитіла (наприклад, антитіла Герцептин®) можна вважати значним щодо контрольного антитіла, якщо співвідношення величин абсорбції у серединних точках кривих зв'язування випробовуваного антитіла й контрольного антитіла (наприклад, A 450 нм (антитіло)/A450 нм (контрольне Ab)) є більшим ніж або рівним 125 %. Див., наприклад, Приклад 16. "Батьківський поліпептид" або "батьківське антитіло" є поліпептидом або антитілом, що включає амінокислотну послідовність, з якої виникли варіантний поліпептид або антитіло й з яким порівнюються варіантний поліпептид або антитіло. Типово, у батьківському поліпептиді або батьківському антитілі бракує однієї або кількох модифікацій Fc ділянки, описаних авторами, і вони відрізняються за ефекторними функціями в порівнянні з поліпептидним варіантом, розкритим авторами. Батьківський поліпептид може включити Fc ділянку нативної послідовності або Fc ділянку з попередньо існуючими модифікаціями амінокислотної послідовності (такими як доповнення, делеції і/або заміни). Антитіла цього винаходу можуть бути отримані з фагового дисплею. Вжитий авторами термін "бібліотека" стосується безлічі послідовностей антитіл або фрагментів антитіл, або нуклеїнових кислот, які кодують ці послідовності, послідовності, що відрізняються комбінацією варіантних амінокислот, які уведені в ці послідовності відповідно до способів винаходу. "Фаговий дисплей" є технікою, за якою різні поліпептиди показуються як злиті білки із принаймні частиною білка оболонки на поверхні фага, наприклад, волокнистого фага, часток. Корисність фагового дисплея полягає у факті, що великі бібліотеки рандомізованих варіантів білків можуть швидко й ефективно сортуватись для тих послідовностей, які зв'язуються із мішеневим антигеном з високою афінністю. Дисплей пептидних й білкових бібліотек на фазі використовувався для скринінгу мільйонів поліпептидів на ті, які мають специфічні зв'язуючі властивості. Полівалентні методи фагового дисплею використовувалися для дисплею маленьких випадкових пептидів й маленьких білків через злиття або з геном III або з геном VIII волокнистого фага. Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362 (1992), і посилання, процитовані авторами. При одновалентному фаговому дисплеї, білкова або пептидна бібліотека зливається із геном III або його частиною, і експресується на низьких рівнях у присутності білків гена дикого типу III таким чином, щоб частки фага показали одну копію або відсутність злитих білків. Ефекти авідності зменшуються по відношенню до полівалентного фага таким чином, щоб сортування було на основі власної афінності ліганда, і використовуються фагемідні вектори, які спрощують маніпуляції з ДНК. Lowman and Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991). 21 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Фагемід" - плазмідний вектор, що має бактеріальне походження реплікації, наприклад, Co1E1, і копія інтергенної ділянки бактеріофага. Фагемід може використовуватися на будьякому відомому бактеріофазі, включаючи волокнистий бактеріофаг і лямбдоїдний бактеріофаг. Плазміда буде також взагалі містити селектабельний маркер для антибіотикорезистентності. Сегменти ДНК, клоновані в ці вектори, можуть бути поширені у вигляді плазмід. Коли клітини, що містять ці вектори, забезпечуються всіма генами, необхідними для виробництва фагових часток, спосіб реплікації плазміди змінюється на реплікацію кола, що котиться, щоб отримати копії однієї спіралі ДНК плазміди й фагових часток пакета. Фагемід може формувати інфекційні або неінфекційні фагові частки. Цей термін включає фагеміди, які містять ген білка фагової оболонки або його фрагмент, пов'язаний з геном гетерологічного поліпептида у вигляді генного злиття таким чином, що гетерологічний поліпептид показується на поверхні частки фага. Термін "фаговий вектор" означає подвійно-спіральну реплікативну форму бактеріофага, що містить гетерологічний ген і здатний до реплікації. Фаговий вектор має фагове походження реплікації, що дозволяє фагову реплікацію й формування фагової частки. Фаг бажано є волокнистим бактеріофагом, таким як M13, f1, fd, Pf3 фаг або його похідне, або лямбдоїдним фагом, таким як лямбда, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, і т.д., або його похідне. Ковалентні модифікації поліпептидів, такі як пептитіла, імуноадгезини, антитіла і короткі пептиди, включені в рамки цього винаходу. Один тип ковалентної модифікації включає реакції мішеневих амінокислотних залишків поліпептида з органічним дериватизуючим агентом, що має здатність до реакції з відібраними бічними ланцюгами або N- чи C-кінцевими залишками поліпептида. Дериватизація за допомогою біфункціональних агентів корисна, наприклад, для поперечного зшивання поліпептида із водонерозчинною підтримуючою матрицею або поверхнею для застосування в методі для очистки антитіл, і навпаки. Агенти для поперечного зшивання, що звичайно використовуються, включають, наприклад, 1,1-біс(дiaзoацетил)-2фeнілeтан, глутаральдегід, N-гідроксисукцинімідні eстери, наприклад, eстери з 4азидосаліциловою кислотою, гомобіфункціональні імідoестери, включаючи дисукцинімідильні естери, такі як 3,3'-дитіобіс(сукцинімідилпропіонат), біфункціональні малеіміди, такі як біс-Nмалеiмiдo-1,8-oктан і агенти, такі як метил-3-[(п-азидoфеніл)дитіо] пропіоімідат. Інші модифікації включають дезамідування глутамінілових і аспарагінілових залишків до відповідних глутамілових і аспартилових залишків, відповідно, гідроксилювання проліна й лізину, фосфорилювання гідроксильних груп серинових або треонілових залишків, метилювання α-аміно групи бічних ланцюгів лізину, аргініну, і гістидину [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, ст. 79-86 (1983)], ацетилювання Nкінцевого аміну, та амідування будь-якої C-кінцевої карбоксигрупи. Інші модифікації включають кон'югацію токсинів з антагоністами, такими як майтанзин і майтанзиноїди, каліхеаміцин та інші цитотоксичні агенти. Інший тип ковалентної модифікації поліпептида включає з'єднання поліпептида з одним із низки небілкових полімерів, наприклад, поліетиленгліколем (ПЕГ), поліпропіленгліколем або поліoксиалкіленами, у спосіб, сформульований в Патенті США № 4 640 835; 4 496 689; 4 301 144; 4 670 417; 4 791 192 або 4 179 337. Поліпептид даного винаходу може також бути модифікований, якщо це вигідно, у спосіб, щоб сформувати химерну молекулу, що включає поліпептид, злитий з іншим, гетерологічним поліпептидом або амінокислотною послідовністю (наприклад, імуноадгезини або пептитіла). В одному варіанті втілення така химерна молекула включає злиття поліпептида з доменом трансдукції білка, що спрямовує поліпептид для доставки у різні тканини і більш докладно через гематоенцефалічний бар'єр, використовуючи, наприклад, домен трансдукції білка ТАТ білка вірусу імунодефіциту людини (Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569-72). В іншому варіанті втілення така химерна молекула включає злиття поліпептида із таговим поліпептидом, що забезпечує епітоп, до якого може селективно зв'язуватися анти-таг антитіло. Таг епітопа взагалі міститься на аміно- або карбоксильному кінці поліпептида. Присутність таких епітоп-тагових форм поліпептида може бути виявлено шляхом застосування антитіла проти тагового поліпептида. Крім того, забезпечення тага епітопа дозволяє поліпептиду бути легко очищеним афінною очисткою з застосуванням анти-таг антитіла або іншого типу матриці афінності, що зв'язується з тагом епітопа. В галузі відомі різні тагові поліпептиди і їхні відповідні антитіла. Приклади включають полігістидинові (полі-His) або полі-гістидин-гліцинові (полі-Hisgly) таги; flu HA таговий поліпептид і його антитіло 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; c-myc таг і 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 і 9E10 антитіла до нього [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; і таг гликопротеїна D вірусу герпеса простого (gD) і його антитіло [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Інші тагові поліпептиди включають Flag-пептид [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; пептид епітопа KT3 22 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; пептид α-тубулінового епітопу [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; і таг пептиду білка 10 гена T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]. В альтернативному варіанті втілення химерна молекула може включати злиття поліпептида з імуноглобуліном або специфічною ділянкою імуноглобуліну. Для бівалентної форми химерної молекули (наприклад, "імуноадгезин"), таке злиття може бути із Fc ділянкою молекули IgG. Ig злиття цього винаходу включають поліпептиди, які містять приблизно або тільки залишки 94243, залишки 33-53 або залишки 33-52 людини замість принаймні однієї варіабельної ділянки в межах молекули Ig. В особливо оптимальному варіанті втілення злиття імуноглобуліну включає шарнір, CH2 і CH3, або шарнір, CH1, CH2 і CH3 ділянки молекули IgG1. Для ознайомлення з виробництвом злиття імуноглобуліну див. також, патент США № 5 428 130, опублікований 27 червня 1995 году. Винахід пропонує способи й композиції для інгібування або профілактики росту рецидивуючої пухлини або росту рецидивуючих ракових клітин. У різних варіантах втілення рак є ростом рецидивуючої пухлини або ростом рецидивуючих ракових клітин, при якому число ракових клітин не було значно зменшене або збільшилося, або розмір пухлини не був значно зменшений або збільшився, або не вдається будь-яке подальше скорочення розміру або числа ракових клітин. Визначення того, чи є ракові клітини ростом рецидивуючої пухлини або ростом рецидивуючих ракових клітин, може бути зроблене in vivo або in vitro будь-яким методом, відомим у даній галузі для оцінки ефективності лікування ракових клітин. Пухлина, резистентна до лікування анти-VEGF, є прикладом росту рецидивуючої пухлини. "Ефективна кількість" поліпептида, антитіла, антагоніста або композиції, описаних авторами, є кількістю, достатньою для виконання специфічно встановленої мети. "Ефективна кількість" може бути визначена емпірично і відомими методами, що стосуються встановленої мети. Термін "терапевтично ефективна кількість" стосується кількості антитіла, поліпептида або антагоніста цього винаходу, ефективної для "лікування" хвороби або розладу у ссавця (інакше пацієнта). У випадку раку терапевтично ефективна кількість препарату може зменшити число ракових клітин; зменшити розмір або масу пухлини; інгібувати (тобто, уповільнити певною мірою й бажано зупинити) інфільтрацію ракових клітин в периферичні органи; інгібувати (тобто, уповільнити певною мірою й бажано зупинити) пухлинний метастаз; інгібувати певною мірою, пухлинний ріст; і/або полегшити певною мірою один або кілька симптомів, зв'язаних з раком. До певного ступеня препарат може запобігати росту й/або вбивати існуючі ракові клітини, він може бути цитостатичним і/або цитотоксичним. В одному варіанті втілення терапевтично ефективна кількість - ростоінгібуюча кількість. В іншому варіанті втілення терапевтично ефективна кількість - кількість, що подовжує виживання пацієнта. В іншому варіанті втілення терапевтично ефективна кількість - кількість, що поліпшує виживання без прогресії пацієнта. У випадку загоєння рани, термін "ефективна кількість" або "терапевтично ефективна кількість" стосується кількості препарату, ефективної для прискорення або покращення загоєння рани у суб'єкта. Терапевтична доза є дозою, що показує терапевтичний ефект у пацієнта, і субтерапевтична доза - доза, що не показує терапевтичного ефекта у пацієнта, який лікується. "Хронічна рана" стосується рани, що не гоїться. Див., наприклад, Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130:489-93 (1994). Хронічні рани включають, крім інших, наприклад, артеріальні виразки, діабетичні виразки, виразки тиску, венозні виразки, і т.д. Гостра рана може розвинутися у хронічну рану. Гострі рани включають, крім інших, рани, викликані, наприклад, термальним ураженням, травмою, хірургією, вирізанням великого раку шкіри, глибокими грибковими й бактеріальними інфекціями, васкулітом, склеродермою, пемфігусом, токсичним епідермальним некролізом, і т.д. Див., наприклад, Buford, Wound Healing and Pressure Sores, HealingWell.com, опублікований: 24 жовтня 2001 р… "Нормальна рана" відноситься до рани, що піддається нормальному загоєнню рани. "Ростоінгібуюча кількість" поліпептида, антитіла, антагоніста або композиції цього винаходу - кількість, здатна до інгібування росту клітини, особливо пухлини, наприклад, ракової клітини, in vitro або in vivo. "Ростоінгібуюча кількість" поліпептида, антитіла, антагоніста або композиції цього винаходу для цілей інгібування росту неопластичних клітин може бути визначена емпірично і відомими методами або наданими авторами прикладами. "Цитотоксична кількість" поліпептида, антитіла, антагоніста або композиції цього винаходу кількість, здатна викликати руйнування клітини, особливо пухлини, наприклад, ракової клітини, in vitro або in vivo. "Цитотоксична кількість" поліпептида, антитіла, антагоніста або композиції 23 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цього винаходу для цілей інгібування росту неопластичних клітин може бути визначена емпірично і методами, відомими в даній галузі. "Аутоімунна хвороба", описана авторами, є хворобою або розладом, що є результатом і спрямований проти власних тканин особи або їх косегрегат або прояв або стан, що випливає з нього. Приклади аутоімунних хвороб або розладів включають, крім інших, артрит (ревматоїдний артрит, такий як гострий артрит, хронічний ревматоїдний артрит, подагричний артрит, гострий подагричний артрит, хронічний запальний артрит, дегенеративний артрит, інфекційний артрит, артрит Ліма, проліферативний артрит, псоріатичний артрит, вертебральний артрит і ювенільний ревматоїдний артрит, остеоартрит, хронічний прогресуючий артрит, деформуючий артрит, первинний хронічний поліартрит, реактивний артрит і анкілозуючий спондиліт), запальні гіперпроліферативні шкірні захворювання, псоріаз, такий як бляшковидний псоріаз, краплевидний псоріаз, пустулярний псоріаз і псоріаз нігтів, дерматит, включаючи контактний дерматит, хронічний контактний дерматит, алергійний дерматит, алергійний контактний дерматит, герпетиформний дерматит, і атопічний дерматит, x-зв'язаний гіпер IgM синдром, кропивниця, така як хронічна ідіопатична кропивниця, включаючи хронічну аутоімунну кропивницю, поліміозит/дeрмaтoміозит, ювенільний дерматоміозит, токсичний епідермальний некроліз, склеродерма (включаючи системну склеродерму), склероз, такий як системний склероз, розсіяний склероз (РС), такий як спінo-оптичний РС, первинний прогресуючий РС і рецидивуюче-ремітуючий РС, прогресуючий системний склероз, атеросклероз, артеріосклероз, диссемінуючий склероз і атаксичний склероз, запальна хвороба кишечника (IBD) (наприклад, хвороба Крона, коліт, такий як виразковий коліт, ульцерозний коліт, мікроскопічний коліт, колагенозний коліт, поліпозний коліт, некротизуючий ентероколіт, і трансмуральний коліт, і аутоімунна запальна хвороба кишечника), гангренозна піодерма, вузликувата еритема, первинний склерозуючий холангіт, епісклерит), синдром розладу дихання, включаючи дорослий або гострий синдром розладу дихання (АРДС), менінгіт, запалення всього або частини увеального тракту, ірит, хороїдит, аутоімунні гематологічні розлади, ревматоїдний спондиліт, раптова втрата слуху, IgЕ-опосередковані хвороби, такі як анафілаксія й алергійний та атопічний риніт, енцефаліт, такий як енцефаліт Расмуссена й лімбічний і/або стовбуровий енцефаліт, увеїт, такий як передній увеїт, гострий передній увеїт, гранульоматозний увеїт, негранульоматозний увеїт, фaкoантигенний увеїт, задній увеїт або аутоімунний увеїт, громерулонефрит (ГН) з нефротичним синдромом і без нього, такий як хронічний або гострий громерулонефрит, такий як первинний ГН, імуноопосередкований ГН, мембранозний ГН (мембранозна нефропaтія), ідіопатичний мембранозний ГН, мембранозний проліферативний ГН (MPGN), включаючи Тип І й Тип II, і швидкопрогресуючий ГН, алергійні стани, алергійна реакція, екзема, включаючи алергійну або атопічну екзему, астма, така як asthma bronchiale, бронхіальна астма і аутоімунна астма, стани, що включають інфільтрацію T клітин і хронічні запальні відповіді, хронічна легенева запальна хвороба, аутоімунний міокардит, дефіцит адгезії лейкоцитів, системний червоний вовчак (СЧВ - systemic lupus erythematosus) або systemic lupus erythematodes, такий як шкірний СЧВ, підгострий шкірний червоний вовчак, неонатальний червоний вовчак (НЧВ), диссемінуючий червоний вовчак, вовчак (включаючи нефрит, церебрит, педіатричний, ненирковий, дископодібний, алопецію), цукровий діабет з раннім початком (Типу I), включаючи дитячий інсулінозалежний цукровий діабет (IDDM), цукровий діабет з пізнім початком (діабет Типу II), аутоімунний діабет, ідіопатичний нецукровий діабет, імунні відповіді, пов'язані з гострою й відстроченою гіперчутливістю, опосередкованою цитокінами й TЛімфоцитами, туберкульоз, саркоїдоз, гранульоматоз, включаючи лімфоматоїдний гранульоматоз, гранульоматоз Вегенера, агранулоцитоз, васкулітіди, що включають васкуліт (включаючи васкуліт великих судин (включаючи ревматичну поліміальгію і гігантськоклітинний артериїт (Takayasu)), васкуліт середніх судин (включаючи хворобу Кавасакі й вузликуватий поліартериїт), мікроскопічний поліартериїт, васкуліт з боку ЦНС, некротизуючий, шкірний васкуліт або васкуліт гіперчутливості, системний некротизуючий васкуліт і ANCA-асоційований васкуліт, такий як васкуліт або синдром Чарга-Строса (CSS)), тимчасовий артериїт, апластична анемія, аутоімунна апластична анемія, позитивна анемія Кумбса, анемія Блекфана-Даймонда, гемолітична анемія або імуннна гемолітична анемія, включаючи аутоімунну гемолітичну анемію (AIHA), перниціозна анемія (anemia perniciosa), хвороба Еддісона, чисто тромбоцитарна анемія або аплазія (PRCA), дефіцит Фактора VIII, гемофілія A, аутоімунна нейтропенія, панцитопенія, лейкопенія, хвороби, що включаюють діапедезіз лейкоцитів, запальні розлади з боку ЦНС, синдром ураження багатьох органів, такий як внаслідок септицемії, травми або крововиливу, опосередковані комплексом антитіло-антиген хвороби, хвороба базальних мембран ниркових клубочків, синдром антифосфоліпідних антитіл, алергійний неврит, хвороба Бешеа, синдром Кастлемена, синдром Гудпасчера, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стівенса 24 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Джонсона, пемфігоїд, такий як бульозний пемфігоїд і шкірний пемфігоїд, пемфігус (включаючи pemphigus vulgaris, pemphigus foliaceus, pemphigus mucus-membrane, і pemphigus erythematosus), аутоімунні поліендокринопатії, хвороба або синдром Рейтера, імунокомплексний нефрит, антитілоопосередкований нефрит, хронічна невропатія, така як IgM поліневропатії або IgМ-опосередковані невропатії, тромбоцитопенія (що розвивається у пацієнтів з інфарктом міокарда, наприклад), включаючи тромбічну тромбоцитопенічну пурпуру (TTP) і аутоімунну або імуноопосередковану тромбоцитопенію, таку як ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура (ITP), включаючи хронічну або гостру ITP, аутоімунна хвороба яєчок і яєчника, включаючи аутоімунний орхіт і ooфорит, первинний гіпотиреоз, гіпопаратироїдизм, аутоімунні ендокринні хвороби, включаючи тироїдит, такий як аутоімунний тироїдит, хвороба Хашимото, хронічний тироїдит (тироїдит Хашимото), або підгострий тироїдит, аутоімунна хвороба щитовидної залози, ідіопатичний гіпотиреоз, хвороба Грейва, полігландулярні синдроми, такий як аутоімуні полігландулярні синдроми (або полігландулярні ендокринопатичні синдроми), паранеопластичні синдроми, включаючи неврологічні паранеопластичні синдроми, такі як міастенічний синдром Ламберта-Ітона або синдром Ламберта-Ітона, синдром м'язової скутості, енцефаломієліт, такий як алергійний енцефаломієліт або encephalomyelitis allergica і експериментальний алергійний енцефаломієліт (EAE), міастенія гравіс, мозочкова дегенерація, нейроміотонія, опсоклонус або синдром опсоклонус міоклонус (OMS) і сенсорна невропатія, синдром Шихана, аутоімунний гепатит, хронічний гепатит, люпоїдний гепатит, гігантськоклітинний гепатит, хронічний активний гепатит або аутоімунний хронічний активний гепатит, лімфатичний інтрастиціальний пневмоніт, chiolitis obliterans (нетрансплантатний) проти NSIP, синдром Гійєна-Баре, хвороба Бергера (IgA нефропaтія), ідіопатична IgA нефропaтія, лінійний IgA дерматоз, первинний жовчний цироз, пневмоноцироз, синдром аутоімунної ентеропатії, целіакійна хвороба, целіакія, целіакійне спру (глютенова ентеропатія), рефрактерне спру, ідіопатичне спру, кріоглобулінемія, aмілотрофічний латеральний склероз (ALS; Хвороба Лу Геріга), хвороба коронарної артерії, аутоімунна хвороба внутрішнього вуха (AIED), або аутоімунна втрата слуху, синдром opsoclonus myoclonus (OMS), поліхондрит, такий як рефрактерний або рецидивуючий поліхондрит, легеневий альвеолярний протеїноз, амілоїдоз, склерит, незлоякісний лімфоцитоз, первинний лімфоцитоз, що включає моноклональний B-клітинний лімфоцитоз (наприклад, доброякісна моноклональна гаммапатія і моноклональна гаммапатія невизначеного значення, MGUS), периферійна невропатія, паранеопластичний синдром, каналопатії, такі як епілепсія, мігрень, аритмія, м'язові розлади, глухота, сліпота, періодичний параліч, і каналопатії з боку ЦНС, аутизм, запальна міопатія, фокальний сегментарний гломерулосклероз (FSGS), ендокринна oфтaльмопатія, увеоретиніт, хоріоретиніт, аутоімунний гепатологічний розлад, фіброміальгія, множинна ендокринна недостатність, синдром Шмідта, aдрeналіт, шлункова атрофія, вікова деменція, демієлінізуючі хвороби, такі як аутоімунні демієлінізуючі хвороби, діабетична нефропaтія, синдром Дресслера, alopecia areata, синдром CREST (кальциноз, феномен Рейно, розлад езофагальної рухливості, склеродактилія і телангектазія), чоловіче й жіноче аутоімунне безпліддя, змішана сполучнотканинна хвороба, хвороба Чагаса, ревматична лихоманка, рецидивуючий аборт, легеня фермера, мультиформа еритема, посткардіотомічний синдром, синдром Кушинга, легеня "любителя птахів", алергійний гранулематозний ангіїт, доброякісний лімфоцитарний ангіїт, синдром Алпорта, альвеоліт, такий як алергійний альвеоліт і фіброзуючий альвеоліт, інтрастиціальна хвороба легені, трансфузійна реакція, лепра, малярія, лейшманіаз, кіпаносоміаз, шистосоміаз, аскаридоз, аспергільоз, синдром Самптера, синдром Каплана, лихоманка, ендокардит, ендоміокардіальний фіброз, дифузний інтрастиціальний легеневий фіброз, інтрастиціальний легеневий фіброз, ідіопатичний легеневий фіброз, кістозний фіброз, ендофтальміт, erythema elevatum et diutinum, erythroblastosis fetalis, еозинофільний фасциїт, синдром Шульмана, синдром Фелті, фларіаз, цикліт, такий як хронічний цикліт, гетерохронічний цикліт, iрiдoцикліт або цикліт Фача, пурпура Геноха-Шенлейна, інфекція вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), еховірусна інфекція, кардіоміопатія, хвороба Альцгеймера, парвовірусна інфекція, інфекція вірусом краснухи, синдроми після щеплення, вроджена інфекція краснухи, інфекція вірусом Епштейна-Барра, паротит, синдром Евана, аутоімунне ураження гонад, хорея Сиденхама, постстрептококковий нефрит, thromboangitis ubiterans, тиротоксикоз, tabes dorsalis, хоріоїдит, гігантськоклітинна поліміальгія, ендокринна офтальмопатія, хронічний пневмоніт гіперчутливості, keratoconjunctivitis sicca, епідемічний кератокон'юнктивіт, ідіопатичний нефротичний синдром, нефропaтія мінімальної зміни, доброякісне спадкове і ішемічнореперфузійне ураження, ретинальна аутоімунність, запалення суглобів, бронхіт, хронічна обстуктивна хвороба дихального тракту, силікоз, афти, афтозний стоматит, артеріосклеротичні розлади, асперміогенез, аутоімунний гемоліз, хвороба Бека, кріоглобулінемія, контрактура 25 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дюпюітрена, endophthalmia phacoanaphylactica, алергічний ентерит, erythema nodosum leprosum, ідіопатичний параліч обличчя, синдром хронічної втоми, febris rheumatica, хвороба Хеммена Річа, сенсонейральна втрата слуху, пароксизматична гемоглобінурія, гіпогонадизм, регіонарний ілеїт, лейкопенія, інфекційний мононуклеоз, поперечний мієліт, первинна ідіопатична мікседема, нефроз, ophthalmia symphatica, гранулематозний орхіт, панкреатит, гострий полірадикулит, гангренозна піодерма, тиреоїдит Кервена, набуда спенічна атрофія, безпліддя через антиспермальні антитіла, незлоякісна тимома, вітиліго, асоційовані зі SCID і вірусом ЕпштейнаБарра хвороби, синдром набутого імундефіциту (СНІД), паразитарні хвороби, такі як лейшманія, синдром токсичного щоку, харчове отруєння, стани, що включають інфільтрацію T клітин, дефіцит адгезії лейкоцитів, імунні відповіді, пов'язані з гострою й відстроченою гіперчутливістю, опосередкованою цитокінами й T-Лімфоцитами, хвороби, що включають діапедез лейкоцитів, синдром ураження багатьох органів, опосередковані комплексом антитіло-антиген хвороби, хвороба базальних мембран ниркових клубочків, алергійний неврит, аутоімунні поліендокринопатії, ooфорит, первинна мікседема, аутоімунний атрофічний гастрит, симпатетична офтальмія, ревматичні хвороби, змішана хвороба сполучних тканин, нефротичний синдром, інсуліт, поліендокринне ураження, периферична невропатія, аутоімунний полігландулярний синдром типу І, ідіопатичний гіпопаратироїдизм дорослих (AOIH), alopecia totalis, дилатаційна кардіоміопатія, epidermolisis bullosa acquisita (EBA), гемохроматоз, міокардит, нефротичний синдром, первинний склерозуючий холангіт, гнійний або негнійний синусит, гострий або хронічний синусит, етмоїдний, фронтальний, верхньощелепний, або сфеноїдний синусит, пов'язаний з еозинофілами розлад, такий як еозинофілія, легенева інфільтраційна еозинофілія, синдром еозинофілії-міальгії, синдром Лоффлера, хронічна еозинофільна пневмонія, тропічна легенева еозинофілія, бронхопневмонічний аспергільоз, аспергільома або гранульоми, що містять ацидофільні гранулоцити, анафілаксія, серонегативні спондилoaртритиди, поліендокринна аутоімунна хвороба, склерозуючий холангіт, склера, епісклера, хронічний мукошкірний кандидоз, синдром Брутона, транзиторна гіпогаммаглобулінемія дітей, синдром Wiskott-Aldrich, атаксія, телангектазія, аутоімунні розлади, пов'язані із колагеновою хворобою, ревматизмом, неврологічною хворобою, ішемічним реперфузійним розладом, зниженням артеріального тиску, судинна дисфункція, антгіектаз, ураження тканини, серцево-судинна ішемія, гіпералгезія, церебральна ішемія, і хвороба, що супроводжується васкуляризацією, алергійні розлади гіперчутливості, гломерулонефрити, реперфузійне ураження, реперфузійне ураження міокардіальних або інших тканин, дерматози з гострими запальними компонентами, гострий гнійний менінгіт або інші запальні розлади центральної нервової системи, пов'язані з переливанням гранулоцитарної маси синдроми, цитокін-індукована токсичність, гостре серозне запалення, хронічне тяжке запалення, пієліт, пневмоноцироз, діабетична ретинопатія, діабетичний розлад великої артерії, ендартеріальна гіпеплазія, пепсинова виразка, вальвуліти і ендометріоз. Протиракові терапії можуть бути оцінені, наприклад, крім інших, за регресією пухлини, масою пухлини або скороченням розміру, часом до прогресії, тривалістю виживання, виживанням без прогресії, показником загальної відповіді, тривалістю відповіді, якістю життя, експресією білка й/або активністю. Оскільки анти-ангіогенні агенти, описані авторами, спрямовані на васкулатуру пухлини й не обов'язково на неопластичні клітини безпосередньо, вони представляють унікальний клас протиракових препаратів, і тому можуть потребувати унікальних заходів і визначень клінічних відповідей на препарати. Наприклад, скорочення пухлини більше ніж на 50 % в 2-вимірному аналізі - стандартне скорочення для декларування наявності відповіді. Однак, альфа5бета1 антагоністи й VEGF антагоністи винаходу можуть викликати інгібування розповсюдження метастазів без скорочення первинної пухлини, або можуть просто виявляти канцеростатичний ефект. Відповідно, можуть використовуватися підходи до визначення ефективності терапії, включаючи наприклад, визначення плазмових або сечових маркерів ангіогінезу і визначення відповіді через радіологічну діагностику. Залежно від показання, яке лікується, і факторів, що стосуються дозування, з якими ознайомлений лікар, кваліфікований в даній галузі, антитіла винаходу можна вводити в дозуванні, що є ефективним для лікування такого показання, мінімізуючи токсичність і побічні ефекти. Для лікування раку, аутоімунної хвороби або хвороби імунодефіциту, терапевтично 2 ефективне дозування може бути, наприклад, у діапазоні від 50мг/дозу до 2.5г/м . В одному 2 варіанті втілення дозування, яке вводиться становить приблизно від 250мг/м приблизно до 400 2 2 2 мг/м або 500 мг/м . В іншому варіанті втілення дозування становить приблизно 250-375мг/м . У ще одному варіанті втілення діапазон дозування - 275-375 мг/м2. Терапії вікової макулярної дегенерації (AMD) можуть бути оцінені, крім інших, за зниженням швидкості або запобіганням подальшої втрати зору. Для терапії AMD, ефективність in vivo 26 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 може, наприклад, бути визначена за одним або кількома з наступних параметрів: оцінка середньої зміни в найкращій скоригованій гостроті зору (BCVA) від базового рівня до бажаного часу, оцінка частки суб'єктів, хто втрачає менше ніж 15 літер у гостроті зору в бажаний час у порівнянні з базовим рівнем, оцінка частки суб'єктів, хто отримує більше ніж або рівне 15 літерам підвищення гостроти зору в бажаний час у порівнянні з базовим рівнем, оцінка частки суб'єктів з гостротою зору Snellen, еквівалентно 20/2000 або гірше в бажаний час, оцінка Анкетного опитування зорової функції NEI, оцінка розміру CNV і кількості витоку CNV у бажаний час, що оцінюється флуоресцеїновою ангіографією, і т.д. Термін "виявлення" включає визначення присутності або відсутності речовини або визначення кількості речовини. Термін у такий спосіб стосується застосування матеріалів, композицій і способів даного винаходу для якісних і кількісних визначень. Взагалі, специфічна техніка, що використовується для виявлення, не є критичною для практичного втілення винаходу. Наприклад, "виявлення" відповідно до винаходу може включати: спостереження присутності або відсутності альфа5 генного продукту, мРНК молекули, або aльфa5 поліпептиду; зміна рівнів альфа5 поліпептида або кількості, зв'язаної з мішенню; зміна біологічної функції/активності альфа5 поліпептида. У деяких варіантах втілення "виявлення" може включати виявлення рівнів альфа5 дикого типу (наприклад, рівнів мРНК або поліпептида). Виявлення може включати кількісне визначення зміни (збільшення або зменшення) будь-якої величини від 10 % до 90 %, або будь-якої величини від 30 % до 60 %, або понад 100 %, при порівнянні з контролем. Виявлення може включати кількісне визначення зміни будь-якої величини від 2-кратної до 10кратної, включно, або більше, наприклад, 100-кратної. Вжите авторами слово "мітка" стосується сполуки або композиції, які підлягають виявленню, що прямо або непрямо кон'югована з антитілом. Мітка може самостійно виявлятися окремо (наприклад, радіоізотопні мітки або флуоресцентні мітки) або, у випадку ферментативної мітки, може каталізувати хімічну зміну сполуки або композиції субстрату, що підлягає виявленню. Нові Aнти-альфа5бета1 Антитіла Авторами пропонуються нові антитіла, які можуть зв'язувати людський альфа5бета1 і конкурентно інгібувати зв'язування анти-альфа5бета1 антитіла з людським альфа5бета1. Відповідно до одного варіанта втілення анти-альфа5бета1 антитіло продукується гібридомою, відібраної із групи, що складається з гібридоми, депонованої як Альфа5/бета1 7H5.4.2.8 (ATCC № РТА-7421) і гібридоми, депонованої як Альфа5/бета1 7H12.5.1.4 (ATCC № РТА-7420) в ATCC 7 березня 2006 р. Відповідно до іншого варіанта втілення антитіло продукується гібридомою, відбирається із групи, що складається з гібридоми, депонованої як Альфа5/бета1 7H5.4.2.8 (ATCC № РТА-7421) і гібридоми, депонованої як Альфа5/бета1 7H12.5.1.4 (ATCC № РТА-7420) в ATCC 7 березня 2006 р. Згідно із ще одним варіантом втіленню антитіло включає послідовність варіабельного важкого (VH) і варіабельного легкого (VL) домену антитіла, що продукується гібридомою, депонованою як Альфа5/бета1 7H5.4.2.8 (ATCC № РТА-7421) в ATCC 7 березня 2006 р. В іншому варіанті втілення антитіло включає послідовність варіабельного важкого (VH) і варіабельного легкого (VL) домену антитіла, що продукується гібридомою, депонованою як Альфа5/бета1 7H12.5.1.4 (ATCC № РТА-7420) в ATCC 7 березня 2006 р. Також розглядаються людські або химерні форми антитіл розміщених гібридом. Відповідно до одного варіанта втілення антитіло зв'язує людський альфа5бета1 з Kd, що становить 500нM – 1пкM. Відповідно до іншого варіанта втілення антитіло не зв'язує альфаVбета3 або альфаVбета5 або альфаVбета1. Відповідно до іншого варіанта втілення антитіло включає Fc послідовність людського IgG, наприклад, людського IgG1 або людського IgG4. В іншому варіанті втілення Fc послідовність була змінена або інакше змінена так, щоб вона не мала ефекторної функції антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ADCC), часто пов'язаної з їх зв'язуванням з Fc рецепторами (FcRs). Є багато прикладів змін або мутацій до Fc послідовностей, які можуть змінити ефекторну функцію. Наприклад, WO00/42072 (Presta) і Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) описують варіанти антитіла з покращеним або зменшеним зв'язуванням з FcRs. Зміст цих публікацій спеціально включений авторами шляхом посилання. Антитіло може бути у вигляді Fab, Fab", F(ab)’2, одноланцюгового Fv (scFv), Fv фрагмента; діатіла і лінійного антитіла. Крім того, антитіло може бути мультиспецифічним антитілом, що зв'язується з альфа5бета1 і є альфа5бета1 антагоністом, але також і зв'язує одну або кілька інших мішеней та інгібує їхню функцію (наприклад, VEGF). Антитіло може бути кон'югованим з терапевтичним агентом (наприклад, цитотоксичним агентом, радіоізотопом й хіміотерапевтичним агентом) або міткою для виявлення альфа5бета1 у зразках пацієнта або in vivo шляхом візуалізації (наприклад, радіоізотоп, флуоресцентний барвник й фермент). 27 UA 100969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також розглядаються молекули нуклеїнової кислоти, які кодують анти-альфа5бета1 антитіла, вектори експресії, що включають молекули нуклеїнової кислоти, які кодують один або обидва варіабельні домени, і клітини, що включають молекули нуклеїнової кислоти. Ці антитіла можуть використовуватися у терапіях, описаних авторами, і виявляти альфа5бета1 білок у зразках пацієнтів (наприклад, FACS, імуногістохімія (IHC), випробування ELISA) або у пацієнтів. Нові Комбінації Нові комбінації для інгібування ангіогінез і/або судинної проникності у суб'єкта, який страждає на хворобу, причому комбінації включають VEGF антагоніст і альфа5бета1 антагоніст. VEGF антагоніст і альфа5бета1 антагоніст можна вводити в паралельних або послідовних циклах лікування. Такі комбінаторні терапії корисні для лікування хвороби, включаючи ті хвороби, що мають патологічний ангіогінез і/або судинну проникність і отримували б користь внаслідок анти-ангіогіогенної терапії. Такі хвороби включають, крім інших, рак, хвороби очей і аутоімунну хворобу. Альтернативно, суб'єкта можна лікувати за допомогою VEGF антагоніста і потім вводити альфа5бета1 антагоніст, наприклад, лікуючи за допомогою VEGF антагоніста до відсутності відповіді суб'єкта на лікування VEGF антагоністом і потім лікуючи суб'єкт за допомогою альфа5бета1 антагоніста. Відповідно до одного варіанта втілення суб'єкт отримує лікування VEGF антагоністом, коли рак є неінвазивним і потім отримує лікування альфа5бета1 антагоністом, коли рак є інвазивним. Деякі пацієнти, у яких відзначаються підвищені рівні альфа5бета1 природно або у відповідь на терапію VEGF антагоністом, у порівнянні з не хворими пацієнтами або контролем, можуть бути особливо сприйнятливими до цього комбінованого лікування. Розглядаються комбінації, що додатково включають терапевтичний агент (наприклад, антинеопластичний агент, хіміотерапевтичний агент, ростоінгібуючий агент і цитотоксичний агент). Наприклад, пацієнти, яких потрібно лікувати за допомогою хіміотерапії (наприклад, ірінотекан) і альфа5бета1 антагоністів, або хто отримував хіміотерапію й альфа5бета1 антагоністи, можуть отримувати користь внаслідок терапії VEGF антагоністом. Альтернативно, пацієнти, які отримували хіміотерапію й VEGF антагоністи, можуть отримувати користь внаслідок терапії альфа5бета1 антагоністом. В одному оптимальному варіанті втілення анти-VEGF антитіло є антитілом Авастин®. В іншому оптимальному варіанті втілення анти-альфа5бета1 антитіло є антиальфа5бета1 антитілом, описаним авторами. Розглядаються набори, що включають VEGF антагоніст, альфа5бета1 антагоніст й, довільно, хіміотерапевтичний агент. Фармацевтичні препарати Терапевтичні препарати антитіл, що використовуються відповідно до даного винаходу, готуються до зберігання шляхом змішування антитіла, що має бажаний ступінь чистоти, з довільними фармацевтично прийнятними носіями, допоміжними речовинами або стабілізаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), у вигляді ліофілізованих формулювань або водних розчинів. Прийнятні носії, допоміжні речовини або стабілізатори є нетоксичними для реципієнтів при дозуваннях і концентраціях, що використовуються, і включають буфери, такі як фосфат, цитрат та інші органічні кислоти; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту й метіонін; консерванти (такі як октадецилдиметилбензиламонію хлорид; гексаметонію хлорид; бензалконію хлорид, бензетонію хлорид; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил або пропіл парабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; і м-крезол); низькомолекулярні (менше ніж приблизно 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як олівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу або декстрини; хелатуючі агенти, такі як EDTA; цукор, такий як сахароза, манніт, трегалоза або сорбіт; солеутворюючі протийони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, Zn-протеїнові комплекси); і/або неіонні поверхнево-активні речовини, такі як TWEEN™, PLURONICS™ або поліетиленгліколь (ПЕГ). Приклади формулювань антитіл описані в WO98/56418, чітко включеному авторами шляхом посилання. Ліофілізовані препарати, пристосовані до підшкірного введення, описані в WO97/04801. Такі ліофілізовані препарати можуть бути розчинені за допомогою підходящого розчинника до високої концентрації білка, і розчинені препарати можна вводити підшкірно ссавцеві, який отримує описане авторами лікування. Препарат, описане авторами, може також містити більш ніж одну активну сполуку, якщо це необхідно для певного показання, що лікується, бажано ті, які мають доповнюючі активності, що негативно не впливають одна на одну. Наприклад, може бути бажано додатково забезпечити цитотоксичний агент, хіміотерапевтичний агент, цитокін або імуносупресивний агент (наприклад такий, котрий діє на T клітини, такий як циклоспорин або антитіло, що зв'язує T клітини, 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюCombinatorial therapy involving alpha5beta1 antagonists
Автори англійськоюChuntharapai, Anan, Plauman Hreh, Tesye-Lavin Mark, Wu, Yan, A Waylan'
Назва патенту російськоюАнтитело, специфически связывающее человеческий альфа5бета1 (alpha5beta1)
Автори російськоюЧунтхарапай Анан, Плауман Грег, Тессье-Лавин Марк, У Янь, Э Вейлань
МПК / Мітки
МПК: C12P 21/08, C07K 16/28, A61K 39/395, C12N 5/12, C07K 16/22, G01N 33/573, A61P 35/00
Мітки: альфа5бета1, зв'язує, яке, людський, alpha5beta1, антитіло, специфічно
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/63-100969-antitilo-yake-specifichno-zvyazueh-lyudskijj-alfa5beta1-alpha5beta1.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Антитіло, яке специфічно зв’язує людський альфа5бета1 (alpha5beta1)</a>