Модифікований полімером фактор viii для лікування гемофілії, спосіб його одержання

1. Кон’югат, що має прокоагулянтну активність фактора VIII, який включає функціональний поліпептид фактора VIII, який мутований таким чином, що принаймні один нецистеїновий залишок заміщений на цистеїновий залишок, так що присутній мутантний цистеїновий залишок, де функціональний поліпептид фактора VIII ковалентно з'єднаний на мутантному цистеїновому залишку з біосумісним полімером. 2. Кон’югат за п. 1, де біосумісний полімер включає поліетиленгліколь. 3. Кон’югат за п. 2, де поліетиленгліколь включає метоксиполіетиленгліколь. 4. Кон’югат за п. 3, де метоксиполіетиленгліколь має розмір в інтервалі від 5 кДа до 64 кДа. 5. Кон’югат за п. 1, де біосумісний полімер ковалентно приєднаний до функціонального поліпептиду фактора VIII на амінокислотному залишку, що знаходиться на відстані або в межах 20 ангстрем від (а) сайту зв'язування рецептора виведення фактора VIII, (b) сайту зв'язування протеази, здатної деградувати фактор VIII, і/або (с) сайту зв'язування інгібіторних антитіл до фактора VIII. 6. Кон’югат за п. 1, де біосумісний полімер ковалентно приєднаний до функціонального поліпептиду 2 (19) 1 3 95225 4 очищення кон’югата. 14. Спосіб за п. 13, у якому біосумісний полімер включає поліетиленгліколь. 15. Спосіб за п. 14, у якому мутеїн реагує з малеімідною групою на поліетиленгліколі. 16. Спосіб за п. 13, у якому біосумісний полімер є поліетиленгліколем, та експресія мутованої нуклеотидної послідовності відбувається у середовищі культивування клітин, яке містить сульфгідрильні групи, які приєднуються до введеної вільної цистеїнової групи (груп) на модифікованому цистеїновому мутеїні, та спосіб окрім того включає наступні стадії після експресії мутеїну і до очищення мутеїну: (а) контактування мутеїну з відновлювачем при умовах, у яких мутеїн м’яко відновлюється та відокремлюється сульфгідрильна група; і (b) вилучення сульфгідрильної групи, що відокремилася, та відновлювача із мутеїну, де мутеїн окрім того реагує із поліетиленгліколем протягом принаймні п’яти хвилин після видалення відновлювача. 17. Спосіб за п. 16, у якому сульфгідрильну групу, що відокремилася, і відновлювач видаляють із мутеїну за допомогою витиснювальної за розміром молекул або іонообмінної хроматографії. 18. Спосіб за п. 16, у якому мутеїн фактора VIII є мутеїном фактора VIII з делетованим В-доменом. 19. Спосіб за п. 16, у якому поліетиленгліколь є ПЕГ-малеімідом та має розмір в інтервалі від 5 кДа до 64 кДа. 20. Фармацевтична композиція для парентерального введення, що містить терапевтично ефективну кількість кон’югата за п. 1 та фармацевтично прийнятний ад’ювант. 21. Застосування кон’югата за пп. 1-12 для одержання лікарського засобу для лікування гемофілії. 22. Застосування фармацевтичної композиції за п. 20 для одержання лікарського засобу для лікування гемофілії. 23. Кон’югат за п. 1, де біосумісний полімер являє собою гідроксіетил-крохмаль. 24. Кон’югат за п. 23, де гідроксіетил-крохмаль ковалентно приєднаний до поліпептиду в одному або більше амінокислотних положеннях 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1911, 2091, 2118 і 2284 фактора VIII. 25. Кон’югат за пп. 23 або 24, де функціональний поліпептид фактора VIII є фактором VIII з делетованим В-доменом. 26. Кон’югат за п. 25, де гідроксіетил-крохмаль ковалентно приєднаний до фактора VIII з делетованим В-доменом у положеннях амінокислоти 129, 491, 1804 і/або 1808. 27. Кон’югат за п. 23, де гідроксіетил-крохмаль приєднаний до поліпептиду у положенні амінокислоти 1804 фактора VIII. 28. Кон’югат за п. 23, де гідроксіетил-крохмаль приєднаний до поліпептиду у положенні амінокислоти 1804 фактора VIII, та функціональний поліпептид фактора VIII є фактором VIII з делетованим В-доменом. 29. Спосіб одержання кон’югата за п. 23, що включає: вибір специфічної амінокислоти, що не є цистеїновим залишком в амінокислотній послідовності функціонального поліпептиду фактора VIII, яка є попередньо заданим сайтом приєднання гідроксіетил-крохмалю; мутацію нуклеотидної послідовності, що кодує функціональний поліпептид фактора VIII, для заміщення кодуючої послідовності нецистеїнового амінокислотного залишку кодуючою послідовностю цистеїнового залишку в попередньо заданому сайті; експресію мутованої нуклеотидної послідовності, щоб отримати модіфікований цистеїном мутеїн; очищення мутеїну; реагування мутеїну з гідроксіетил-крохмалем, який активований для реакції з поліпептидами по суті тільки з відновленими цистеїновими залишками, так що утворюється кон’югат; і очищення кон’югата. 30. Спосіб за п. 29, у якому гідроксіетил-крохмаль активують додаванням малеімідної групи, яка може специфічно реагувати із цистеїнами в протеїнах. 31. Фармацевтична композиція для парентерального введення, яка містить терапевтично ефективну кількість кон’югата за п. 23 і фармацевтично прийнятний ад’ювант. 32. Спосіб лікування гемофілії, що передбачає введення пацієнтові, який потребує цього, ефективної кількості композиції за п. 31. 33. Застосування кон’югата за одним з пп. 23-28 для одержання лікарського засобу для лікування гемофілії. Перехресне посилання Ця заявка має перевагу пріоритету за заявкою № 60/627,277 на патент США, поданою 12 листопада 2004 p., яку повністю включено сюди шляхом посилання. Галузь винаходу Цей винахід стосується мутеїнів Фактора VIII (FVIII), які мають можливість зв'язуватися в попередньо заданому сайті з одним або більше біосумісними полімерами, такими як поліетиленгліколь. Крім того, пропонуються засновані на них склади, дозування та способи їх введення з терапевтичною метою. Ці модифіковані варіанти FVIII і засновані на них композиції та способи придатні для вибору методу лікування осіб, уражених гемофілією А, у якому частоту введення препарату зменшено та імуногенну відповідь знижено. Рівень техніки Гемофілія А є найбільш поширеним спадковим порушенням згортання крові з оцінкою трапляння: одне на 5000 чоловіків. Вона спричиняється дефіцитом або структурними дефектами FVIII, основ 5 ному компоненті природного шляху згортання крові. Сучасне лікування гемофілії А включає внутрішньовенне введення людського FVIII. Людський FVIII отримують рекомбінантним методом у вигляді одноланцюжкової молекули розміром приблизно 300 кДа. Вона складається зі структурних доменів А1-А2-В-А3-С1-С2 (Thompson, 2003, Semin. Hematol. 29, pp. 11-22). Продукт-попередник перетворюється на два поліпептидні ланцюжки розмірами 200 кДа (важкий) і 80 кДа (легкий) в апараті Гольджі, при цьому два ланцюжки утримуються разом за допомогою іонів металів (Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, p. 6352; Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, p. 2979). Домен В мутеїну FVIII вважається необов'язковим, оскільки FVIII з делетованим доменом В (BDD, А1-А2-важкий ланцюг 90 кДа плюс легкий ланцюг 80 кДа) також проявляє ефективність при замісній терапії гемофілії А. Послідовність FVIII з делетованим В-доменом містить делецію всіх, крім 14-ти, амінокислот В-домену. Пацієнтів з гемофілією А зараз лікують внутрішньовенним введенням FVIII у разі необхідності або шляхом профілактичної терапії, яку призначують кілька разів на тиждень. При профілактичному лікуванні вводять 15-25 МО фактора VIII на 1 кг ваги тіла три рази на тиждень. Це постійно потрібно пацієнтові. Через короткий час напіввиведення у людини, FVIII повинен вводитися часто. Незважаючи на великий розмір у понад 300 кДа протеїну повної довжини, FVIII має у людей період напіввиведення тільки близько 11 годин (Ewenstein et al., 2004, Semin. Hematol. 41, pp. 1-16). Необхідність частого внутрішньовенного введення створює величезні бар'єри в дотриманні хворими режиму та схеми лікування. Для пацієнтів було б більш зручним, якби був розроблений FVIII-продукт, що має більш тривалий період напіввиведення і, отже, вимагає менш частого введення. Крім того, якби період напіввиведення був збільшений, могла б бути зменшена вартість лікування, оскільки в результаті могла б знадобитися менша кількість доз. Додатковим недоліком існуючої терапії є те, що приблизно у 25-30% пацієнтів виробляються антитіла, які інгібують активність FVIII (Saenko et al., 2002, Haemophilia 8, pp. 1-11). Головні епітопи інгібіторних антитіл локалізовані всередині домену А2 на залишках 484-508, домену A3 на залишках 1811-1818 і домену С2. Вироблення антитіл перешкоджає використанню FVIII при замісній терапії, змушуючи цю групу пацієнтів шукати ще більш дороге лікування за допомогою високодозувального рекомбінантного Фактора VIII і імуностійкої терапії. У подальших дослідженнях були ідентифіковані FVIII-епітопи інгібіторних антитіл. При дослідженні 25-ти інгібіторних зразків плазми було виявлено, що 11 з них пов'язані із фрагментом A3С1С2, що викликаний тромбіном і має легкий ланцюг розміром 73 кДа, 4 зв'язані з доменом А2, а 10 - з обома фрагментами (Fulcher, С. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 2(22), pp. 7728-32). В іншому дослідженні шість із восьми інгібіторів домену А2 пацієнтів були нейтралізовані рекомбінантним А2-поліпептидом (Scandella, D. et al., 1993, 95225 6 Blood 82(6), pp. 1767-75). Епітопи для шести з дев'яти інгібіторів пацієнтів виявлені на залишках 379-538 домену А2 (Scandella, D. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85(16), pp. 6152-6). Епітоп для 18ти інгібіторів з важким ланцюгом був визначений у тій самій N-кінцевій області розміром 18,3 кДа домену А2 (Scandella, D. et al., 1989, Blood 74(5), pp. 1618-26). Активна рекомбінантна гібридна молекула людина/свиня мутеїну FVIII, отримана заміщенням залишків 387-604 домену А2 людини гомологічною послідовністю свині, виявляла стійкість до інгібітору А2 пацієнта (Lubin, I. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269(12), pp. 8639-41) і стійкість до мишачого моноклонального антитіла mАВ 413 IgG, що конкурує з інгібіторами А2 пацієнта у зв'язуванні з А2 (Scandella, D. et al., 1992, Thromb Haemost. 67(6), pp.665-71). Далі цей епітоп домену А2 був виявлений у залишку 484-508 домену А2, коли в результаті експериментів було виявлено, що mАВ 413 IgG і чотири інгібітори пацієнта не інгібують гібридний людина/свиня мутеїн FVIII, у якому залишки 484-508 домену А2 були заміщені відповідними залишками домену А2 свині (Healey, J. et al., 1995, J. Biol. Chem. 270(24), pp. 14505-9). Такий гібридний FVIII також був більш стійким, принаймні, у половини з 23 пацієнтів, у яких досліджувалася плазма (Barrow, R. et al., 2000, Blood 95(2), pp. 5648). При аланін-скануючому мутагенезі був ідентифікований залишок 487 як основний для зв'язування з усіма п'ятьома тестованими інгібіторами пацієнтів, незважаючи на те, що всі залишки 484, 487, 489 і 492, були важливими для взаємодії з mАВ 413 IgG (Lubin, I., J. Biol. Chem. 272(48), pp. 30191-5). Титри інгібіторних антитіл у миші, яка отримувала мутант R484A/R489A/P492, а не мутант R484A/R489A, були значно нижчими, ніж у миші, яка одержувала контрольний людський BDD FVIII (Parker, E. et al., 2004, Blood 104(3), pp. 70410). Таким чином, область 484-508 домену А2, очевидно, є сайтом зв'язування для інгібіторів з активністю FVIII. Іншою проблемою традиційної терапії, крім імунної відповіді на FVIII, є те, що вона вимагає частого введення дози через короткий період напіввиведення FVIII in vivo. Були досліджені механізми виведення FVIII з кровотоку. Виведення FVIII із кровотоку частково пояснюється специфічним зв'язуванням із протеїном, родинним рецептору ліпопротеїну низької щільності (LRP) і печінковому рецептору виведення із широкою лігандною специфічністю (Oldenburg et al., 2004, Haemophilia 10 Suppl 4, pp. 133-139). Недавно було також показано, що рецептор ліпопротеїну низької щільності (LDL) відіграє певну роль у виведенні FVIII, наприклад, за допомогою спільної з LRP дії з регулювання рівнів FVIII у плазмі (Bovenschen et al., 2005, Blood 106, pp. 906-910). Обидві взаємодії полегшуються зв'язуванням з гепаринів сульфат протеогліканами (HSPGs) поверхні клітин. Період напіввиведення із плазми в миші може бути пролонгований до 3,3 разів, коли блокований LRP, або в 5,5 разів, коли блоковані як LRP, так і HSPGs поверхні клітин (Sarafanov et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, pp. 11970-11979). Вважа 7 ється, що HSPGs акумулюють FVIII на клітинній поверхні та надають його LRP. Сайти зв'язування LRP на FVIII локалізовані на залишках 484-509 А2 (Saenko et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 3768537692), залишках 1811-1818 A3 (Bovenschen et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, pp. 9370-9377) і епітопі в домені С2 (Lenting et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 23734-23739). Крім того, FVIII виводиться із кровотоку під дією протеаз. Щоб зрозуміти цей ефект, потрібно зрозуміти механізм, за допомогою якого FVIII залучений у згортання крові. FVIII, пов'язаний з фактором фон Вілебранда (vWF) циркулює, як гетеродимер, що складається з важкого та легкого ланцюгів. vWF-зв'язування відбувається на залишках 1649-1689 FVIII (Foster et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, pp. 5230-5234) і частині доменів С1 (Jacquemin et al., 2000, Blood 96, pp. 958-965) і C2 (Spiegel, P. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(51), pp. 53691-8). FVIII активується тромбіном, що розщеплює пептидні зв'язки після залишків 372, 740 і 1689, продукуючи гетеротример з доменів А1, А2 і А3-С1-С2 (Pittman et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 276, pp. 12434-12439). По закінченні активації FVIII дисоціює від vWF і накопичується на поверхні клітин тромбоцитів шляхом зв'язування з фосфоліпідом. Фосфоліпідне зв'язування включає залишки 2199, 2200, 2251 і 2252 FVIII (Gilbert et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, pp. 6374-6381). Там він зв'язується з коагуляційним фактором IX (FIX) через взаємодію із залишками 558-565 (Fay et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, pp. 20522-20527) і залишками 1811-1818 FVIII (Lenting et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 1935-1940) та з коагуляцій ним фактором X (FX) через взаємодію із залишками 349-372 FVIII (Nogami et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, pp. 1576315771) і діє як кофактор для FIX-активації FX, істотного компонента природного шляху згортання крові. Активований FVIII (FVIIIa) частково інактивується протеазою, що активується протеїном С (АРС) через розщеплення FVIII після залишків 336 і 562 (Regan et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 3982-3987). Однак, передбачуваним основним фактором інактивації, є дисоціація домену А2 від доменів А1 і А3-С1-С2 (Fay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, pp. 8957-8962). Одним з методів, який, як було продемонстровано, збільшує in vivo період напіввиведення протеїну, є ПЕГ-ілування. ПЕГ-ілування являє собою ковалентне приєднання довголанцюжкових молекул поліетиленгліколю (ПЕГ) до протеїну або іншої молекули. ПЕГ може мати лінійну форму або розгалужену форму, щоб одержати різні молекули з різними властивостями. Крім збільшення періоду напіввиведення пептидів або протеїнів ПЕГілування використовується для зменшення утворення антитіл, захисту протеїну від протеазного розщеплення та збереження матеріалу поза нирковим фільтратом (Harris et al., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40, pp. 539-51). Крім того, ПЕГілування може також збільшувати загальну стабільність і розчинність протеїну. Нарешті, підтримувана концентрація ПЕГ-ілованих протеїнів у плазмі може зменшувати ступінь побічних ефектів шляхом зменшення провалів у пікових рівнях лікарсь 95225 8 кого засобу, знімаючи, таким чином, необхідність введення надфізіологічних рівнів протеїну на ранніх часових відрізках. З різним ступенем успіху випробувалися випадкові модифікації FVIII, отримані шляхом спрямованого впливу первинних амінів (N-кінцевий і лізини) великими полімерами, такими як ПЕГ і декстран (WO94/15625, патент US 4970300, патент US 6048720). Найбільш яскраве поліпшення, опубліковане в патентній заявці в 1994 p. (WO94/15625), показало 4-кратне збільшення періоду напіввиведення, однак за рахунок 2-кратної втрати активності після реакції FVIII повної довжини з 50-кратним надлишком ПЕГ. В WO2004/075923 розкриваються кон'югати FVIII і поліетиленгліколю, які утворюються через випадкові модифікації. У минулому випадково ПЕГіловані протеїни, такі як інтерферон-альфа (Kozlowski et al., 2001, BioDrugs 15, pp. 419-429), схвалювалися як терапевтичні засоби. Однак цей підхід, заснований на випадкових модифікаціях, є більш проблематичним відносно гетеродимерного FVIII. FVIII має сотні потенційних сайтів ПЕГ-ілування, включаючи 158 лізинів, два N-кінці та множину гістидинів, серпнів, треонінів і тирозинів, кожен з яких потенційно міг би бути ПЕГ-ілованим реагентами, спочатку націленими на первинні аміни. Наприклад, було показано, що головним позиційним ізомером для ПЕГ-ілованого інтерферону Альфа-2b є гістидин (Wang et al., 2000, Biochemistry 39, pp. 10634-10640). Крім того, результатом гетерогенної обробки повнорозмірного FVIII може бути суміш вихідного матеріалу, що надалі робить ПЕГ-іловані продукти більше складними. Додатковим недоліком неконтролювання сайту ПЕГ-ілування на FVIII є потенційне зниження активності, у тих випадках, коли ПЕГ повинен був приєднатися на або поблизу основних активних сайтів, особливо в тих випадках, коли більш ніж один ПЕГ або одиничний ПЕГ великого розміру кон'югує з FVIII. Оскільки випадкове ПЕГ-ілування постійно продукує велику кількість ПЕГ-ілованих продуктів, очищення з метою одержання саме моноПЕГ-ілованих продуктів приведе до істотного зниження виходу цих продуктів. Нарешті, величезна гетерогенність профілю продукту буде робити майже неможливим безперервний синтез і дослідження кожної серії. Оскільки товарне виробництво вимагає постійного, добре дослідженого продукту, гетерогенність продукту є бар'єром для комерціалізації. Через всі ці причини бажаним є більш визначений метод ПЕГ-ілування FVIII. У недавньому огляді (Kochendoerfer, G., Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, доступному он-лайн з 15 жовтня 2005 p., прямий предметний ідентифікатор doi:10.1016/j.cbpa.2005.10.007) були узагальнені різні стратегії сайт-спрямованого ПЕГ-ілування протеїнів. Один з підходів включає введення неприродної амінокислоти в протеїни за допомогою хімічного синтезу або рекомбінантної експресії, за якими йде додавання похідної ПЕГ, що буде специфічно реагувати з неприродною амінокислотою. Наприклад, неприродна амінокислота може бути такою, що містить кетогрупу, що не трапляється в нативних протеїнах. Однак хімічний синтез таких 9 великих протеїнів, як FVIII, неможливий. Сучасна межа пептидного синтезу становить близько 50 залишків. Для одержання більших частин поліпептиду можна лігувати кілька пептидів, але щоб одержати хоча б FVIII з делетованим В-доменом, потрібно було б понад 20 лігувань, внаслідок чого вихід продукту становив би менше 1% навіть за ідеальних умов реакції. Рекомбінантна експресія протеїнів з неприродними амінокислотами обмежена, головним чином, експресійними системами не-ссавців. Вважають, що цей підхід є проблематичним для великого та складного протеїну, такого як FVIII, експресія якого необхідна в системах ссавців. Інший підхід до сайт-спрямованого ПЕГілування протеїнів полягає в спрямованому впливу аміну N-кінця основного ланцюга ПЕГальдегідами. При цьому процесі потрібний низький рН для досягнення специфічності щодо інших амінних груп, що, однак, є несумісним з вузьким інтервалом майже нейтрального рН, необхідного для стабільності FVIII (Wang et al., 2003, International J. Pharmaceutics 259, pp. 1-15). Більше того, N-кінцеве ПЕГ-ілування FVIII може не привести до поліпшення періоду напіввиведення з плазми, якщо ця область не бере участь у виведенні з плазми. Насправді, N-кінцева область легкого ланцюга FVIII залучена у зв'язування з vWF, протеїном-носієм, що є основним для збереження FVIII при кровообігу. При N-кінцевій модифікації фактора FVIII найбільш важливий зв'язок з vWF може бути зруйнованим або ослабленим. Таким чином, N-кінцеве ПЕГ-ілування FVIII може дати протилежний ефект зменшення періоду напіввиведення FVIII із плазми. WO90/12874 розкриває сайт-специфічну модифікацію людського IL-3, колонієстимулюючого фактора гранулоцитів і еритропоетинових поліпептидів шляхом введення цистеїну або заміною ним іншої амінокислоти з подальшим додаванням ліганду, що містить сульфгідрильну реактивну групу. Ліганд вибірково приєднується до цистеїнових залишків. Модифікація FVIII або будь-якого його варіанта не розкривається. З сформульованих вище причин існує необхідність у поліпшеному варіанті FVIII, що має більшу тривалість дії in vivo і знижену імуногенність, зберігаючи, у той самий час, функціональну активність. Крім того, бажано, щоб такий протеїн продукувався як гомогенний продукт у надійний спосіб. Стисле викладення суті винаходу Мета цього винаходу полягає у забезпеченні кон'югованого з біосумісним полімером функціонального поліпептиду FVIII, що має поліпшені фармакокінетичні та терапевтичні властивості. Іншою метою цього винаходу є забезпечення кон'югованого з біосумісним полімером протеїну FVIII з делетованим В-доменом, що має поліпшені фармакокінетичні властивості. Ще однією метою винаходу є забезпечення кон'югованого з біосумісним полімером функціонального поліпептиду FVIII, що має ослаблене зв'язування із протеїном, родинним рецептору ліпопротеїну низької щільності (LRP), рецептором ліпопротеїну низької щільності (LDL), гепарин 95225 10 сульфат протеогліканами (HSPGs) і/або інгібіторними антитілами проти FVIII. Ще однією метою цього винаходу є забезпечення поліпшеного варіанта FVIII, що має більшу тривалість дії in vivo і зменшену імуногенність і який можна отримувати як гомогенний продукт у надійний спосіб. В одному аспекті винаходу забезпечується кон'югат, що має прокоагулянтну активність фактора FVIII, що включає функціональний поліпептид фактора FVIII, ковалентно з'єднаний на одному або більше своїх попередньо заданих сайтах з одним або більше біосумісними полімерами, де попередньо заданий сайт не є N-кінцевим аміном. Винахід також включає спосіб одержання цього кон'югата, що передбачає введення мутації нуклеотидної послідовності, що кодує функціональний поліпептид фактора FVIII, з метою заміщення в попередньо заданому сайті послідовністю, що кодує цистеїновий залишок; експресію мутованої нуклеотидної послідовності для одержання поліпшеного цистеїном мутеїну; очищення мутеїну; реагування мутеїну з біосумісним полімером, що активований для реагування з поліпептидами по суті тільки на введених цистеїнових залишках таким чином, щоб утворився кон'югат; і очищення кон'югата. Винахід також спрямований на фармацевтичні композиції, що включають кон'югат і фармацевтично прийнятний ад'ювант, і на способи лікування гемофілії шляхом введення терапевтично ефективних кількостей цих фармацевтичних композицій ссавцю, який їх потребує. Винахід також стосується способу сайтспрямованого ПЕГ-ілування мутеїну фактора FVIII, що включає (а) експресію сайт-спрямованого мутеїну фактора FVIII, де мутеїн має цистеїнове заміщення в амінокислотному залишку на зовнішній поверхні мутеїну фактора FVIII і цей цистеїн є кепованим; (b) контактування цистеїнового мутеїну з відновлювачем в умовах, у яких цистеїновий мутеїн м'яко відновлюється та відокремлюється кеп; (с) вилучення кепа та відновлювача з цистеїнового мутеїну; і (d) обробку, принаймні, через близько 5 хвилин після видалення відновлювача, цистеїнового мутеїну за допомогою ПЕГ, що включає сульфгідрильний зв'язувальний засіб в умовах, у яких утворюється ПЕГ-ілований мутеїн фактора FVIII. Короткий опис фігур креслень Фіг. 1. Карти векторів і стратегія мутагенезу для ПЕГ-мутеїнів. Фіг. 2. Профіль поглинання УФ при 280 нм відносно часу для ПЕГ-2-протеїну, очищеного через хроматографічну колонку з моноклональними антитілами до FVIII. Хроматографію виконували з використанням хроматографічної системи AKTA Explorer 100 від Amersham Bioscience. Фіг. 3. Тристадійний спосіб сайт-спрямованого ПЕГ-ілування. ПЕГ являє собою цистеїнреактивний ПЕГ, такий як ПЕГ-малеїмiд. Замкнуті смужки показують дисульфідні утворення, а незамкнуті - відновлені цистеїни. Фіг. 4. Сайт-спрямоване ПЕГ-ілування ПЕГ2. Фіг. 5. Сайт-спрямоване ПЕГ-ілування ПЕГ6. 11 Фіг. 6а. Сайт-спрямоване ПЕГ-ілування BDD, ПЕГ2, 4, 5 і 6. Верхні панелі були забарвлені антитілом до важкого (Н) ланцюга, а нижні панелі - антитілом до легкого (L) ланцюга. "U" - необроблений матеріал, що містить як Н, так і L. Фіг. 6b. ПЕГ-ілування ПЕГ 15 і ПЕГ7 з ПЕГ2 і ПЕГ6 в якості контролю. Спочатку очищені ПЕГмутеїни (S) відновлювали за допомогою трис(2карбоксіетил)фосфін (ТСЕР), а після вилучення відновлювача ("R") ПЕГ-ілували за допомогою ПЕГ 12 кДа ("12") або 22 кДа ("22"). Зразки наносили на 6%-ий Трис-гліцин SDS PAGE і забарвлювали антитілом до важкого ланцюга (НС) на лівій панелі або антитілом до легкого ланцюга (LC) на правій панелі. "U" - необроблений матеріал, що містить як НС, так і LC. ПЕГ-іловані смужки забарвлені точками. Фіг. 6с. ПЕГ-ілування ПЕГ2+6 з ПЕГ2 і ПЕГ6 в якості контролю. ПЕГ2, ПЕГ6 або ПЕГ2+6 відновлювали за допомогою ТСЕР, а після вилучення відновлювача ("R") ПЕГ-ілували за допомогою ПЕГ 5 кДа ("5") або 43 кДа ("43"). ПЕГ2+6 також ПЕГілували з використанням ПЕГ 12, 22 і 33 кДа. Зразки наносили на 6%-ий Трис-гліцин SDS PAGE і забарвлювали кумасі для протеїнів ліворуч або антитілом до важкого ланцюга (Н) або легкого ланцюга (L). "U" - необроблений матеріал, що містить як Н, так і L. ПЕГ-іловані смужки забарвлені точками. Фіг. 6d ПЕГ-ілування FVIII дикого типу повної довжини (KG-2) с ПЕГ2 в якості контролю. Лівий гель забарвлювали кумасі для протеїнів, а правий гель - йодом для ПЕГ. "BDD U" - необроблений BDD-матеріал, що містить як Н, так і L. ПЕГ-іловані смужки забарвлені точками. Фіг. 7. Розщеплення тромбіном ПЕГ-ілованого ПЕГ2. N-кінцева половина домену А2 забарвлена в блакитний колір, а С-кінцева половина - у зелений, епітоп антитіла R8B12 забарвлений темнозеленим (правий зразок FVIII). ПЕГ2 (доріжка 1) і 22 кДа-ПЕГ-ілований ПЕГ2 (доріжка 2) обробляли тромбіном (доріжки 3 і 4, відповідно), а потім наносили на 7%-ий Трис-ацетатний гель (Invitrogen) і забарвлювали антитілом R8B12. Кожна доріжка містить 50 нг FVIII. Фіг. 8. Розщеплення тромбіном ПЕГ-ілованого FVIII дикого типу повної довжини (KG-2). "S" = вихідний матеріал KG-2. "R" = відновлений KG-2, відновлювач вилучений. "Р" = "R", ПЕГ-ілований ПЕГ 43 кДа. "Чистий" = "Р", очищений від надлишку ПЕГ. "L" = легкий ланцюг. ПЕГ-іловані смужки забарвлені точками. Фіг. 9. Забарвлення йодом ПЕГ-ілованого ПЕГ2. 22- або 43 кДа-ПЕГ-ілований ПЕГ2 наносили на 6%-ий Трис-гліциновий гель і забарвлювали антитілом R8B12 до FVIII (доріжки 1 і 2) або йодом (доріжки 3 і 4). Дві плями були вирівняні відповідно до їх маркерних доріжок молекулярної ваги. Доріжки 1 і 2 містять близько 30 нг FVIII, у той час як доріжки 3 і 4 містять близько 2 мкг. Фіг. 10. MALDI-мас-спектрометричний аналіз ПЕГ-ілованого та неПЕГ-ілованого ПЕГ2. MALDIмас-спектрометрія виконувалася на ПЕГ2 (Фіг. 10а) або на 22 кДа-ПЕГ-ілованому ПЕГ2 (Фіг. 10b). Після ПЕГ-ілування пік важкого (Н) ланцюга ПЕГ2 95225 12 значно зменшується та з'являється новий пік (Н+ПЕГ) із центром на 111 кДа (ПЕГ 22 кДа + важкий ланцюг 89 кДа). Очікуваний пік ПЕГ-ілованого легкого (L) ланцюга із центром на 100 кДа (ПЕГ 22 кДа + легкий ланцюг 83 кДа) не виявляється. Фіг. 11. MALDI-мас-спектрометрія ПЕГілованого та неПЕГ-ілованого ПЕГ2 після розщеплення тромбіном. Фіг. 12. MALDI-мас-спектрометричний аналіз ПЕГ-ілованого ПЕГ6 до та після розщеплення тромбіном. Фіг. 13. Профіль поглинання УФ на 280 нм ПЕГ-ілованого ПЕГ2, очищеного на колонці, що використовується при гель хроматографії. Фіг. 14. Профіль поглинання УФ на 280 нм ПЕГ-ілованого та неПЕГ-ілованого ПЕГ6, очищеного на катіон-обмінній колонці. Фіг. 15. Профіль поглинання УФ на 280 нм ПЕГ-ілованого та неПЕГ-ілованого ПЕГ6, на колонці, що використовується в гель хроматографії. Фіг. 16. Порівняння активності ПЕГ-ілованого протеїну з активністю неПЕГ-ілованого протеїну, вимірювана хромогенним аналізом і коагуляційним аналізом. Очищений FVIII повної довжини поданий як KG-2. Отриманий відсоток активності визначався діленням величини зразка, обробленого ПЕГ після відновлення та видалення відновлювана, на величину зразка, обробленого буферним контролем, беручи до уваги результат ПЕГ-ілування. Фіг. 17. Фармакокінетичне (РК) дослідження кролика відносно ПЕГ-ілованого ПЕГ2 порівняно з ПЕГ2. Фіг. 18. PK-дослідження кролика відносно ПЕГілованого ГТЕГ2 порівняно з BDD і ПЕГ2. Рзначення є порівняннями між ПЕГ-ілованим ПЕГ2 і BDD. Фіг. 19. PK-дослідження кролика відносно ПЕГілованого ПЕГ6 порівняно з BDD і ПЕГ6. Фіг. 20. PK-дослідження кролика відносно ПЕГілованого FVIII дикого типу повної довжини ("fl") порівняно з немодифікованим FVIII fl. Фіг. 21. PK-дослідження гемофільної миші відносно ПЕГ-ілованого ПЕГ6 порівняно з BDD і ПЕГ6. Фіг. 22. PK-дослідження нормальної миші відносно 22- і 43 кДа-ПЕГ-ілованого ПЕГ2 порівняно з BDD. Фіг. 23. PK-дослідження 22 нормальної миші відносно ПЕГ-ілованого ПЕГ2 розміром 22 кДа у порівнянні з BDD протягом усього часу. Фіг. 24. Гістограма збору Гемофільного Мишачого (BDD) Фактора VIII, що показує фармакокінетичну оцінку періоду напіввиведення BDD-фактора VIII у двох видів в аналізі гемофільної миші. Фіг. 25. Дослідження розриву нирки гемофільної миші відносно ПЕГ-ілованого ПЕГ2 розміром22 кДа порівнняо з BDD. У результаті обробки носієм миші мали втрату крові 25 мкл/грам ваги тіла. Фіг. 26. Хромогенна активність ПЕГ-ілованого ПЕГ2 і BDD у присутності кількостей, що збільшуються, антитіл до FVIII. Епітоп антитіла зазначений у дужках. Фіг. 27. Хромогенна активність ПЕГ-ілованого ПЕГ2 у присутності кількостей, що збільшуються, антитіл mAB 413 до FVIII. 13 Фіг. 28. Хромогенна активність BDD, 43 кДаПЕГ-ілованого ПЕГ2, 33 кДа-ПЕГ-ілованого ПЕГ6 і 33 кДа-диПЕГ-ілованого ПЕГ2+6 у присутності плазми людини, що походить від пацієнтів, у яких виробилися інгібітори до FVIII. Інгібіторний титр і дані про зібрану кров зазначені зверху. Дві верхні панелі включають дані плазми, зібраної у пацієнтів, розведеної в 5-405 разів. Нижня ліва панель показує розведення 1:15 для пацієнтів із плазмою HRF-828. Нижня права панель підтверджує, що 0,064 МО/мл, використані для кожного зразка FVIII на двох верхніх панелях, не є дозою насичення. Фіг. 29. Метод скринінга та підтвердження ПЕГ-ілування. Верхня панель показує схематичний скринінг ПЕГ-ілування транзієнтно експресованих ПЕГ-мутеїнів. Нижня панель показує Вестерн-аналіз ПЕГ-ілованих продуктів з використанням специфічного антитіла до важкого ("Н") ланцюга (ліворуч) або специфічного антитіла до легкого ("L") ланцюга (праворуч). ПЕГ-іловані смуги забарвлені точками. "U" - необроблений матеріал, що містить як Н, так і L. Фіг. 30. Скринінг ПЕГ-ілування ПЕГ15-17. Вестерн-аналіз ПЕГ-ілованих продуктів з використанням специфічних антитіл до важкого ("Н") ланцюга (R8B12 і 58.12) або специфічних антитіл до легкого ("L") ланцюга антитіл (C7F7 і GM). Всі три мутеїни відібрані по важкому ланцюку, з відносною ефективністю ПЕГ-ілування ПЕГ15~ПЕГ16>ПЕГ17. ПЕГ-іловані смуги забарвлені точками. "U" - необроблений матеріал, що містить як Н, так і L. Фіг. 31. Гель, що показує ПЕГ-ілування ПЕГ2+14 як функцію концентрації відновлювача. ПЕГ2+14 обробляли 67-670 мкМ ТСЕР протягом 30 хв при 4°С. Відновлювач видаляли обертовою колонкою, після чого відбувалось ПЕГ-ілування за допомогою ПЕГ 12 кДа. Важкий і легкий ланцюги FVIII забарвлені "H" і "L", відповідно. Дві точки вказують на важкий та легкий ПЕГ-іловані ланцюги. Фіг. 32. Розгорнуті мас-спектри ПЕГ2+14, обробленого 67 - 670 мкм ТСЕР з вилученим потім відновлювачем. Докладний опис винаходу Цей винахід ґрунтується на відкритті того, що поліпептиди, які мають активність FVIII, можуть бути ковалентно з'єднані на попередньо заданому сайті, що не є N-кінцевим аміном, з біосумісним полімером і що такі поліпептиди значною мірою зберігають свою коагуляційну активність. Крім того, ці поліпептидні кон'югати мають поліпшений час циркуляції в крові та знижену антигенність. Кон'югати відповідно до винаходу мають перевагу над кон'югатами, відомими з рівня техніки, які мають випадкові приєднання полімеру до FVIII або мають приєднання до N-кінця. Сайт-спрямоване приєднання дозволяє конструювати модифікації, які не зачіпають області, необхідні для біологічної активності та, таким чином, істотно зберігають активність FVIII. Воно також дозволяє здійснити приєднання полімерів до блоку зв'язування на сайтах, залучених до виведення FVIII. Сайтспрямоване приєднання також дозволяє одержати більш однорідний продукт, ніж гетерогенні кон'югати, які одержують в рівні техніки шляхом випадкового приєднання полімерів. За рахунок того, що 95225 14 приєднання до N-кінцевого аміну не здійснюється, кон'югати згідно з цим винаходом не втрачають активності при приєднанні ліганду на активному сайті поліпептиду FVIII. Вважають, що N-кінцева область легкого ланцюга бере участь у зв'язуванні фактора vWF з FVIII, що є стабілізуючим зв'язуванням у кровотоці. Визначення Біосумісний полімер. Біосумісний полімер включає поліалкілен оксиди, зокрема, як поліетиленгліколь (ПЕГ), декстрани, коломіникові кислоти або інші полімери засновані на вуглеводнях, полімери амінокислот, похідні біотину, полі вініловий спирт (PVA), полікарбоксилати, полівінілпіролідон, співполімер етилену з ангідридом малеїнової кислоти, співполімер стиролу з ангідридом малеїнової кислоти, поліоксазолін, поліакрилойморфолін, гепарин, альбумін, целюлози, гідролізати хітозану, крохмалі, такі як гідроксіетил-крохмалі та гідроксипропіл-крохмалі, глікоген, агарози і їх похідні, гуарова камедь, пулулан, інулін, ксантанова камедь, карагенан, пектин, гідролізати альгінової кислоти, інші біополімери та будь-які їх еквіваленти. Більш прийнятним є поліетиленгліколь і ще більш прийнятним є метоксиполіетиленгліколь (mPEG). Іншими корисними поліалкіленгліколевими сполуками є поліпропіленгліколі (PPG), полібутиленгліколі (PBG), ПЕГ-гліцидил ефіри (EpoxPEG), ПЕГоксикарбонілімідазол (CDI-PEG), розгалужені поліетиленгліколі, лінійні поліетиленгліколі, вилчасті поліетиленгліколі та багатопроменеві або "надрозгалужені" поліетиленгліколі (star-PEG). Поліетиленгліколь (ПЕГ). "ПЕГ" і "поліетиленгліколь" використовуються тут взаємозамінно та включають будь-який водорозчинний полі(етиленоксид). У типовому випадку, ПЕГі для використання відповідно до винаходу включають такі структури: "--(ОСН2СН2)n--", де (n) - від 2 до 4000. Використовуваний тут ПЕГ також включає "СН2СН2-О(СН2СН2О)n -СН2СН2--" і "-(ОСН2СН2)nО--", залежно від того, заміщені або не заміщені термінальні кисні. У всьому описі та пунктах формули винаходу варто пам'ятати, що термін "ПЕГ" включає структури, що мають різні термінальні та "кінцеві кепувальні" групи, такі, без обмеження, як гідроксильна або С1-20-алкокси група. Термін "ПЕГ" також означає полімер, що містить більшість, тобто понад 50%, субодиниць, що повторюються -- ОСН2СН2--. Що стосується специфічних форм, ПЕГ може мати будь-яку кількість різновидів молекулярних ваг, а також структур або геометрій, таких як розгалужена, лінійна, вилчаста та багатофункціональна. ПЕГ-ілування. ПЕГ-ілування - це процес, за допомогою якого поліетиленгліколь (ПЕГ) ковалентно приєднується до молекули, такої як протеїн. Активована або активна функціональна група. Коли функціональна група, така як біосумісний полімер, позначається як активована, функціональна група легко реагує з електрофілом або нуклеофілом на іншій молекулі. FVIII з делетованим В-доменом (BDD). Термін BDD, що вживається тут, характеризується наявністю амінокислотної послідовності, у якій є делеція всіх, крім 14-ти, амінокислот В-домену FVIII. Перші 4 амінокислоти В 15 домену ((SFSQ, SEQ ID NO:1) зв'язані з 10 останніми залишками В-домену (NPPVLKRHQR, SEQ ID NO:2). (Lind, P. et al., 1995, Eur. J. Biochem. 232, pp. 19-27). Використовуваний тут BDD має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3. FVIII. Фактор VIII (FVIII) згортання крові являє собою глікопротеїн, що синтезується та виділяється у кровотік печінкою. При циркуляції крові він зв'язується з фактором фон Вілебранда (vWF, також відомим як родинний Фактору VIII антиген) з утворенням стійкого комплексу. Після активації тромбіном він дисоціює від комплексу та взаємодіє з іншими факторами згортання крові в коагуляційному каскаді, що у підсумку веде до утворення тромбів. Людський FVIII повної довжини має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4, хоча можливі алельні варіанти. Функціональний поліпептид фактора VIII. Термін "функціональний поліпептид фактора VIII", що вживається тут, означає функціональний поліпептид або комбінацію поліпептидів, яка здатна, in vivo або in vitro, коректувати недостатність фактора VIII у людини, що характеризується, наприклад, гемофілією А. У натуральному стані фактор VIII має численні деградаційні та процесовані форми. Як показано тут, вони походять протеолітично з попередника, одноланцюжкового протеїну. Такий одноланцюжковий протеїн, а також різні деградаційні продукти, які мають біологічну активність корекції недостатності фактора VIII у людини, будуть функціональним поліпептидом фактора VIII. Імовірно, існують алельні варіанти. Функціональними поліпептидами фактора VIII будуть всі такі алельні варіації, глікозиловані варіанти, модифікації та фрагменти, що приводять до похідних фактора VIII тією мірою, наскільки вони містять функціональний сегмент людського фактора VIII, і особлива, характерна для людського фактора VIII функціональна активність залишається по суті не порушеною. Ці похідні фактора VIII, що мають необхідну функціональну активність, можуть бути легко ідентифіковані описаними тут простими in vitro-тестами. Крім того, функціональний поліпептид фактора VIII здатний каталізувати конверсію фактора X на Ха в присутності фактора ІХа, кальцію та фосфоліпіду, а також коректувати коагуляційний дефект у плазмі, що походить від уражених гемофілією А індивідуумів. Розкрита тут послідовність людського фактора VIII, амінокислотні послідовності і їх функціональні області роблять очевидними для фахівців у цій галузі техніки фрагменти, які можуть бути виділені за допомогою розрізування рестрикційними ферментами ДНК або протеолітичної або іншої деградації протеїну людського фактора VIII. Термін "FIX", що вживається тут, означає Коагуляційний Фактор IX, що також відомий як Людський Фактор IX Згортання Крові або Тромбопластиновий Компонент Плазми. Термін "FX", що вживається тут, означає Коагуляційний Фактор X, що також відомий за назвою Людський Фактор X Згортання Крові та під епонімом фактор Стюарта-Прауера. Фармакокінетика. "Фармакокінетика" ("РК") цей термін використовується для опису властивостей поглинання, розподілу, метаболізму та елімі 95225 16 нування лікарського засобу в тілі. Поліпшення фармакокінетики лікарського засобу означає поліпшення тих його характеристик, які роблять лікарський засіб більш ефективним in vivo як терапевтичний агент, особливо тривалості його корисної дії в тілі. Мутеїн. Мутеїн являє собою отриманий за допомогою генетичної інженерії протеїн, що виникає як результат мутації протеїну або поліпептиду, що індукується у лабораторії. Терміни "протеїн" і "поліпептид", що вживаються тут, є синонімами. Термін "рецептор виведення FVIII", що вживається тут, означає рецепторну область на функціональному поліпептиді FVIII, що зв'язується або з'єднується з однією або більше іншими молекулами, що приводить до виведення FVIII з кровотоку. Рецептори виведення фактора VIII включають, зокрема, області молекули FVIII, які зв'язуються з LRP, LDL-рецептором і/або HSPG. Обговорення Вважається, що будь-який функціональний поліпептид фактора FVIII може бути мутований у попередньо заданому сайті, а потім ковалентно з'єднаний у цьому сайті з біосумісним полімером згідно зі способами відповідно до винаходу. Придатними поліпептидами є, зокрема, повнорозмірний фактор FVIII з амінокислотною послідовністю, показаною в SEQ ID NO:4, і BDD FVIII, що має амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3. BDD FVIII є більш прийнятним. Біосумісний полімер, використовуваний у кон'югатах відповідно до винаходу, може являти собою будь-який з полімерів, зазначених вище. Біосумісний полімер вибирається для того, щоб досягти бажаного поліпшення у фармакокінетиці. Наприклад, ідентичність, розмір і структура полімеру вибирається так, щоб збільшити період напіввиведення поліпептиду, що має активність FVIII, із кровотоку або щоб зменшити антигенність поліпептиду без небажаного зниження його активності. Більш прийнятно, полімер включає ПЕГ, і ще більш прийнятно має, принаймні, 50% молекулярної ваги ПЕГ. В одному варіанті виконання полімер являє собою поліетиленгліколь, термінально кепований кінцевим кепуючим фрагментом, таким як гідроксил, алкокси, заміщене алкокси, алкенокси, заміщене алкенокси, алкінокси, заміщене алкінокси, арилокси та заміщене арилокси. Ще більш прийнятними є полімери, що включають метоксиполіетиленгліколь. І ще більш прийнятними є полімери, що включають метоксиполіетиленгліколь, що має розмір в інтервалі від 3 кДа до 100 кДа, і більш прийнятно - від 5 кДа до 64 кДа або від 5 кДа до 43 кДа. Більш прийнятно, полімер містить реакційний фрагмент. Наприклад, в одному варіанті виконання винаходу полімер містить сульфгідрильний реакційний фрагмент, що може реагувати із цистеїном функціонального поліпептиду фактора FVIII з утворенням ковалентного зв'язку. Такі сульфгідрильні реакційні фрагменти охоплюють тіол, трифлат, трезилат, азиридин, оксиран, S-піридил або малеїмідні фрагменти. Більш прийнятним є малеїмідний фрагмент. В одному виконанні полімер є 17 лінійним і має на одному кінці "кеп", що не є дуже сильно реактивним щодо сульфгідрилів (такий як метоксисполука), і на іншому кінці - сульфгідрильний реакційний фрагмент. У більш прийнятному виконанні кон'югат включає ПЕГ-малеїмід і має розмір в інтервалі від 5 кДа до 64 кДа. У наведених далі прикладах подані рекомендації з вибору придатних біосумісних полімерів. Сайт-спрямована мутація нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який має активність FVIII, може бути здійснена будь-яким методом, відомим у цій галузі техніки. Більш прийнятні методи включають мутагенез із метою введення цистеїнового кодона в сайт, вибраний для ковалентного приєднання полімеру. Це можна виконати, використовуючи комерційно доступний набір для сайт-спрямованого мутагенезу, такий як набір для сайт-спрямованого мутагенезу Stratagene cQuickChange II, набір для сайт-спрямованого мутагенезу № К1600-1 Clontech Transformer, система для сайт-спрямованого мутагенезу № 12397014 Invitrogen GenTaylor, набір системи для сайт-спрямованого мутагенезу in vitro № Q6210 Promega Altered Sites II або набір для ПЛРмутагенезу № ТАK RR016 Takara Minis Bio LA. Кон'югати відповідно до винаходу можуть бути отримані шляхом первісного заміщення кодона однієї або більше амінокислот на поверхні функціонального поліпептиду FVIII кодоном цистеїну з подальшим одержанням цистеїнового мутеїну в рекомбінантній експресійній системі, проведенням реакції мутеїну із цистеїн-специфічним полімерним реагентом і очищенням мутеїну. У цьому способі додавання полімеру до сайту цистеїну може виконуватись за рахунок малеїміду, функціонально активного на полімері. Приклади цієї технології наведені нижче. Кількість використовуваного сульфгідрильного реакційного полімеру має бути, принаймні, еквімолярною молярній кількості цистеїнів, які повинні бути продуковані, а більш прийнятно перебувати в надлишку. Більш прийнятно, сульфгідрильний реакційний полімер використовується, принаймні, в 5-кратному молярному надлишку, і ще більш прийнятно використовується, принаймні, у десятикратному надлишку. Інші умови, сприятливі для ковалентного приєднання, входять в обсяг знань фахівця ц цій галузі техніки. У прикладах, які наведені нижче, мутеїни мають традиційні в цій галузі техніки назви. Повнорозмірна амінокислотна послідовність зрілого Фактора VIII, що наведена в SEQ ID NO:4, є основою для надання назв мутантам. Будучи секретованим протеїном, FVIII містить сигнальну послідовність, що протеолітично відщепляється під час трансляційного процесу. Після видалення сигнальної послідовності з 19 амінокислот першою амінокислотою секретованого FVIII-продукту є аланін. Коли йдеться про мутовані амінокислоти в BDD-FVIII, мутовані амінокислоти позначаються в цьому документі у традиційний спосіб їх положенням у послідовності FVIII повної довжини. Наприклад, розглянутий нижче мутеїн ПЕГ6 позначається K1808С, оскільки в ньому лізин (К) у положенні, 95225 18 аналогічному положенню 1808 у послідовності повної довжини, замінений на цистеїн (С). Попередньо заданий сайт для ковалентного зв'язування полімеру краще за все вибирати із сайтів, розташованих на поверхні поліпептиду, які не впливають на активність FVIII або інші механізми, які стабілізують FVIII in vivo, такі як зв'язування з vWF. Крім того, краще вибирати такі сайти, участь яких відома в механізмах, за допомогою яких FVIII деактивується або виводиться із кровотоку. Докладно вибір таких сайтів розглядається нижче. Більш прийнятні сайти охоплюють амінокислотний залишок на або поблизу сайту зв'язування (а) протеїну, родинного рецептора ліпопротеїну низької щільності, (b) гепаринсульфат протеоглікану, (с) рецептора ліпопротеїну низької щільності та/або (d) антитіл, що інгібуються фактор FVIII. Вираз "на або поблизу сайту зв'язування" означає залишок, що перебуває досить близько до сайту зв'язування, так що ковалентне приєднання біосумісного полімеру до цього сайту привело б до стеричного пошкодження сайту зв'язування. Передбачається, що такий сайт, приміром, перебуває в межах 20 Å від сайту зв'язування. В одному варіанті виконання винаходу біосумісний полімер ковалентно приєднаний до функціонального поліпептиду фактора VIII на амінокислотному залишку в або поблизу (а) рецептора виведення фактора VIII, як визначено вище, (b) сайту зв'язування протеази, здатної деградувати фактор VIII, і/або (с) сайту зв'язування інгібіторних антитіл до фактора VIII. Протеази можуть бути активовані протеїном С (АРС). В іншому варіанті виконання винаходу біосумісний полімер ковалентно приєднаний до функціонального поліпептиду фактора VIII у попередньо заданому сайті, так що зв'язування протеїну родинного рецептора ліпопротеїну низької щільності з поліпептидом є більше слабким, ніж з тим самим поліпептидом, коли він некон'югований, і більш прийнятно слабкішим більш ніж у два рази. В одному варіанті виконання винаходу біосумісний полімер ковалентно приєднаний до функціонального поліпептиду фактора VIII у попередньо заданому сайті, так що зв'язування гепаринсульфат протеогліканів з поліпептидом є більш слабким, ніж з тим самим поліпептидом, коли він некон'югований, і більш прийнятно слабкішим більше ніж у два рази. У наступному варіанті виконання винаходу біосумісний полімер ковалентно приєднаний до функціонального поліпептиду фактора VIII у попередньо заданому сайті, так що зв'язування інгібіторних антитіл до фактора VIII з поліпептидом є більш слабким, ніж з тим самим поліпептидом, коли він некон'югований, більш прийнятно слабкішим більше ніж у два рази, ніж зв'язування із цим поліпептидом, коли він некон'югований. В іншому виконанні біосумісний полімер ковалентно приєднаний до функціонального поліпептиду фактора VIII у попередньо заданому сайті, так що зв'язування рецептора ліпопротеїну низької щільності з поліпептидом є більш слабким, ніж з тим самим поліпептидом, коли він некон'югований, більш прийнятно слабкішим більше ніж у два рази. В іншому варіанті виконання винаходу біосумісний полімер ковалентно приєднаний до функціональ 19 ного поліпептиду фактора VIII у попередньо заданому сайті, так що протеаза плазми деградує поліпептид слабкіше, ніж коли цей поліпептид некон'югований. У наступному варіанті виконання винаходу деградація поліпептиду протеазою плазми є більш ніж у два рази слабкішою, ніж деградація цього поліпептиду, коли він некон'югований, за таких самих умов і за такий самий період часу. Спорідненість зв'язування LRP, LDL і HSPG з FVIII можна визначити, використовуючи методику поверхневого плазмонного резонансу (Biacore). Наприклад, FVIII може бути нанесений прямо або опосередковано через FVIII-антитіло на Biacoreчип, і, пропускаючи через чип різні концентрації LRP, можна виміряти як швидкість асоціації, так і швидкість дисоціації (Bovenschen N. et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(11), pp. 9370-7). Співвідношення двох швидкостей дає величину спорідненості. При ПЕГ-ілуванні було б бажаним дворазове, більш прийнятно п'ятикратне, ще більш прийнятно десятикратне та ще більш прийнятно 30-кратне зниження спорідненості. Деградація FVIII протеазою АРС може вимірюватись будь-якими методами, відомими фахівцям у цій галузі техніки. В одному варіанті виконання винаходу біосумісний полімер ковалентно приєднаний до поліпептиду в одному або більше положеннях амінокислот 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 і 2284 фактора VIII. В іншому варіанті виконання винаходу біосумісний полімер ковалентно приєднаний до поліпептиду в одному або більше положеннях амінокислот 377, 378, 468, 491, 504, 556, 1795, 1796, 1803,1804, 1808, 1810,1864,1903, 1911 і 2284 фактора VIII, і (1) зв'язування кон'югата із протеїном, родинним рецептору ліпопротеїну низької щільності, є меншим, ніж зв'язування некон'югованого поліпептиду із протеїном, родинним рецептору ліпопротеїну низької щільності; (2) зв'язування кон'югата з рецептором ліпопротеїну низької щільності є меншим, ніж зв'язування некон'югованого поліпептиду з рецептором ліпопротеїну низької щільності; або (3) зв'язування кон'югата як із протеїном, родинним рецептору ліпопротеїну низької щільності, так і з рецептором ліпопротеїну низької щільності є меншим, ніж зв'язування некон'югованого поліпептиду із протеїном, родинним рецептору ліпопротеїну низької щільності, і з рецептором ліпопротеїну низької щільності. В іншому варіанті виконання винаходу біосумісний полімер ковалентно приєднаний до поліпептиду в одному або більше положеннях амінокислот 377, 378, 468, 491, 504, 556 і 711 фактора VIII, і зв'язування кон'югата з гепаринсульфат протеогліканом менше, ніж зв'язування некон'югованого поліпептиду з гепаринсульфат протеогліканом. У наступному варіанті виконання винаходу біосумісний полімер ковалентно приєднаний до поліпептиду в одному або більше положеннях амінокислот 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 і 2284 фактора VIII, і кон'югат має менше зв'язування з інгібіторними антиті 95225 20 лами до фактора VIII, ніж некон'югований поліпептид. У наступному варіанті виконання винаходу біосумісний полімер ковалентно приєднаний до поліпептиду в одному або більше положеннях амінокислот 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 і 2284, і більш прийнятно в одному або більше положеннях з 377, 378, 468, 491 504, 556, і 711 фактора VIII, і кон'югат піддається меншій деградації протеазою плазми, здатною деградувати фактор VIII, ніж некон'югований поліпептид. Ще більш прийнятним є, щоб протеаза плазми була активованим протеїном С. У наступному варіанті виконання винаходу біосумісний полімер ковалентно приєднаний до фактора VIII з делетованим В-доменом у положеннях амінокислот 129, 491, 1804 і/або 1808, більш прийнятно в положеннях 491 або 1808. У наступному варіанті виконання винаходу біосумісний полімер приєднаний до поліпептиду фактора VIII у положенні амінокислоти 1804 і включає поліетиленгліколь. Більш прийнятно, один або більше попередньо заданих сайтів для приєднання біосумісного полімеру контролюються сайт-специфічною мутацією цистеїну. Попередньо заданими сайтами для приєднання біополімеру можуть бути один або більше сайтів, більш прийнятно один або два сайти, на функціональному поліпептиді фактора VIII. У конкретних виконаннях поліпептид є моноПЕГілованим або диПЕГ-ілованим. Винахід також стосується способу одержання кон'югата, що передбачає введення мутації в нуклеотидну послідовність, що кодує функціональний поліпептид фактора VIII, для заміщення послідовності на цистеїновий кодон у попередньо заданому сайті; експресію мутованої нуклеотидної послідовності, щоб отримати поліпшений цистеїном мутеїн; очищення мутеїну; реагування мутеїну з біосумісним полімером, що активований для реакції з поліпептидами по суті тільки з відновленими цистеїновими залишками, так що утворюється кон'югат; і очищення кон'югата. Іншим варіантом виконання винаходу є спосіб сайт-спрямованого ПЕГілування мутеїну фактора VIII, що включає: (а) експресію сайт-спрямованого мутеїну фактора VIII, де мутеїн має цистеїнове заміщення амінокислотного залишку на зовнішній поверхні мутеїну фактора VIII і цей цистеїн кепують; (b) контактування цистеїнового мутеїну з відновлювачем в умовах, у яких цистеїновий мутеїн м'яко відновлюється та відокремлюється кеп; (с) видалення кепу та відновлювана з цистеїнового мутеїну; і (d) через, принаймні, близько 5 хвилин, більш прийнятно, принаймні, 15 хвилин, ще більш прийнятно, принаймні, 30 хвилин, після видалення відновлювача, обробляють цистеїновий мутеїн ПЕГом, що включає сульфгідрильний зв'язувальний фрагмент, за таких умов, щоб утворився ПЕГ-ілований мутеїн фактора VIII. Сульфгідрильний зв'язувальний фрагмент ПЕГ, вибирають із групи, що складається з тіолу, трифлату, трезилату, азиридину, оксирану, S-піридилу та малеїмідних засобів, більш прийнятно малеїміду. 21 Винахід також стосується фармацевтичних композицій для парентерального введення, що включають терапевтично ефективні кількості кон'югатів цього винаходу та фармацевтично прийнятний ад'ювант. Фармацевтично прийнятні ад'юванти є речовинами, які можуть додаватися до активного інгредієнта, щоб допомогти сформулювати або стабілізувати препарат і не викликати будь-яких значних небажаних токсикологічних ефектів у пацієнта. Приклади таких ад'ювантів добре відомі фахівцям у цій галузі техніки та включають воду, цукри, такі як мальтоза або сахароза, альбумін, солі тощо. Інші ад'юванти описані, наприклад, E.W. Martin в Remington's Pharmaceutical Sciences. Такі композиції будуть містити ефективну кількість описаного тут кон'югата разом з підхожою кількістю носія, для того, щоб приготувати фармацевтично прийнятні композиції, придатні для ефективного введення хазяїну. Наприклад, кон'югат може бути парентерально введений особам, що страждають на гемофілію А, у дозі, що може змінюватися залежно від важкості випадку кровотечі. Середні дози, що вводять внутрівенно, перебувають у межах 40 одиниць на кілограм за передопераційними показниками, 15-20 одиниць на кілограм при невеликій кровотечі та 20-40 одиниць на кілограм, які вводять протягом 8годинного періоду як підтримуючу дозу. В одному варіанті виконання винаходу спосіб включає заміщення однієї або більше розташованих на поверхні BDD амінокислот цистеїном, одержання цистеїнового мутеїну в експресійній системі ссавців, відновлення цистеїну, що був кепований під час експресії цистеїном, із середовища вирощування, видалення відновлювана, щоб дати можливість BDD-дисульфідам відновити структуру, і реагування з реагентом цистеїнспецифічного біосумісного полімеру, такого як ПЕГ-малеїмід. Прикладами таких реагентів є ПЕГмалеїмід з розмірами ПЕГ 5, 22 або 43 кДа, доступний від Nektar Therapeutics (Сан Карлос, Каліф.) під номерами каталогу Nektar 2D2M0H01 mPEGMAL MW 5000 Так, 2D2M0P01 mPEG-MAL MW 20 кДа, 2D3Χ0Ρ01 mPEG2-MAL MW 40 кДа, відповідно, або 12 чи 33 кДа, доступні від NOF Corporation (Токіо, Японія) під номерами каталогу NOF Sunbright ME-120MA і Sunbright ME-300MA, відповідно. ПЕГ-ілований продукт очищають, використовуючи іонообміну хроматографію для видалення ПЕГ, що не прореагував, і гель-хроматографію для видалення BDD, що не прореагував. Цей метод може використовуватись для ідентифікації та вибіркового захисту від будь-яких небажаних взаємодій з FVIII, таких як опосередковане рецептором виведення із кровотоку, зв'язування інгібіторними антитілами та деградація протеолітичними ферментами. Нами помічено, що ПЕГ-реагент, що поставляє Nektar або NOF як такий, що має розмір, 5 кДа, протестований у нашій лабораторії виявився таким, що має розмір 6 кДа, і, аналогічно, ПЕГреагент, який поставляється як лінійний 20 кДа, за тестуванням виявився таким, що має розмір 22 кДа; який поставляється як 40 кДа за тестуванням мав 43 кДа; і який поставляється як 60 кДа, відповідно до тестів у нашій лабораторії мав 64 кДа. 95225 22 Щоб уникнути плутанини, ми тут в обговоренні використовуємо молекулярну вагу, визначену у нашій лабораторії, за винятком ПЕГ 5 кДа, про який ми говоримо як про такий, що має розмір 5 кДа, як він ідентифікований виробником. На додаток до цистеїнових мутацій у положеннях 491 і 1808 в BDD (розкрито вище) були здійснені цистеїнові мутації в положеннях 487, 496, 504, 468, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803 і 1804, щоб потенційно блокувати LRPзв'язування після ПЕГ-ілування. Крім того, щоб після ПЕГ-ілування блокувати LRP- і HSPGзв'язування, були здійснені цистеїнові мутації в положеннях 377, 378 і 556. Положення 81, 129, 422, 523, 570, 1864, 1911, 2091 і 2284 були вибрані як рівнорозташовані на BDD, щоб сайтспрямоване ПЕГ-ілування ПЕГами великого розміру (>40 кДа) у цих положеннях разом з ПЕГілуванням на нативних сайтах глікозилування (41, 239 і 2118) і сайтах LRP-зв'язування повністю охоплювало поверхню BDD і щоб можна було ідентифікувати новий механізм виведення із кровотоку для BDD. В одному варіанті виконання винаходу середовище для культивування клітин містить цистеїни, які "кепують" цистеїнові залишки в мутеїні за допомогою утворення дисульфідних зв'язків. При приготуванні кон'югата цистеїновий мутеїн, продукований у рекомбінантній системі, кепують цистеїном із середовища культивування та цей кеп видаляють шляхом м'якого відновлення, що звільняє кеп, перед додаванням цистеїн-специфічного полімерного реагенту. Інші методи, відомі в цій галузі для сайт-специфічної мутації FVIII, також можуть використовуватись, оскільки вони очевидні для фахівця в цій галузі. Приклади Аналіз активності структурних зв'язків FVIII. FVIII і BDD-FVIII є дуже великими складними молекулами з багатьма різними сайтами, залученими в біологічні реакції. Попередні спроби ковалентно модифікувати їх, щоб поліпшити фармакокінетичні властивості, мали суперечливі результати. Те, що молекули можна було специфічно мутувати, а потім у сайт-специфічний спосіб додавати полімер, було несподіваним. Крім того, несподіваними були також результати в поліпшенні фармакокінетичних властивостей і збереженні активності, беручи до уваги, що раніше відомим полімерним кон'югатам були притаманні проблеми виникнення неспецифічного збільшення та зменшення активності. В одному варіанті виконання винаходу передбачається сайт-спрямований мутагенез із використанням цистеїн-специфічних лігандів, таких як ПЕГ-малеїмід. Немутований BDD не має будь-яких цистеїнів, доступних для реагування з ПЕГмалеїмідом, так що тільки мутоване положення цистеїну було б сайтом ПЕГ-ілування. Більш конкретно, BDD-FVIII містить 19 цистеїнів, 16 з яких утворюють дисульфіди та інші 3 з яких є вільними цистеїнами (McMullen et al., 1995, Protein Sci. 4, pp. 740-746). Структурна модель BDD передбачає, що всі 3 вільні цистеїни перебувають усередині структури (Stoliova-McPhie et al., 2002, Blood 99, pp. 1215-1223). Оскільки окислені цистеїни не можуть 23 бути ПЕГ-іловані ПЕГ-малеїмідами, то 16 цистеїнів, які утворюють в BDD дисульфіди, не можуть бути ПЕГ-іловані, поки спочатку не будуть відновлені. На підставі структурної моделі BDD 3 вільні цистеїни в BDD не можуть бути ПЕГ-іловані без попередньої денатурації протеїну, щоб ці цистеїни стали доступними ПЕГ-реагенту. Таким чином, неочевидною є можливо досягти специфічного ПЕГ-ілування BDD ПЕГ-ілуванням на нативних цистеїнових залишках без істотної зміни структури BDD, що, досить ймовірно, приведе до порушення його функції. Окислювально-відновний стан 4-х цистеїнів у В-домені FVIII повної довжини невідомий. ПЕГілування 4-х цистеїнів у В-домені може бути можливим, якщо вони не утворюють дисульфідів і розташовані на поверхні структури. Однак, оскільки повнорозмірна FVIII і BDD мають подібний фармакокінетичний (РК) профіль і подібні періоди напіввиведення in vivo (Gruppo et al., 2003, Haemophilia 9, pp. 251-260), те малоймовірно, що ПЕГ-ілування В-домену приведе до поліпшення періоду напіввиведення із плазми, якщо тільки не виявиться, що ПЕГ також захищає області, що не належать до Вдомену. Щоб попередньо визначити сайт поліпептиду, що має активність FVIII, для приєднання полімеру, який збереже активність фактора VIII і поліпшить фармакокінетику, пропонуються такі рекомендації, основані на BDD-FVIII. Модифікації повинні бути спрямовані на механізми виведення, інактивації та імуногенні механізми, такі як LRP, HSPG, АРС, і на сайти зв'язування інгібіторних антитіл. Структура BDD показана в Stoilova-McPhie, S. et al., 2002, Blood 99(4), pp. 1215-23. Наприклад, щоб пролонгувати період напіввиведення, можна ввести одиничний ПЕГ у специфічний сайт на або поблизу сайтів LRP-зв'язування в інтервалі залишків 484509 домену А2 і в інтервалі залишків 1811-1818 домену A3. Введення об'ємного ПЕГ у ці сайти має перервати здатність FVIII зв'язуватися з LRP і зменшити виведення FVIII із кровотоку. Передбачається також, що для пролонгування періоду напіввиведення без значного впливу на активність ПЕГ може бути введений на залишок 1648, що перебуває на сполученні В-домену та A3-домену в молекулі повної довжини, і в 14-амінокислотний лінкер І BDD між доменами А2 і A3. Специфічність ПЕГ-ілування можна досягти шляхом введення одиничних цистеїнових залишків у домени А2 або A3, використовуючи методики мутагенезу за допомогою рекомбінантних ДНК, застосовуючи після цього сайт-специфічне ПЕГілування введеного цистеїну за допомогою цистеїн-специфічного ПЕГ-реагенту, такого як ПЕГмалеїмід. Інша перевага ПЕГ-ілування на залишках 484-509 і 1811-1818 полягає в тому, що ці два епітопи представляють два із трьох головних класів інгібіторних антигенних сайтів у пацієнтів. Для досягнення максимального ефекту поліпшення періоду напіввиведення із кровотоку та зменшення імуногенної відповіді можна ПЕГ-ілувати як А2, так A3 сайти LRP-зв'язування, щоб одержати диПЕГілований продукт. Слід зазначити, що ПЕГілування усередині області 1811-1818 може приз 95225 24 вести до значної втрати активності, тому що ця область залучена також у зв'язування FIX. Сайтспрямоване ПЕГ-ілування усередині області 558565 має усунути HSPG зв'язування, однак, може також знизити активність, оскільки ця область також зв'язується з FIX. Щоб ідентифікувати новий механізм виведення FVIII, можна також ПЕГ-ілувати додаткові сайти на його поверхні. ПЕГ-ілування домену А2 може надати додаткову перевага в тому, що домен А2 дисоціює від FVIII після активації та, ймовірно, вилучається із кровотоку швидше, ніж залишок молекули FVIII, через його менший розмір. З іншого боку, ПЕГ-ілований А2 може виявитися досить великим, щоб уникнути виведення нирками, і мати період напіввиведення із плазми, порівнянний з таким для залишку FVIII і, таким чином, можна відновити активований FVIII in vivo. Ідентифікація сайтів ПЕГ-ілування в областях А2 і A3. П'ять положень (Y487, L491, К496, L504 і Q468, що відповідають положенням PEG 1-5) в або поблизу передбачуваної області LRPзв'язування А2 були вибрані як приклади сайтспрямованого ПЕГ-ілування, ґрунтуючись на поверхневому розташуванні та напрямку у зовнішній бік траєкторії С-С. Крім того, ці залишки приблизно рівновіддалені один від одного в просторовій структурі молекули, тому разом вони можуть представляти цілу область. Вісім положень (1808, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803, 1804, що відповідають PEG6-14) в або поблизу передбачуваної області LRP-зв'язування A3 були вибрані як приклади для проведення сайт-спрямованого ПЕГілування. ПЕГ6 (K1808) межує з 1811-1818 і природним N-зв'язаним сайтом глікозилування в положенні 1810. ПЕГ-ілування в положенні 1810 (ПЕГ7) приводить до заміщення цукру на ПЕГ. Мутація в положенні Т1812 ПЕГ8 також ліквідує сайт глікозилування. Хоча, як передбачувалось, ПЕГ9положення (K1813) спрямоване всередину структури, воно було вибране на випадок, якщо модель структури є неправильною. ПЕГ10 (Y1815) є об'ємною гідрофобною амінокислотою усередині петлі LRP-зв'язування та може бути основним залишком взаємодії, оскільки гідрофобні амінокислоти звичайно перебувають у центрі протеїн-протеїнових взаємодій. Оскільки область 1811-1818, як було зазначено, бере участь у зв'язуванні як LRP, так і FIX, то було зроблене припущення, що ПЕГілування усередині цієї петлі може призвести до зниженої активності. У зв'язку із цим, поблизу петлі 1811-1818, але не усередині її, були сконструйовані ПЕГ11-ПЕГ14 (1795, 1796, 1803, 1804), щоб стала можливою дисоціація зв'язування LRP і FIX з ПЕГ різних розмірів. Щоб одночасно блокувати обидва сайти LRPзв'язування, можна здійснити подвійне ПЕГілування, наприклад, у положеннях ПЕГ2 і ПЕГ6. Тому що область 558-565, як було показано, зв'язується як з HSPG, так і з FIX, усередині цієї області сайти не створювалися. Замість цього, між областями LRP-і HSPG-зв'язування А2 були сконструйовані ПЕГ15-ПЕГ17 (377, 378 і 556), щоб приєднаний ПЕГ міг як перешкоджати взаємодіям так і переривати можливі взаємодії між ними. Додаткові 25 сайти, які розташовані на поверхні та спрямовані назовні, могли б бути вибрані усередині або поблизу областей LRP- і HSPG-зв'язування. Щоб ідентифікувати нові механізми виведення, можна систематично ПЕГ-ілувати FVIII. На додаток до ПЕГ117 у якості прив'язувальних точок для ПЕГілування можна використати три інші природні сайти глікозилування, а саме N14, N239 і N2118, що відповідають ПЕГ18-20, оскільки вони повинні бути розташовані на поверхні. На BDD-моделі на додаток до сайтів функціональної взаємодії для vWF, FIX, FX, фосфоліпіду та тромбіну були картовані області поверхні в радіусі 20 ангстрем від С-атомів ПЕГ2, ПЕГ6, а також чотири сайти глікозилування. Потім, ґрунтуючись на їх можливості охоплювати майже повністю поверхню BDD, що залишається, з радіусом 20 ангстрем від кожного з їх Сатомів, були вибрані ПЕГ21-29, що відповідають Y81, F129, K422, K523, K570, N1864, Т1911, Q2091 і Q2284. Оскількиці положення повністю розташовані на поверхні, є спрямованими назовні та перебувають далеко від природних цистеїнів, вони також були вибрані, щоб мінімізувати можливі некоректні утворення дисульфідів. Радіус 20 ангстрем був вибраний тому що, передбачається, що великий ПЕГ, такий як розгалужений ПЕГ 64 кДа, має можливість охопити сферу з радіусом близько 20 ангстрем. ПЕГ-ілування ПЕГ21-29 разом з ПЕГ2 і ПЕГ6 і сайтами глікозилування ПЕГ18, 19 і 20 ймовірно захистить майже повністю нефункціональну поверхню FVIII. Положення ПЕГ-ілування, які приводять до покращених властивостей, таких як поліпшений РКпрофіль, більше висока стабільність або зменшена імуногенність, можуть бути скомбіновані, щоб одержати мультиПЕГ-ілований продукт із максимально поліпшеними властивостями. ПЕГ30 і ПЕГ31 були сконструйовані за допомогою видалення дисульфідів, розташованих на поверхні А2- і А3-доменів, відповідно. Для проведення ПЕГілування ПЕГ30, або С630А повинен бути звільнений від свого дисульфідного партнера С711. Також, ПЕГ31, С1899А повинні дати можливість С1903 бути ПЕГ-ілованим. Мутагенез. Субстрати для сайт-спрямованого ПЕГ-ілування FVIII можуть бути створені введенням цистеїнового кодона в сайт, вибраний для ПЕГ-ілування. Для одержання всіх ПЕГ-мутантов використовували набір для сайт-спрямованого мутагенезу Stratagene cQuickChange II (набір Stratagene 200523 від Stratagene Corporation, Ла Йола, Каліф.). Метод сайт-спрямованого мутагенезу cQuickChange здійснювали, використовуючи PfuTurbo Днк-полімеразу та температурний циклер. Два комплементарні олігонуклеотидні праймери, що містять бажану мутацію, елонгували, використовуючи PfuTurbo, що не зміщає праймери. Як матрицю використовували двониткову ДНК, що містить ген FVIII дикого типу. Після множини циклів елонгації продукт розщеплювали ендонуклеазою Dpnl, що є специфічною до метилованої ДНК. Новосинтезована ДНК, що містить мутацію, не була метилованою, у той час як батьківська ДНК дикого типу була метилованою. Роз 95225 26 щеплену ДНК потім використовували для трансформації супер-компетентних XL-1 Blue клітин. Ефективність мутагенезу склала майже 80%. Реакції мутагенезу здійснювали або в pSK207+BDD C2.6, або в pSK207+BDD (Фігура 1). Успішний мутагенез підтверджувався ДНКсеквенуванням, і підхожі фрагменти, що містять мутацію, включалися в основну ділянку вектора експресії ссавців pSS207+BDD, що кодує FVIII. Після введення всі мутації знову підтверджувалися секвенуванням. Для A3-мутеїнів ПЕГ 6, 7, 8, 9 і 10 мутагенез проводили у векторі pSK207+BDD C2.6. Після підтвердження секвенуванням мутантний фрагмент Kpnl/Pme субклонували в pSK207+BDD. BDD-мутеїн потім субклонували в експресувальний вектор pSS207+BDD. Для A3мутеїнів ПЕГ 11, 12, 13, 14 мутагенез проводили безпосередньо у векторі pSK207+BDD, і підтверджений секвенуванням мутант BDD потім субклонували в pSS207+BDD. Для А2-мутеїнів ПЕГ 1, 2, 3, 4 і 5 мутагенез проводили у векторі pSK207+BDD C2.6. Підтверджений секвенуванням мутант субклонували в pSK207+BDD, а потім в pSS207+BDD. Праймери (тільки смислова нитка), використані для мутагенезу, зазначені для кожної реакції: ПЕГ1, Y487C: GATGTCCGTCCTTTGTGCTCAAGGAGATTACCA (SEQ ID NO:5) ПЕГ2, L491C: TTGTATTCAAGGAGATGCCCAAAAGGTGTAAAAC (SEQ ID NO:6) ПЕГ3, K496С: TTACCAAAAGGTGTATGCCATTTGAAGGATTTTC (SEQ ID NO:7) ПЕГ4, L504C: AAGGATTTTCCAATTTGCCCAGGAGAAATATTC (SEQ ID NO:8) ПЕГ5, Q468C: GATTATATTTAAGAATTGCGCAAGCAGACCATAT (SEQ ID NO:9) ПЕГ6, K1808C: TAGAAAAAACTTTGTCTGCCCTAATGAAACAAAAC (SEQ ID NO: 10) ΠΕΓ7, N1810C: AACTTTGTCAAGCCTTGCGAAACCAAAACTTAC (SEQ ID NO:11) ΠΕΓ8, T1812C: GTCAAGCCTAATGAATGCAAAACTTACTTTTGGA (SEQ ID NO:12) ΠΕΓ9, K1813C: CAAGCCTAATGAAACCTGCACTTACTTT?TGGAAAG (SEQ ID NO:13) ПЕГ 10, Y1815C: CTAATGAAACCAAAACTTGCTTTTGGAAATGCAAC (SEQ ID NO:14) ПЕг11, D1795C: ATTTCTTATGAGGAATGCCAGAGGCAAGGAGCA (SEQ ID NO:15) ПЕГ12, Q1796C: TCTTATGAGGAAGATTGCAGGCAAGGAGCAGAA (SEQ ID NO:16) ПЕГ13, R1803C: CAAGGAGCAGAACCTTGCAAAAACTTTG?TCAAGCCT (SEQ ID NO:17) 27 ПЕГ14, K1804C: GGAGCAGAACCTAGATGCAACTTTGTCAAGCCT (SEQ ID NO:18) ПЕГ15, K377C: CGCTCAGTTGCCAAGTGTCATCCTAAAACTTGG (SEQ ID NO:19) ПЕГ16, H378C: TCAGTTGCCAAGAAGTGTCCTAAAACTTGGGTA (SEQ ID NO:20) ПЕГ17, K556C: CTCCTCATCTGCTACTGCGAATCTGTAGATCAA (SEQ ID NO:21) ПЕГ18, N41C: CAAAATCTTTTCCATTCTGCACCTCAGTCGTGTAC (SEQ ID NO:22) ПЕГ19, N239C: GTCAATGGTTATGTATGCAGGTCTCTGCCAGGT (SEQ ID NO:23) ΠΕΓ20, N2118C: CAGACTTATCGAGGATGTTCCACTGGAACCTTA (SEQ ID NO:24) ΠΕΓ21, Υ81C: ATCCAGGCTGAGGTTTGTGATACAGTGGTCATT (SEQ ID NO:25) ΠΕΓ22, F129C: GAAGATGATAAAGTCTGTCCTGGTGGAAGCCAT (SEQ ID NO:26) ΠΕΓ23, K422C: CAGCGGATTGGTAGGTGTTACAAAAAAGTCCGA (SEQ ID NO:27) ΠΕΓ24, K523C: GAAGATGGGCCAACTTGCTCAGATCCTCGGTGC (SEQ ID NO:28) ΠΕΓ25, K570C: CAGATAATGTCAGACTGCAGGAATGTCATCCTG (SEQ ID NO:29) ΠΕΓ26, N1864C: CACACTAACACACTGTGTCCTGCTCATGGGAGA (SEQ ID NO:30) 95225 28 ΠΕΓ27, T1911С, CAGATGGAAGATCCCTGCTTTAAAGAGAATTAT (SEQ ID NO:31) ΠΕΓ28, Q2091C: ACCCAGGGTGCCCGTTGCAAGTTCTCCAGCCTC (SEQ ID NO:32) ΠΕΓ29, Q2284C: AAAGTAAAGGTTTTTTGCGGAAATCAAGACTCC (SEQ ID NO:33) ΠΕΓ30, C630A: TTGCAGTTGTCAGTTGCTTTGCATGAGGTGGCA (SEQ ID NO:34) ΠΕΓ31, C1899A: AATATGGAAAGAAACGCTAGGGCTCCCTGCAAT( SEQ ID NO:35). Експресія мутеїну. Після введення у вектор, що надає стійкість до Гігроміцину В (Гігр В), ПЕГмутеїни були трансфековані в НKВ11-клітини (Патент США 6,136,599), змішані з Реагентом для Трансфекції 293 Фектин (Invitrogen Corp. кат. № 12347-019) за інструкціями виробника. Експресію FVIII у тридобовий посттрансфекційний період оцінювали за допомогою хромогенного аналізу Коатест (Chromogenix Corp. кат. № 821033, див. Приклад 12, хромогенний аналіз) (Таблиця 1). Потім трансфековані клітини приміщували при селективній дії 50 мкг/мл Гігр В у середовище зростання, доповнене 5% ембріональною бичачою сиросироваткою (FBS). Після появи стійких до Гігр В колоній їх збирали та скринували на експресію FVIII за допомогою хромогенного аналізу Коатест. Потім стабільні експресувальні FVIII клітини вносили в середовище, що містить домішку HSPG. Клітини вирощували та висівали в концентрації 1 X 106 клітин/мл у качалкові колби зі свіжим вищем. Культуральну рідину (TCF), зібрану по кінченні 3 діб, використовували для очищення FVIII BDD-мутеїнів. Активність FVIII з TCF аналізували за допомогою Коатесту (Таблиця 1). 29 95225 30 Таблиця 1 Рівень експресії ПЕГ-мутеїнів при транзієнтній і стабільній трансфекціях (N/A = аналіз не проводився). Очищення мутеїнів. Після збирання супернатанта клітинної культури, що містить секретований мутеїновий протеїн FVIII, супернатант фільтрували крізь 0,2-мікронний мембранний фільтр, щоб видалити всі клітини, що залишилися. Потім супернатант концентрували або за допомогою ультрафільтрації, або за допомогою аніонного обміну. Потім його направляли на імуноафінну колонку, де компоненти середовища культивування клітин і більшість домішкових протеїнів хазяйських клітин вилучались. Потім елюат з імуноафінної колонки буферували діафільтрацією у буферний склад, що містить сахарозу, та заморожували. Вихід і збір протеїну через колонку з моноклональними до FVIII антитілами оцінювали хромогенним аналізом. Зразки навантажених, різних елюйованих фракцій, що протікають через колонку, смуги та діафільтрованого елюату хроматографічного дослідження були проаналізовані на FVIH-активність (Таблиця 2). Таблиця 2 показує збір ПЕГ2-мутеїну з колонки з моноклональними антитілами. Антитіла являють собою антитіла C7F7. Відсоток збору в Таблиці 2 визначений за допомогою хромогенного аналізу. Кінцевий вихід становив 73%. На Фігурі 2 показаний графік UV-поглинання при 280 нм відносно часу для ПЕГ2-протеїну, очищеного через хроматографічну колонку з моноклональними антитілами до FVIII. Хроматографію здійснювали з використанням хроматографічної системи AKTA® Explorer 100 від Amersham Bioscience. У цій системі використовується багатохвильовий UV-Visible монітор 31 і пропускна комірка 2 мм. ПЕГ2-мутеїн елюйований з колонки в присутності вищої солі, і пік елю 95225 32 ювання вказується як поглинанням при 280 нм, так аналізом активності FVIII. Таблиця 2 Збір ПЕГ2-мутеїну з колонки з моноклональними антитілами до FVIII Пегілування. Нативний FVIII повної довжини або BDD не може бути ПЕГ-ілований цистеїнспецифічними ПЕГ без відновлення та денатурації при більш ніж 100-кратному надлишку ПЕГ: протеїнове співвідношення (дані не показані), підтверджує гіпотезу, засновану на моделі структури BDD, що всі нативні цистеїни утворюють дисульфіди або перебувають усередині FVIII. Цистеїнові FVIII-мутеїни, експресовані та очищені з використанням зазначених вище стандартних протоколів, не могли б бути ПЕГ-іловані цистеїнспецифічним ПЕГ-малеїмідним реагентом, можливо, тому, що введений FVIII-цистеїн кепований за допомогою реакції із сульфгідрильними групами, такими як цистеїн і -меркаптоетанол, присутніми в середовищі росту клітин. Це питання потенційно може бути вирішене елімінуванням цистеїнів і -меркаптоетанолу із середовища культивування, але це може призвести до зниження продукції FVIII, і не перешкоджало б сульфгідрилам, що вивільняються клітинами, блокувати введений FVIII-цистеїн. В іншому аспекті винаходу був розроблений тристадійний метод, що дає можливість сайтспецифічного ПЕГ-ілування FVIII (Фігура 3). На стадії 1 очищений цистеїновий FVIII-мутеїн у кількості близько 1 мкМ м'яко відновлювали відновлювачами, такими як приблизно 0,7 мМ Трис(2кабоксіетил)фосфіну (ТСЕР) або 0,07 мМ дитіотреїтолу (DTT) протягом 30 хвилин при 4°С, щоб відокремити "кеп". На стадії 2 відновлювач видаляли разом з "кепом" за допомогою методу гель хроматографії (SEC), такого як проходження зразка через обертову колонку (BioRad), щоб дати можливість дисульфідам FVIII реформуватися, залишаючи при цьому введений цистеїн вільним і відновленим. На стадії 3, через, принаймні, 30 хвилин після видалення відновлювана, вивільнений цистеїновий FVIII-мутеїн обробляли, принаймні, 10-кратним молярним надлишком ПЕГмалеїміду із розмірами в інтервалі від 5 до 64 кДа (Nektar Therapeutics і N.O.F. Corporation) протягом, принаймні, 1 години при 4°С. Цей метод дає профіль продукту, що добре погоджується з відтворюваними даними для множини реакцій, повторених різними дослідниками. Через те, що метод обертової колонки для видалення ТСЕР не є масштабним, була вибрана гель-фільтраційна хроматографія зі знесоленням. Однак після перевірки цього методу з використанням зразка, міченого ТСЕР, було показано, що ТСЕР елюювався у вимірюваній кількості в пори колонки та непрямо в сольову фракцію, як це очікувалося б від молекули з низькою молекулярною вагою. Вестерн-блот аналіз показав значний фон ПЕГ-ілування, імовірно, внаслідок неповного вилучення ТСЕР. В окремих проміжних експериментах було показано, що очищений С7Р7-матеріал міг би бути істотно очищений надалі від інших домішкових протеїнів використанням середовища аніонообмінної хроматографії, комбінованої із сольовим градієнтом. Потім було вирішено відновити C7F7-матеріал за допомогою ТСЕР, як описано вище, і потім обробити цей матеріал через аніонообмінну колонку. Внаслідок відмінності в заряді, FVIII-протеїн утримувався би, у той час як ТСЕР протікав би через колонку і не залишався. У той самий час протягом елюювання в сольовому градієнті FVIII-протеїн очищався б від більшості домішкових протеїнів, що залишилися. Це означає, що пізніше здійснюване ПЕГ-ілування було б теоретично більш гомогенним при більш чистому вихідному матеріалі. Однак після тестування за допомогою зразка, міченого ТСЕР, було показано, що виміряні рівні ТСЕР виявлялися елюйованими в градієнті з FVIII. Тому було вирішено після аніонообмінної хроматографії застосувати гель-фільтраційну хроматографію зі знесоленням, щоб ці дві стадії, послідовно використані, приводили до повного видалення ТСЕР і виключення неспецифічного ПЕГ-ілування. 33 Аналіз пегілування методом електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (SDS-PAGE) і вестерн-блотинга. ПЕГілований продукт може бути проаналізований за допомогою електрофорезу на відновлювальному 6% ТрисГліцин SDS-поліакриламидному гелі (Invitrogen). При продовженні електрофорезу гель може бути забарвлений Кумасі Блакитним (Coomassie Blue) для ідентифікації всіх протеїнів або піддаватись стандартному Вестерн-блот протоколу для ідентифікації малюнка ПЕГілування в різних областях FVIII. Забарвлення блота мишачим моноклональним антитілом R8B12 або C7F7, створеним до С-кінцевої області важкого ланцюга FVIII або N-кінцевої області легкого ланцюга FVIII, відповідно, має ідентифікувати ПЕГ-ілування відповідних ланцюгів. Забарвлення за допомогою 413-антитіла до області 484-509 FVIII повинно визначити, чи є ПЕГілування дійсно сайт-специфічним, чи ні, для мутеїнів, таких як ПЕГ1-4. Аналогічно, забарвлення за допомогою антитіла CLB-CAg А, що розпізнає область 1801-1823 FVIII, повинне визначити, чи є ПЕГ-ілування дійсно сайт-специфічним, чи ні, для мутеїнів, таких як ПЕГ6-10. Було показано, що ПЕГ-ілування ПЕГ2 (L491C) є вибірковим для важкого ланцюга відносно легкого ланцюга та особливо вибірковим для області 484-509 (Фігура 4), у той час як ПЕГ6 (K1808С), як було показано, є вибірковим для легкого ланцюга відносно важкого ланцюга (Фігура 5). Для дослідження, зображеного на Фігурі 4, ПЕГ2-мутеїн (доріжки 1 і 8) відновлювали за допомогою ТСЕР, після чого ТСЕР вилучали (доріжки 2 і 9) і обробляли за допомогою 5-, 12-, 22-, 33- або 43-кДа ПЕГ-малеїміду (доріжки 3-7 і 1014). НеПЕГ-ілований FVIII досліджувався у вигляді необробленої (H+L) і обробленої смуг важкого (Н) і легкого (L) ланцюгів. Всі три смуги виявляються на гелі, забарвленому Кумасі Блакитним (внизу праворуч), у той час як Western-забарвлення специфічними до ланцюга антитілами показало тільки ланцюг, що не прореагував, та відповідний ланцюг. При забарвленні R8B12 (вгорі ліворуч) смуга важкого ланцюга (Н) сильно зменшувалася в інтенсивності, коли ПЕГ2 обробляли ПЕГ-малеїмідом, і створювалася нова смуга, що виявлялася вищою, ніж батьківська Ηсмуга, пропорційно розміру ПЕГ. При забарвленні C7F7 (внизу ліворуч) смуги легкого ланцюга (L) (численні смуги внаслідок гетерогенного глікозилування) не змінювалися в інтенсивності. Необроблена H+L смуга в обох забарвленнях зсунута, оскільки Η-ланцюг є частиною необробленого FVIII. Забарвлення Кумасі також підтверджує набагато більше ПЕГ-ілування важкого ланцюга, тобто зменшення інтенсивності Η-смуги, ніж легкого ланцюга. Нарешті, ПЕГ-іловані смуги втрачають відносно більше в інтенсивності при забарвленні 413-антитілом (угорі праворуч), ніж при забарвленні за допомогою R8B12, залежно від розміру ПЕГ, ймовірно, внаслідок сайтспецифічного ПЕГ-ілування в 491, що блокує зв'язування 413-антитіла з 484-509. Кількості 95225 34 FVIII, нанесеного на доріжку, становлять близько 30 нг для двох лівих гелів, близько 1000 нг для верхнього правого гелю та близько 2000 нг для нижнього правого гелю. Відновлення, за яким йде видалення відновлювача, не змінює міграції FVIII (доріжка 1 порівняно з доріжкою 2 і доріжка 8 порівняно з доріжкою 9). Додавання 22 кДа-ПЕГ до ПЕГ2 блокує зв'язування 413-антитіла, що погоджується зі специфічним ПЕГ-ілуванням у положенні 491 (Фігура 4, верхній правий гель). Це також передбачає, що ПЕГ-ілований ПЕГ2 буде мати більш низьку імуногенність у людини, тому що 413антитіло, як було показано, має той самий епітоп, що й інгібіторні антитіла до А2 людини (Scandella et al., 1992, Thromb. Haemost. 67, pp. 665-71). Для дослідження, зображеного на Фігурі 5, ПЕГ6-мутеїн відновлювали за допомогою ТСЕР, після чого ТСЕР вилучали (доріжки 1 і 6) і обробляли за допомогою 5-, 12-, 22- або 33 кДа-ПЕГмалеїміду (доріжки 2-5 і 7-10). НеПЕГ-ілований FVIII досліджувався у вигляді необробленої (H+L) і оброблених смуг важкого (Н) і легкого (L) ланцюгів. З огляду на мутовані залишки ПЕГ6 (K1808) на легкому ланцюзі, ПЕГ-ілування було виявлено тільки на легкому ланцюзі, але не на важкому. Кількість FVIII, нанесеного на доріжку, становить близько 100 нг для лівого гелю та близько 30 нг для правого гелю. BDD, що випробовувався в якості контролю, не показав будь-якого значного ПЕГ-ілування після обробки більш ніж 100-кратним молярним надлишком ПЕГ-малеїміду, навіть після описаної вище процедури відновлення та видалення відновлювача (Фігура 6а). Цей самий метод був застосований до ПЕГ4 і ПЕГ5 (Фігура 6а). Якщо порівнювати з ПЕГ2, ці мутеїни не були ПЕГіловані настільки ефективно, але вони були вибірковими до важкого ланцюга, подібно ПЕГ2 (L491C). Ефективність ПЕГ-ілування ПЕГ6 (K1808С) є відносно низькою, імовірно тому, що він дуже близький до сайту N-зв'язаного глікозилування на N1810, що може блокувати ПЕГілування в положенні 1808. Тому, нами був сконструйований ПЕГ7 (N1810С), щоб видалити сайт нативного глікозилування в 1810. ПЕГ7 показує поліпшену ефективність ПЕГ-ілування порівняно з ПЕГ6, якщо порівнювати їх "голова до голови" (Фігура 6b). Аналогічно, ПЕГ 15 показує трохи кращу ефективність ПЕГ-ілування, ніж ПЕГ2. ПЕГ2+6, подвійний мутант BDD, може бути ПЕГілований як на важкому, так і на легкому ланцюзі, оскільки ПЕГ2 є цистеїновою мутацією важкого ланцюга, у той час як ПЕГ6 являє собою мутацію легкого ланцюга (Фігура 6с). Цей метод був застосований також до FVIII дикого типу повної довжини (Фігура 6d). ПЕГ-ілування було виявлено для найбільшого фрагмента важкого ланцюга, що включає А1, А2 і більшу частину В-домену. Малюнок ПЕГ-ілування дає підстави вбачати моноПЕГ-ілування і наявність лише одного ПЕГілованого цистеїну. Аналіз пегілування за допомогою розщеплення тромбіном і вестерн-блотинга. ПЕГілований продукт можна обробити тромбіном (40 35 МО/мкг FVIII) при 37°С протягом 30 хвилин. Використовуваний тромбін містить також АРС у якості домішки. Розщеплення тромбіном приводить до появи 50 кДа-А1- і 43 кДа-А2-домену з важкого ланцюга, у той час як розщеплення АРС приводить далі до розщеплення А2-домену на фрагменти 21 і 22 кДа (Фігура 7). Забарвлення за допомогою R8В12-антитіла, що розпізнає С-кінець важкого ланцюга, буде ідентифікувати лише інтактний А2-домен і 21 кДа-С-кінцевий фрагмент (FVIII 562-740). Таким чином, якби ПЕГ-ілування ПЕГ2 було специфічним для положення 491, 43 кДа-А2-домен повинен був би бути ПЕГ-ілованим, за винятком 21 кДа С-кінцевого фрагмента. Це було дійсно підтверджене Вестерн-блотингом для 22 кДа-ПЕГ-ілованого ПЕГ2, показаним на Фігурі 7. Таким чином, за допомогою елімінування, ПЕГ-ілування ПЕГ2 було локалізоване на Nкінцевому 22 кДа-фрагменті (FVIII 373-561) А2домену. Оскільки ПЕГ-малеїмід є повністю вибірковим до цистеїнів при рН 6,8 і єдині нативні FVIII-цистеїни в області 373-561 походять зі схованого дисульфіду між 528 і 554, досить імовірно, що ПЕГ2 ПЕГ-ілований на введеному цистеїні в положенні 491. Western-забарвлення обробленого тромбіном ПЕГ-ілованого ПЕГ2 за допомогою N-кінцевої частини антитіла до важкого ланцюга FVIII не показали ПЕГ-ілування А1-домену (дані не показані). Вибіркове ПЕГ-ілування ПЕГ2 з використанням методу тромбінового розщеплення було також підтверджене для ПЕГ 5, 12, 33 і 43 кДа (дані не показані). Розщеплення тромбіном ПЕГ-ілованого FVIII дикого типу повної довжини показує, що ПЕГ-ілований лише В-домен (Фігура 8). Аналіз пегілування за допомогою забарвлення йодом. Щоб підтвердити, що нові смуги, які з'явилися, виявленим забарвленням Кумасі Блакитним і Western, дійсно є смугами, що свідчать про ПЕГ-іловання, було застосоване забарвленням йодидом барію, що є специфічним для ПЕГ (Фігура 9). ПЕГ-ілований ПЕГ2 досліджувався на 6%-ому ТрисГліциновому гелі (Invitrogen) і забарвлювався R8В12-антитілом до важкого ланцюга або розчином йодиду барію (Lee et al., Pharm Dev Technol. 1999 4:269-275). ПЕГ-іловані смуги виявлялися між двома плямами, використовуючи маркер молекулярної ваги для їх вирівнювання, підтверджуючи, таким чином, ПЕГ-ілування важкого ланцюга FVIII. Аналіз пегілування за допомогою МАLDI-масспектроскопії. Для підтвердження ПЕГ-ілування А2-домену у важкому ланцюзі зразок rFVIII до та після ПЕГ-ілування аналізували за допомогою мас-спектрометрії з використанням лазерної десорбції/іонізації в присутності матрикса (MALDI). Зразки змішували та кристалізували на мішеневому MALDI-планшеті з матриксом із синапінової кислоти в 30% ацетонітрилі, 0,1% TFA. Потім їх аналізували в спектрометрі Voyager DE-PRO у позитивному, лінійному режимі. Результати, подані на Фігурі 10, показали, що легкий ланцюг ПЕГ2 має центр на 83 кДа, а важкий ланцюг (НС) - на 89 кДа. Отриманий для ПЕГ-ілованого зразка спектр показав зменшення НС-піка та утворення 95225 36 нового піка із центром на 111 кДа. Це підтверджує ПЕГ-ілування важкого ланцюга. Жодного ПЕГ-ілування легкого ланцюга (на 105 кДа) вище межі виявлення не спостерігалося. Потім зразки піддавали розщепленню тромбіном при 20 одиницях тромбіну/мг FVIII при 37°С протягом 30 хвилин, і визначали концентрацію FVIII амінокислотним аналізом (Commonwealth Biotechnologies, Inc). Важкий ланцюг був розщеплений на 48 кДа (А1) N-кінцеву фракцію та 43 кДа (А2) фракцію. Отриманий MALDI-спектр для ПЕГілованого зразка (Фігура 11) показує втрату піка 43 кДа та появу нового піка 65 кДа, внаслідок ПЕГ-ілованого А2-домену. ПЕГ-ілування легкого ланцюга вище межі виявлення знову не спостерігалося. Ці результати знову підтверджують ПЕГілування А2-домену FVIII. Такий самий аналіз був застосований для ПЕГ-ілованого ПЕГ6 і підтвердив ПЕГ-ілування A3С1С2-фрагмента легкого ланцюга (Фігура 12). Вимірювання активності Коагуляційний аналіз. Тест-метод згортання FVIII: C являє собою одностадійний аналіз, заснований на активованому парціальному тромбопластиновому часі (аРТТ). У присутності Фактора ІХа, кальцію та фосфоліпіду FVIII діє як кофактор у ферментативному перетворенні Фактора X на Ха. У цьому аналізі розведені тестовані зразки інкубують при 37°С із сумішшю субстрату з FVIII-дефіцитної плазми та аРТТ-реагенту. До інкубованої суміші додають хлорид кальцію, і починається коагуляція. Між часом (у секундах), що потрібний для утворення згустку, і логарифмом концентрації FVIII:C існує зворотне співвідношення. Рівні активності для невідомих зразків інтерполюють, порівнюючи час згортання різних розведень тестованого матеріалу із кривою, побудованою з серій розведень стандартного матеріалу з відомою активністю, і виражають у Міжнародних Одиницях на мл (МО/мл). Хромогенний аналіз. Метод хромогенного аналізу складається із двох послідовних стадій, де інтенсивність кольору пропорційна активності FVIII. На першій стадії Фактор X активують до FXa FIXaoM за допомогою його кофактора, FVIIIa у присутності оптимальних кількостей іонів кальцію та фосфоліпідів. Надлишкові кількості Фактора X є такими, що швидкість активування Фактора X залежить лише від кількості FVIII. На другій стадії Фактор Ха гідролізує хромогенний субстрат, даючи хромофор, і інтенсивність кольору зчитується фотометрично при 405 нм. Розраховують значення невідомого, і вірогідність аналізу перевіряється за допомогою статистичного методу тангенса кута нахилу кривої. Активність виражають у Міжнародних Одиницях на мл (МО/мл). Петля 1811-1818 залучена у зв'язування з FIX, однак важливість індивідуальних положень усередині цієї петлі не була визначена. Мутеїни ПЕГ7-10 виявляють майже ідентичну специфічну хромогенну активність відносно нативного FVIII (Таблиця 3). Таблиця 3 показує у відсотках специфічну активність (С.А.) ПЕГ-мутеїнів і ПЕГілованого ПЕГ2 або ПЕГ6 відносно BDD. С.А. визначали діленням хромогенної, коагуляційної 37 активності або активності vWF-зв'язування на сумарне антигенне значення ELISA (ТАЕ). Потім С.А. ПЕГ-ілованих мутеїнів ділили на С.А. BDD (8 МО/мкг хромогенної, 5 МО/мкг коагуляційної і 1 95225 38 vWF/TAE) і множили на 100, щоб одержати відсоток С.А.., наведений у Таблиці З під заголовками "хромогенна", "коагуляційна" і "vWF/TAE". Таблиця 3 Відсоток специфічної активності (С.А.) ПЕГ-мутеїнів і ПЕГ-ілованих ПЕГ2 і ПЕГ6 відносно BDD Як показано в Таблиці 3, "ПЕГ2 червоний" це ПЕГ2-мутеїн, що був оброблений відновлювачем з подальшим видаленням останнього. Ця процедура відновлення незначно змінює три функціональні активності FVIII. ПЕГ2-мутеїн, кон'югований з ПЕГ, що мають розмір в інтервалі від 5 кДа (ПЕГ2-5кДа) до 43 кДа (ПЕГ2-43кДа), не втрачає значної кількості хромогенної активності, але має набагато більш низьку коагуляційну активність, коли розмір ПЕГ збільшується за межі 5 кДа. Можливе також помірне зменшення vWFзв'язування для ПЕГ-ілованого ПЕГ2 більшого розміру. Сумарний антигенний ELISA (ТАЕ). FVIII переносять на мікротитрувальний планшет, що покритий поліклональним антитілом до FVIII. Зв'язування FVIII виявляється за допомогою біотинілованого поліклонального антитіла до rFVIII і кон'югата стрептавідин-пероксидаза хрону (КСП). Пероксидаз-стрептавідиновий комплекс 39 дає колірну реакцію після додавання тетраметилбензидинового (ТМВ) субстрату. Концентрації зразків інтерполюють зі стандартної кривої, використовуючи моделі з чотирма підхожими параметрами. Результати FVIII виражають у мкг/мл. ELISA vWF-зв'язування. FVIII давали зв'язуватися з vWF із сильно гемофільною плазмою в розчині. Потім комплекс FVIII-vWF переносили на мікротитрувальний планшет, покритий vWFспецифічним моноклональним антитілом. Зв'язування FVIII з vWF виявляється за допомогою біо 95225 40 тинілованого поліклонального антитіла до rFVIII і кон'югата стрептавідин-пероксидаза хрону (КСП). Пероксидаз-стрептавідиновий комплекс дає колірну реакцію після додавання субстрату. Концентрації зразків інтерполюють зі стандартної кривої, використовуючи моделі з чотирма підхожими параметрами. Результати FVIII-зв'язування виражають у мкг/мл. Не було виявлено будь-якого істотного впливу на кожну з активностей після ПЕГ-ілування, що погоджувалось би з ПЕГілуванням у В-домені. Таблиця 4 Специфічна активність (С.А.) FVIII дикого типу повної довжини (KG-2) до та після ПЕГ-ілування за допомогою ПЕГ різного розміру Очищення ПЕГ-ілованого FVIII іонообмінною хроматографією. ПЕГ-ілований FVIII пропускають через аніон-обмінну або катіон-обмінну колонку, де протеїн зв'язується з колонкою, у той час як надлишок вільного ПЕГ-реагента не зв'язується та вилучається, проходячи через колонку. Потім ПЕГ-мутеїн елюють з колонки за допомогою градієнта хлориду натрію. Для підтвердження того, що елюйовані з колонки фракції містять ПЕГілований мутеїн, використовували забарвлений йодидом барію 4-12% Біс-Трис-гель завантажених фракцій, що проходять через колонку і оброблені у градієнті. Очищення ПЕГ-ілованого FVIII гель хроматографією. Аніон-обмінні фракції, що містять більшу частину ПЕГ2-мутеїну об'єднують і концентрують за допомогою ультрафільтрації, яку потім уводять у колонку, що використовується в гель хроматографії. Потім колонку елююють, використовуючи буферний склад. Внаслідок відмінності в розмірі та формі протеїну, залежно від того, чи зв'язаний ПЕГ із протеїном, ця колонка відокремлює ПЕГ-ілований ПЕГ2-мутеїн від кожного з інших ПЕГ2, які не є ПЕГ-ілованими. Фракції ПЕГілованого FVIII-мутеїну об'єднують на підставі наявності значної активності FVIII, потім заморожують для наступних досліджень на тваринах і молекулярного дослідження. На Фігурі 13 порівнюється елюювання неПЕГ-ілованого ПЕГ2мутеїну з елююванням 43 кДа-ПЕГ-ілованого ПЕГ2-мутеїну. ПЕГ-ілований ПЕГ2 елюює значно раніше, що вказує на збільшення його розміру та форми від ковалентно приєднаного ПЕГ. Що стосується таких мутеїнів як ПЕГ6, які показують більш низьку ефективність ПЕГ-ілування, тобто менше 50%, то найефективнішою схемою очищення, що дає високо чистий моноПЕГ ілований продукт, є використання комбінації катіон-обмінної хроматографії з подальшою гельхроматографією. Наприклад, що стосується ПЕГ6, катіон-обмінна хроматографія очищає ПЕГ-ілований ПЕГ6 (раніше елюююча фракція, Фіг. 14) від більшої частини неПЕГ-ілованого ПЕГ6 (пізніше елюююча фракція, Фіг. 15). Після цього за допомогою гель-хроматографії ПЕГілований протеїн (раніше елюююча фракція, Фіг. 15) остаточно очищається від залишку неПЕГілованого протеїну (пізніше елюююча фракція, Фіг. 15). Вплив розміру ПЕГ на активність. Щоб перевірити, чи впливають розміри ПЕГ на коагуляційну та хромогенну активності FVIII після ПЕГілування, очищений FVIII повної довжини, ПЕГ2, ПЕГ6 і ПЕГ14 відновлювали за допомогою ТСЕР з подальшим видаленням відновлювача та реакцією з буферним контролем або ПЕГ, що мають розмір в інтервалі від 6 кДа до 64 кДа. Отриманий ПЕГ-ілований FVIII аналізували безпосередньо, без видалення надлишку ПЕГ або неПЕГілованого FVIII. Контрольні експерименти показали, що надлишок ПЕГ не впливає на активність FVIII. На Фіг. 16 показані результати цього дослідження. Очищений FVIII повної довжини наведений на Фіг. 16 як KG-2. Відсоток активності, показаний на Фіг. 16, визначали діленням величини зразка, обробленого ПЕГ після відновлення та видалення відновлювача, на величину зразка, обробленого буферним контролем, беручи до уваги результат ПЕГ-ілування. Результат ПЕГілування порівнювали з усіма ПЕГ для будь-якого даного FVIII-конструкта. Він становить приблизно 80% для KG-2, ПЕГ2 і ПЕГ14 і близько 40% для ПЕГ6. Наприклад, оброблений буферним контро 41 лем ПЕГ14 має коагуляційную активність 6,8 МО/мл на відміну від 3,2 МО/мл для 12 кДа-ПЕГілованого зразка ПЕГ14. Однак ефективність ПЕГ-ілування становила близько 80%, і значення 3,2 МО/мл являє собою агрегатну активність приблизно 80% ПЕГ-ілованого та 20% неПЕГілованого. Вважаючи, що неПЕГ-ілований зразок має таку саме активність, що й оброблений буферним контролем ПЕГ14, відсоток активності неПЕГ-ілованого до ПЕГ-ілованому ПЕГ14 становить 34%=(3,2-6,8 рази 20%)/(6,8 рази 80%). ПЕГ-ілування усередині А2- або A3-домену в положенні ПЕГ2, ПЕГ6 і ПЕГ14 BDD веде до великої втрати коагуляційної активності, коли розмір ПЕГ збільшується за межі 6 кДа. Однак ПЕГілування усередині В-домену в цистеїні В-домену нативного FVIII повної довжини не впливає на коагуляційну активність. Цікаво, що хромогенна активність всіх ПЕГ-ілованих конструктів не змінюється. Це може бути зумовлене відмінностями в аналізах. Можливо, субстрат невеликого хромо 95225 42 генного пептиду має більш легкий доступ до ПЕГілованого комплексу FVIII/FIX/FX, ніж субстрат більшого протеїну, що використовується у коагуляційному аналізі. Альтернативно, ПЕГ може впливати на активацію мутеїну. Це було б легше виявити за допомогою одностадійного коагуляційного аналізу, ніж шляхом двостадійного хромогенного аналізу. Для підтвердження ПЕГ-ефектів, що спостерігаються, на коагуляційну активність ПЕГ2, 6 і 14, кілька ПЕГ-ілованих конструктів були очищені від надлишку ПЕГ і неПЕГ-ілованого матеріалу. Оскільки ПЕГ жодним чином не впливає на хромогенну активність, відношення хромогенної активності до коагуляційної добре оцінюється за відносним впливом ПЕГ на коагуляційну активність (Таблиця 5). Більші ПЕГ у даному положенні, такі як ПЕГ2 і більша кількість ПЕГів, як у цьому випадку з конструктом ПЕГ2+6, спричиняють більш високу втрату коагуляційної активності. Таблиця 5 Співвідношення хромогенної та коагуляційної активності для очищеного ПЕГілованого BDD * розгалужений ПЕГ. РК дослідження кролика. Щоб зрозуміти вплив ПЕГ-ілування на фармакокінетику (РК) FVIII, РК-дослідження проводили на ряді видів. Для дослідження використовували NZW SPFкроликів: 10 самиць, 5 кроликів у групі, 2 групи (ПЕГ2 FVIII і 22 кДа-ПЕГ-ілований ПЕГ2). Зразки розводили в стерильному PBS з кінцевою концентрацією 100 МО/мл (хромогенні одиниці). Кожному кролику вводили в крайню вушну вену дозу в 1 мл/кг (100 МО/кг) розведеної тестованої або контрольної речовини. У різний після введення час відбирали зразки крові (1 мл) в 1 мл-шприц (наповнений 100 мкл 3,8%-ного Na-цитрату) із центральної вушної артерії в задані періоди часу після введення дози. Зразки плазми інкубували R8В12-антитілом до важкого ланцюга, приміщеним на 96-ти лунковий планшет, для специфічного захоплення людського FVIII, що вводиться. Активність захопленого FVIII визначали хромогенним аналізом (Фігура 17). ПЕГ-ілований ПЕГ2 і ПЕГ-ілований ПЕГ6 порівнювались також з BDD (Фігури 18 і 19), при цьому кількість виділених ПЕГ-ілованих мутеїнів із плазмі стала більш високою порівняно з кількістю BDD. ПЕГ-ілований 43 FVIII дикого типу повної довжини явно не виявив такої властивості (Фігура 20). РК дослідження миші. Як другий вид у РК дослідженнях використовували ICR-нормальні або гемофільні, FVIII-дефіцитні миші (Тасопіс, Гудзон, Нью-Й.). Нормальні миші використовувалися для дослідження; по 5 мишей у групі за один період часу. Тестовані матеріали розводили в складному буфері до номінальної кінцевої концентрації 25 МО/мл. Кожній миші вводили 4 мл/кг (~0,1 мл від загального обсягу) розведеного тестованого матеріалу через хвостову вену. Зразки крові (0,45 або 0,3 мл для дослідження нормальної або ге 95225 44 мофільної миші, відповідно) відбирали в 1 млшприц (наповнений 50 або 30 мкл 3,8%-ного Naцитрату для дослідження нормальної або гемофільної миші, відповідно) з нижньої порожньої вени в заданий період часу (одна тварина на зразок). Зразки плазми аналізували на концентрацію FVIII, використовуючи описаний вище метод хромогенного аналізу. Більша кількість ПЕГілованого ПЕГ6 виділяється із плазми порівняно з BDD або ПЕГ6 (Фігура 21). Більша кількість ПЕГілований ПЕГ2 виділяється із плазми порівняно з BDD (Фігури 22 і 23). Таблиця 6 Підсумкові результати РК-дослідження ПЕГ-ілованого FVIII, що показують період напіввиведення із плазми в годинах *Початковий препарат 33 кДа-ПЕГ-ілованого ПЕГ6 з періодом напіввиведення 9,6 год. у кроликів був не таким чистим, як наступний препарат, що дав період напіввиведення 17,4 год. Таблиця 7 Збір ПЕГ-ілованих ПЕГ-мутеїнів із плазми у гемофільних мишей. Показане кількісне поліпшення збору з плазми при пост-ін'єкційному періоді 16 годин порівняно з BDD-контролем, проведеним за таких саме умов 45 Збір (BDD) фактора VIII гемофільної миші. Гістограмма збору (BDD) Фактора VIII гемофільної миші, показана на Фігурі 24, ілюструє фармакокінетичну (РК) оцінку періоду напіввиведення двох видів BDD-Фактора VIII в аналізі гемофільної миші. Цей аналіз був проведений для вимірювання концентрації в плазмі як BDD-Фактора VIII (позначений на Фігурі 24 як "wt" або BDD-Фактора VIII дикого типу), так і ПЕГ 2+6 подвійного ПЕГілованого варіанта BDD-Фактора VIII (і ідентифікованого тут як L491C, K1808 подвійний варіант BDD-Фактора VIII) у трьох часових точках після внутрішньовенного введення в мишачу модель. У той час як оцінки для часу 0,8 і 4 годин були порівнянними, 16-годинна оцінка заслуговує на особливу увагу. Що стосується 16-и годин, то через 16 годин після введення в мишачій плазмі залишалося приблизно в чотири рази (400%) більше варіанта подвійного ПЕГ-ілованого BDD Фактора VIII (ПЕГ 2+6) порівняно з неПЕГ-ілованою молекулою. Модель розриву нирки. Щоб визначити, чи є ПЕГ-іловані FVIII-мутеїни ефективними для припинення кровотечі у гемофільної миші, використовували модель розриву нирки. Гемофільну мишу (C57/BL6 з порушеним FVIII-геном) анестезували під ізофлуораном і зважували. Оголювали нижню порожню вену та вводили 100 мкл або фізіологічного розчину, або FVIII, використовуючи калібровану голку 31-го розміру. Голку акуратно видаляли та прикладали тиск до місця ін'єкції на 30-45 секунд, щоб запобігти кровотечі. Через дві хвилини, праву нирку оголювали та утримували між затисками вздовж вертикальної осі. Використовуючи скальпель №15, нирку надрізали горизонтально на глибину 3 мм. Для забезпечення рівномірності глибини пошкодження, нирку злегка притримували в середній частині, щоб оголилася однакова тканина на кожній стороні затиску. Оголену поверхню нирки розрізали до глибини затиску. Втрату крові підраховували як описано вище. Для визначення співвідношення дози та відповіді FVIII на ниркову кровотечу на мишах тестували різні дози FVIII. ПЕГ-ілований ПЕГ2 показує порівнянну з BDD активність зменшення втрати крові після пошкодження нирки миші (Фігура 25). Таким чином, хоча коагуляційна активність ПЕГілованого ПЕГ2 нижча, ніж у BDD, ця модель розриву нирки показує, що ефективність in vivo ПЕГілованого ПЕГ2 не була помітно знижена порівняно з BDD, що погоджується з даними хромогенного аналізу. Аналіз інгібування антитілами. Додавання полімеру з високою молекулярною вагою, такого як поліетиленгліколь (ПЕГ), специфічно в положення 491 (тобто ПЕГ2) повинно зменшувати зв'язування з і чутливість до mAB 413, значною мірою збільшуючи частку інгібіторних антитіл у пацієнтів, оскільки в багатьох пацієнтів виробляються інгібіторні антитіла до цього ж епітопу mAB 413. Щоб перевірити це, кількості mAB 413, що збільшуються, інкубували з кількостями, що не насичують (0,003 МО/мл), BDD або 43 кДа-ПЕГілованого ПЕГ2 і тестували на функціональну 95225 46 активність хромогенним аналізом (Фігура 26). В якості контролю використовували R8B12, неінгібіторне антитіло, і ESH4, інгібіторне антитіло, націлене на С2-домен. ПЕГ-ілований ПЕГ2 дійсно більш стійкий до інгібування mAB 413, ніж BDD, і показує подібний малюнок інгібування в присутності контрольних антитіл, які не зв'язуються поблизу положення 491. Крім того, захисний ефект ПЕГ проти інгібування mAB 413 залежить від розміру ПЕГ, при цьому чим крупніший ПЕГ, тим сильніший ефект (Фігура 27). Щоб перевірити, чи є ПЕГ-ілований FVIII більш стійким до інгібіторних антитіл у пацієнтів, хромогенну активність вимірювали в присутності ряду вибраних зразків плазми, що походить від пацієнтів з гемофілією А, у яких виробилися інгібітори до FVIII. В 8 протестованих зразках плазми пацієнтів, 43 кДа-ПЕГілований ПЕГ2 був більш стійким до інгібування плазми пацієнтів, ніж BDD в 4 зразках плазми пацієнтів. Наприклад, ПЕГ-ілований ПЕГ2, ПЕГ6 або ПЕГ2+6 показали більш високу залишкову активність, ніж BDD у плазмі одного пацієнта порівняно з іншою плазмою (Фігура 28). ДиПЕГілований ПЕГ2+6, очевидно, є більш стійким, ніж моноПЕГ-ілований ПЕГ2 або ПЕГ6. Ці результати дають підстави вважати, що ПЕГ-іловані ПЕГмутеїни можуть бути більш ефективними при лікуванні пацієнтів, у яких виробляються інгібітори до FVIII. Високопродуктивний скринінг пегілування. Ефективність ПЕГ-ілування конкретного ПЕГмутеїну непередбачувана, особливо через те, що немає прямої структурної інформації про BDD. Наприклад, грунтуючись на структурній моделі BDD, можна передбачити, що ефективність ПЕГілування ПЕГ4 або ПЕГ5 повинна бути дуже високою, подібно до активності ПЕГ2 і ПЕГ 15, оскільки всі три положення перебувають на поверхні та звернені назовні згідно зі структурою. Таким чином, щоб використати ПЕГ для пошуку нового механізму виведення через систематичне ПЕГілування потрібно буде скринувати велику кількість мутеїнів. Щоб швидко скринувати велику кількість ПЕГмутеїнів, був розроблений новий високопродуктивний метод, за допомогою якого можна перевірити ефективність ПЕГ-ілування та функціональну активність ПЕГ-ілованих продуктів від транзієнтно трансфекованих мутеїнів. Тільки 5-10 мл транзієнтно експресованих ПЕГ-мутеїнів з таким малим хромогенним значенням FVIII, як 0,1-0,2 МО/мл концентрують приблизно в 50 разів, використовуючи пристрій MWCO 30K Amiconcentra Ultra, так що концентрація FVIII сягає понад 1 нМ, майже наближаючись до величини спорідненості антитіла для взаємодії з FVIII. Концентрований ПЕГ-мутеїн (~300 мкл) інкубують з ~30 мкл полімеру C7F7-антитіла до FVIII протягом ночі при 4°С, промивають, елююють, піддають діалізу та відновлюють. Відновлювач видаляють і відновлені ПЕГ-мутеїни ПЕГ-ілюють і досліджують за допомогою Western-аналізу, як описано вище (Фігури 29 і 30). Відносна ефективність ПЕГ-ілування транзієнтно експресованих 47 95225 ПЕГ-мутеїнів точно відповідає такій очищених ПЕГ-мутеїнів. У такий спосіб можна скринувати багато ПЕГмутеїнів за один-два місяці. Наприклад, ПЕГ14 (K1804С BDD) мав, принаймні, близько 80% ПЕГілування в легкому ланцюзі 12 кДа-ПЕГом і не мав ПЕГ-ілування у важкому ланцюзі (дані не показані), що погоджується з K1804С-мутацією, розташованою на легкому ланцюзі. На основі структури BDD С-C відстань між K1804 і K1808 (ПЕГ6-положення) становить тільки 8,4 ангстреми, і можна припустити, що введення 43 кДа-ПЕГ у це положення приведе до поліпшення РК, подібного до 33 кДа-ПЕГ-ілованого ПЕГ6 з набагато кращим результатом ПЕГ-ілування. Відносний результат ПЕГ-ілування для всіх протестованих ПЕГ-мутеїнів підсумований у Таблиці 8. ПЕГілування було високо вибірковим для того конкретного ланцюга FVIII, де була введена цистеїно 48 ва мутація й у якій кожний мутеїн із цистеїном у важкому ланцюзі стає ПЕГ-ілованим тільки на важкому ланцюзі, у той час як кожний мутеїн із цистеїном у легкому ланцюзі стає ПЕГ-ілованим тільки на легкому ланцюзі. Номера мутеїнів 2-31 представляють цистеїнові мутації заміщення нативної амінокислоти в BDD у положенні, позначеному цистеїном. ПЕГ2+6 є подвійним мутеїном BDD, де положення 491 і 1808 були заміщені цистеїнами. А1 і А2 (і В-домен для KG-2, FVIII повної довжини) належать до важкого ланцюга, у той час як A3, С1 і С2 належать до легкого ланцюга. Ефективність ПЕГ-ілування оцінювали шляхом дослідження ПЕГ-ілованих продуктів на SDS PAGE, порівнюючи інтенсивності ПЕГ-ілованої смуги з неПЕГ-ілованою смугою: +++ ~>80% результат ПЕГ-ілування, ++ ~30-70% результат, + ~10-30% результат і - ~