Модифікований фактор viii свині та його використання у терапевтичних цілях

1. ДНК, що кодує амінокислотну послідовність модифікованого фактора VIII свині (POL1212), яку представлено у SEQ ID NO:38. 2. Вектор експресії, що містить ДНК за п. 1. 3. ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:37. 4. Вектор експресії, що містить ДНК за п. 3. 5. Модифікований фактор VIII свині, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:38. C2 2 75064 1 3 75064 4 вотечі, що може викликати ряд серйозних симптопотребують поновлення фактору VIII кожної доби. мів, від запальних реакцій у суглобах до ранньої Однак, поновлення виявилося недостатнім, а прозагибелі. Суворі гемофілії, число яких складає блеми терапевтичного використання мають місце приблизно 10000 у Сполучених штатах, можна внаслідок труднощів виділення та очистки, імунолікувати вливанням фактору VIII людині, що відногенності та необхідності позбавлення від ризику влюватиме здатність до нормального згортання інфекції СНІДу та гепатиту. Використання рекомбікрові при уведенні з достатньою частотою та у нантного фактору VIII людини або частково очидостатній концентрації. Класичне визначення факщеного фактору VIII свині не розв'яже усіх цих тору VIII фактично полягає в тому, що присутня у проблем. нормальній плазмі крові речовина, що нейтралізує Проблеми, пов'язані зі звичайно використовунестачу згортання у плазмі, походить від осіб з ваним, комерційно доступним похідним з плазми гемофілією А. фактором VIII стимулювали значний інтерес стоУтворення антитіл ("інгібіторів" або "інгібувасовно розробки кращого продукту фактору VIII. льних антитіл"), що інгібують активність фактору Існує необхідність у потужнішій молекулі фактору VIII є серйозним ускладненням у допомозі пацієнVIII, щоб на кожну молекулу можна було забезпетам з гемофілією. Автоантитіла розвиваються у чити більше елементів активності згортання; моприблизно 20% пацієнтів з гемофілією А у відполекулі фактору VIII, що є стабільною при вибраних відь на терапевтичні вливання фактору VIII. У нерН та фізіологічній концентрації; молекулі фактору лікованих перед тим пацієнтів з гемофілією А, у VIII, що є менш здатна для виклику продукування кого розвиваються інгібітори, інгібітор звичайно інгібувальних антитіл; та молекулі фактору VIII, що розвивається в межах одного року лікування. Крім уникає імунного впізнавання у пацієнтів, які вже того, автоантитіла, які інактивують фактор VIII, мають набуті антитіла до фактору VIII людини. іноді розвиваються у осіб з нормальними перед В основу винаходу поставлена задача розротим рівнями фактору VlII. Якщо титр інгібітору є бити фактор VIII, що коректує гемофілію у пацієнту достатньо низьким, пацієнтам можна надавати з нестачею фактору VIII або з наявністю інгібіторів допомогу збільшенням дози фактору VIII. Однак, стосовно фактору VIII людини. часто титр інгібітору є таким високим, що його не Ще одна задача - розробити способи лікуванможна придушити фактором VIII. Альтернативна ня гемофілії. стратегія полягає в обході необхідності фактору Ще одна задача - розробити фактор VIII, що є VIII при нормальному гемостазі, використовуючи стабільним при вибраних рН та фізіологічній конкомплексні препарати фактору IX (наприклад, KOцентрації. NYNE*, Proplex*) або рекомбінантний фактор Vllla Ще одна задача - розробити фактор VIII, що людини. Крім того, оскільки фактор VIII свині звимає більшу активність стосовно коагуляції, ніж чайно має суттєво меншу реактивність стосовно фактор VIII людини. інгібіторів, ніж фактор VIII людини, використано Ще одна задача - розробити фактор VIII, проти частково очищений препарат фактору VIII свині якого продукується менше антитіл. (HYATE:C*). Багатьох пацієнтів, які мають розвиКрім, того задачею винаходу є розробити спонені інгібувальні антитіла стосовно фактору VIII сіб створення рекомбінантного фактору VIII свині, людини, успішно вилікували фактором VIII свині, і а особливо, модифікованого фактору VIII свині. вони залишилися толерантними стосовно такого Визначення повної послідовності ДНК, що колікування протягом довгого періоду часу. Однак, дує фактор VIII свині, наведене тут, дало змогу, застосування фактору VIII свині не є повним виріпо-перше, синтезувати фактор VIII свині повної шенням проблеми, оскільки щодо фактору VIII довжини експресією ДНК, що кодує фактор VIII свині після одного чи більше вливань у деяких свині у придатній клітині хазяїна. Згідно з ще одпацієнтів можуть розвиватися інгібітори. ним аспектом представленого винаходу запропоКілька препаратів похідного з плазми людини новано очищений рекомбінантний фактор VIII свифактору VIII різного ступеню чистоти є комерційно ні. ДНК, що кодує кожний домен фактору VIII свині, доступними для лікування гемофілії А. Вони вклюа також будь-який її певний фрагмент, можна ексчають частково очищений фактор VIII, похідний з пресувати подібно. Більш того, fVIII (фактор VIII) поєднаної крові багатьох донорів, що оброблено свині, в якому видалений увесь домен В (fVIII свині теплом та детергентами проти вірусів, але містять без домену В) чи його частина, зроблений доступзначний рівень антигенних білків; очищений мононим як частина представленого винаходу, експреклональними антитілами фактор VIII, що має нижчі сією ДНК, що кодує fVIII свині, в якому видалено рівні антигенних забруднень та зараження вірусаодин чи більше кодонів домену В. ми; та рекомбінантний фактор VIII людини, клінічні Також запропоновано фармацевтичні комподослідження якого проводять. На жаль, фактор VIII зиції та способи лікування пацієнтів з нестачею людини є нестабільним при фізіологічних концентфактору VIII, що включають застосування рекомраціях та рН і присутній у крові у надзвичайно нибінантного фактору VIII свині або модифікованого зький концентрації (0,2мкг/мл плазми) та має низьрекомбінантного фактору VIII свині, зокрема, факку специфічну активність щодо згортання. Вимоги тору VIII свині без домену В. здоров'я людей стосовно ризику вірусних або інФіг.1А-1Н разом представляють порівняння ших присутніх у крові забруднень обмежують присуміщених послідовностей кислот факторів VIII датність фактору VIII свині, очищеного від крові людини, свині та миші. свині. Визначення вжитих термінів. Гемофіліки для попередження кровотечі та Якщо не визначено чи показано інше, "фактор утвореної деформуючої гемофільної арторопатії VIII" позначає будь-яку функціональну молекулу 5 75064 6 білку фактору VIII від будь-якого ссавця. тид на 5' закінченні ДНК, що кодує фактор VIII свиЯкщо не визначено інше "фактор VIII ссавця" ні (5' закінчення за домовленістю означає закінвключає фактор VIII з амінокислотною послідовнічення, що кодує NH2-закінчення білку), експресостю, похідною від будь-якого ссавця окрім людини. ваний білок починає переходити зсередини "Тварина" стосується свині та інших ссавців окрім клітини хазяїна у культиваційне середовище. Залюдини. безпечення кодуючої сигнальний пептид ДНК у "Конденсований білок" або "конденсований комбінації з фактором VIII свині надає кодуючій фактор VIII або його фрагмент" - це продукт гібриДНК перевагу, оскільки експресований фактор VIII дного гена, в якому кодуюча послідовність для переходить у культиваційне середовище, що одного білку є зміненою, наприклад, об'єднанням її спрощує процес очистки. Кращим сигнальним пепчастини з кодуючою послідовністю для другого тидом є сигнальний пептид фактору VIII ссавця. білку з відмінного гена у належному регістрі рамки Нуклеотидні та передбачувані амінокислотні зчитування так, щоб могли відбуватися нерозірвані послідовності кДНК фактору VIII людини показані у транскрипція та трансляція об'єднаних сегментів SEQ ID NO: 1 та 2, відповідно. Фактор VIII синтезудля утворення гібридного гена, що кодує конденється як білок розміром приблизно 300кДа з одисований білок. ничним ланцюгом з внутрішньосистемною гомоло"Відповідна" нуклеїнова кислота або амінокисгією послідовності, що позначає послідовність лота або послідовність будь-якої з них - це те, що "домену" NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. У молекупредставлено на сайті у молекулі фактору VIII або лі фактору VIII, "домен" - це безперервна послідоїї фрагменті, що має таку ж структуру та/або функвність амінокислот, що визначається ідентичністю цію, як сайт у молекулі фактору VHI іншого виду, внутрішньої амінокислотної послідовності та сайхоча число нуклеїнових кислот або амінокислот тами протеолітичного розщеплення тромбіном. може не бути ідентичним. Послідовність ДНК "що Якщо не визначено інше, домени фактору VIII відповідає" іншій послідовності фактору VIII, по включають наступні амінокислотні залишки, коли суті стосується такої послідовності, та гібридизупослідовності суміщають з амінокислотною посліється з послідовністю призначеної SEQ lD NO в довністю людини (SEQ ID NO:2): ΑΙ, залишки Alalжорстких умовах. Послідовність ДНК "що відповіArg372; A2, залишки Ser373-Arg740; В, залишки дає" послідовності іншого фактору VIII, також Ser741-Arg1648; A3, залишки Ser1690-Ile2032; СІ, включає послідовність, що призводить до експресії залишки Arg2033-Asn2172; C2, залишки Ser2173фактору VIII або його фрагменту і яку можна було Tyr2332. Послідовність А3-С1-С2 включає залишки б гібридизувати з призначеною SEQ lD NO, але Ser1690-Tyr2332. Залишковий сегмент, залишки для надлишковості генетичного коду. Glul649-Arg1689, звичайно позначають як невели"Неповторювані" амінокислотний залишок або кий ланцюг активаційного пептиду фактору VIII. послідовність стосується амінокислотної послідовФактор VIII протеолітично активується тромбіном ності або залишку у молекулі фактору VIII одного або фактором Ха, який відщеплює його від фактовиду, що відрізняються від гомологічного залишку ру вон Віллебранда, утворюючи фактор Vllla, який або послідовності у молекулі фактору VIII іншого має прокоагуляційну функцію. Біологічна функція виду. фактору Vllla полягає у збільшенні каталітичної "Специфічна активність" стосується активносефективності фактору ІХа стосовно інтенсивності ті, що коректуватиме дефект стосовно коагуляції активації фактору X на кілька порядків. Активоваплазми людини з нестачею фактору VIII. Специфіний тромбіном фактор Vllla є гетеротримером розчну активність вимірюють у одиницях активності міром 160кДа А1/А2/А3-С1-С2, що утворює комстосовно згортання на міліграм загального білку плекс з фактором ІХа та фактором X на поверхні фактору VIII у стандартному дослідженні, в якому тромбоцитів або моноцитів. "Частковий домен" час згортання плазми людини з нестачею фактору це безперервна послідовність амінокислот, що VIII порівнюють з часом для плазми нормальної утворює частину домену. людини. Одна одиниця активності фактору VIII є "Субелементи" фактору VIII людини або тваактивністю, представленою у одному мілілітрі пларини - великі та невеликі ланцюги білку. Великий зми нормальної людини. У дослідженні скорочення ланцюг фактору VIII містить три домени, А1, А2, та часу утворення тромбу вказує на більшу активВ. Невеликий ланцюг фактору VIII також містить ність аналізованого фактору VIII. Фактор VIII свині три домени, A3, СІ, та С2. має активність стосовно коагуляції у дослідженні Терміни "епітоп," "антигенний сайт" та "антифактору VIII людини. генний детермінант" використовуються як синоні"Експресія" стосується суми процесів, що відми та означають, яка частина фактору VIII людини буваються при використанні генетичної інформації або тварини або його фрагменту специфічно роздля утворення продукту. ДНК, яка кодує амінокиспізнається антитілом. Він може складатися з будьлотну послідовність фактору VIII свині., може "ексякого числа амінокислотних залишків та може бути пресуватися" у клітині ссавця-хазяїна для утвозалежним від первинної, вторинної, або третинної рення білку фактору Vin свині. Матеріали, структури білку. генетичні структури, клітини хазяїна та умови, що Термін "імуногенний сайт" означає регіон факдозволяють відбуватися експресії даної послідовтору VIII людини або тварини чи його фрагменту, ності ДНК, добре відомі в рівні техніки, і ними можщо специфічно викликає продукування антитіла до на маніпулювати для впливу на час та інтенсивфактору VIII, або фрагменту у людини або твариність експресії, а також внутрішньо- або зовнішньони, як виміряно такими звичайними способами, як клітинну локалізацію експресованого білку. Наприімунодослідження, наприклад, ELISA (ферментний клад, включенням ДНК, що кодує сигнальний пепіімуносорбентний аналіз), або описаний тут аналіз 7 75064 8 Бетезда. Він може складатися з будь-якого числа надано тут як довідку. амінокислотних залишків та може бути залежним "Вектор експресії" є елементом ДНК, часто цивід первинної, вторинної, або третинної структури клічної структури, що здатний до автономної репбілку. У деяких втіленнях гібридний фактор VIII лікації у потрібній клітині хазяїна або до інтеграції або гібридні еквіваленти фактору VIII або його у геном клітини-хазяїна, а також володіючий дефрагменту є неімуногенними або менш імуногенякими добре відомими особливостями, які дозвоними у тварин або людини, ніж фактор VIII людини ляють експресію кодуючої ДНК, вставленої у векабо свині. тор послідовності у належному сайті та у належній "Нестача фактору VIII" означає нестачу активорієнтації. Такі особливості можуть включати, але ності стосовно згортання, викликану продукуванбез обмеження, одну чи більше послідовностей ням дефективного фактору VIII, неадекватним промотеру для керування ініціюванням транскриппродукуванням фактору VIII чи відсутністю продуції кодуючої ДНК та таких інших елементів ДНК, як кування, або частковим чи повним інгібуванням енхансери, сайти поліаденілування тощо, які усі фактору VIII інгібіторами. Гемофілія А є типом недобре відомі в рівні техніки. Термін "вектор ексстачі фактору VIII в результаті дефекту у Хпресії" використовують як для позначення вектору, зв'язаному гені та відсутності або нестачі білку що має кодуючу послідовність ДНК, що має бути фактору VIII, що він кодує. ексресована, вставлену в його послідовність, так і "Діагностичні дослідження" включають дослівектор, що має потрібні елементи керування ексдження, що деяким чином використовують взаєпресією, щоб розташувати з огляду на сайт вставмодію антиген-антитіло для визначення та/або ки, які можуть слугувати для експресії будь-якої вимірювання кількості певного антитіла, що предкодуючої ДНК, вставленої у сайт, які усі добре віставляє тест-зразок, для допомоги у виборі лікудомі в рівні техніки. Отже, наприклад, вектор, що вальної терапії. Багато таких досліджень відомо втратив промотер, може стати вектором експресії фахівцям. ДНК фактору VIII людини, свині або шляхом вставки промотеру у комбінації з кодуюмодифікованого фактору VIII свині або їх фрагмечою ДНК. нту та білок, експресований з неї, повні або неповЗагальний опис способів ні, може замінювати відповідні реагенти у інших Патент США №5364771 описує відкриття гібвідомих дослідженнях, отже, можна використовуридної молекули фактору VIII людини/свині, що вати модифіковані дослідження для визначення має активність стосовно коагуляції, в цій молекулі та/або вимірювання антитіл до фактору VIII. Викоелементи молекули фактору VIII людини або свині ристання цих реагентів, ДНК фактору VIII або його заміщують відповідні елементи молекули фактору фрагменту чи білку, експресованого з неї, дозвоVIII іншого виду. Патент США №5663060 описує ляє модифікацію відомих досліджень для визнапрокоагуляційні гібридні молекули людини/тварини чення антитіла до фактору VIII людини або тварита гібридні еквівалентні фактору VIII молекули, в ни. Такі дослідження включають, але без яких елементи молекули фактору VIII одного виду обмеження, ELISA, дослідження імунодифузії та заміщують відповідні елементи молекули фактору імуноблотування. Придатні способи здійснення на VIII іншого виду. практиці будь-яких з цих досліджень відомі фахівОскільки сучасна інформація свідчить, що доцям. Фактор VIII або його фрагмент, що включає мен В не має інгібувального епітопу та має невіщонайменше один епітоп білку, можна використодомий вплив на функцію фактору VIII, у деяких вувати як діагностичний реагент. Приклади інших втіленнях домен В є повністю або частково видадосліджень, в яких можна використовувати фактор леним у активній гібридній молекулі або гібридній VIII людини, свині або модифікований фактор VIII еквівалентній фактору VIII молекулі або її фрагмесвині або їх фрагмент, включають дослідження нті ("В(-) фактор VIII") виготовлених будь-яким зі Бетезда та антикоагуляційні дослідження. способів, описаних тут. Термін "ДНК, що кодує такий білок, як фактор Ген фактору VIII людини виділяли та експреVIII свині" означає полідезоксинуклеїнову кислоту, сували у клітинах ссавця, як описано Toole, J.J. et чия нуклеотидна послідовність заключає в собі al. (1984) Nature 112: 342-347 (Genentics Institute); кодуючу інформацію для клітини-хазяїна стосовно Gitschier, J. et al.(1984) Nature 312: 326-330 (Geамінокислотної послідовності білку, наприклад nentech); Wood, W.I. et al. (1984) Nature 312: 330фактору VIII свині, згідно з відомими залежностя337 (Genentech); Vehar, G.A. et al. (1984) Nature ми генетичного коду. 312: 337-342 (Genentech); WO 87/04187; WO "Продукт експресії" ДНК, що кодує фактор VIII 88/08035; WO 88/03558; Патент США №4757006, а людини або тварини або модифікований фактор амінокислотну послідовність встановлено за кДНК. VIII є продуктом, отриманим експресією згаданої Патент США №4965199, що належить Capon et al., ДНК у придатній клітині хазяїна, включаючи настурозкриває спосіб виготовлення фактору VIII з репні особливості до- або після-трансляційної модикомбінантною ДНК у клітинах ссавця-хазяїна та фікації білку, кодованого згаданою ДНК, що вклюочистку фактору VIII людини. Показано експресію чають, але без обмеження, глікозилування, фактору VIII людини у клітинах СНО (яєчнику кипротеолітичне розщеплення тощо. В рівні техніки тайського хом'яка) та клітинах ВНКС (нирок дитинвідомо, що такі модифікації можуть відбуватися і чати хом'яка). Фактор VIII людини модифіковано можуть дещо відрізнятися залежно від типу клітидля видалення частини або усіх доменів В [Патент ни-хазяїна та інших факторів, і вони можуть даваСША №4868112], і здійснена спроба заміщення ти молекулярні ізоформи продукту зі збереженням домену В фактору VIII людини доменом В фактору прокоагуляційної активності. Дивися, наприклад, V людини [Патент США №5004803]. Послідовність Lind, P. et al., Ear. J. Biochem. 232:1927 (1995), що кДНК, що кодує фактор VIII людини, та передбачу 9 75064 10 вана амінокислотна послідовність показані у SEQ людини ("фактор Vllla") має три субелементи внаlD NO:1 та 2, відповідно. У SEQ lD NO:1, кодуючий слідок розщеплення великого ланцюга між домерегіон починається на нуклеотидній позиції 208, нами А1 та А2. Ця структура позначена як триплеті GCC, що є кодоном амінокислоти під ноА1/А2/А3-С1-С2. Фактор Vllla людини є нестабільмером 1 (Ala) розвиненого білку, який представленим в умовах, що стабілізують фактор Vllla свині, но послідовністю SEQ ID NO:2. ймовірно внаслідок слабшого зв'язку субелементу Фактор VIII свині виділено з плазми [Pass, D.N. А2 фактору Vllla людини. Дисоціація субелементу et al. (1982) Blood 59:594]. Часткова амінокислотна А2 фактору Vllla свині та людини пов'язана з втрапослідовність фактору VIII свині, відповідна частитою активності молекули фактору Villa. Yakhysev, нам N-кінцевої послідовності невеликого ланцюга, A. et al. (1997) Blood, 90: Suppl. 1, реферат №126, що гомологічні церулоплазміну, та фактор коагуописали зв'язування домену А2 білком, споріднеляції V були описані Church et al. (1984) Proc. Natl. ним з рецептором ліпопротеїну низької густини, Acad. Sci. USA. 81:6934. Toole, J.J. et al. (1984) підказуючи, що поглинання клітиною А2, опосереNature 312:342-347 описали часткове секвенсудковане таким зв'язуванням, призводить до понивання N-кінцевого закінчення чотирьох амінокисжувальної регуляції активності фактору VIII. лотних фрагментів фактору VIII свині, але не охаЕкспресію "фактору VIII без домену В" посирактеризували фрагменти, які у молекулі фактору люють включенням частини домену В. Включення VIII розташовані далі. Амінокислотні послідовності цих частин домену В, позначених як "SQ" [Lind, P. домену В та частини А2 домену фактору VIII свині et al. (1995) вище], призводить, як описано, до описані Toole, J.J. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci, кращої експресії. Констракти "SQ" не мають усіх USA 83:5939-5942. Послідовність кДНК, що кодує доменів В людини за винятком 5 амінокислот Nповний домен А2 фактору VIII свині та передбачузакінчення домену В та 9 амінокислот Свану амінокислотну послідовність і гібридний факзакінчення домену В. тор VIII людини/свині, що має заміщення усіх доОчищений гібридний фактор VIII або його фраменів, усі субелементи та специфічні гмент можна досліджувати на імунореактивність та амінокислотні послідовності, були розкриті у Патеактивність стосовно коагуляції стандартними доснті США №5364771 під назвою "Hybrid Huлідженнями, включаючи, наприклад, дослідження man/Porcine factor VIII" (Гібридний фактор VIII люз вільним від плазми фактором VIII, одноетапне дини/свині), отриманий 15 листопада 1994, та у дослідження згортання, та імуносорбентне досліWO 93/20093 опублікований 14 жовтня 1993. Посдження зі зв'язаним ферментом, використовуючи лідовність кДНК, що кодує домен А2 фактору VIII очищений рекомбінантний фактор VIII людини як свині, відповідний залишкам 373-740 у розвиненостандарт. му факторі VllI людини, який показано у SEQ lD Інші вектори, включаючи плазмідні та евкаріоNO:1, та передбачувана амінокислотна послідовтні вірусні вектори, можна використовувати для ність показані у SEQ ID NO: 3 та 4, відповідно. Пізекспресії рекомбінантного генного констракту у ніше, нуклеотидні та відповідні амінокислотні посевкаріотні клітини залежно від рішення та розсуду лідовності частини домену А1, що втратив першу фахівця в цій області [дивися, наприклад, Sam198 амінокислоту та домену А2 фактору VIII свині brook et al., Chapter 16]. Інші вектори та експресійні описані у WO 94/11503, опублікованому 26 травня системи, включаючи клітинні системи бактерій, 1994. Повну нуклеотидну послідовність, що кодує дріжджів та комах, використовувати можна, але фактор VIII свині, включаючи повний домен А1, гірше внаслідок відмінностей у глікозилуванні або активаційний пептид, домени A3, С1 та С2, а тайого відсутності. кож кодовану амінокислотну послідовність, під Рекомбінантний білок фактору VIII можна екскінець отримав Lollar, як це розкрито у Патенті пресувати у різноманітних клітинах, звичайно виСША №5859204, отриманому 12 січня 1999, та у користовуваних для культивації та експресії рекоWO 97/49725, опублікованій 31 грудня 1997, що мбінантного білку ссавця. Зокрема, виявлено, що надані тут як довідка. ряд ліній клітин гризунів є особливо корисними Фактор VIII свині та фактор VIII людини видіхазяями для експресії великих білків. Кращі лінії ляють з плазми як два субелементні білки. Субеклітин, доступні з Американської колекції типових лементи, відомі як великий ланцюг та невеликий культур (АТСС, Rockville, MD), включають клітини ланцюг, утримуються разом нековалентним зв'язнирок дитинчати хом'яка та клітини яєчнику китайком, що потребує іонів кальцію або іонів іншого ського хом'яка (СНО), які культивують, використодвовалентного металу. Великий ланцюг фактору вуючи звичайні способи та середовища. VIII містить три домени, A1, A2 та В, які зв'язані Базисомдля більшої активності стосовно коаковалентно. Невеликий ланцюг фактору VIII також гуляції фактору VIII свині є більш швидка спонтанмістить три домени, позначені як A3, С1 та С2. на дисоціація субелементу А2 людини з фактору Домен В має невідому біологічну функцію і його Vllla людини у порівнянні з субелементом А2 свині можна видалити, або частково видалити з молекуз фактору Vllla свині. Дисоціація субелементу А2 ли протеолітично або способами з використанням призводить до втрати активності, [Lollar, P. et al. рекомбінантної ДНК без значної зміни у будь(1990) J. Biol Chem. 265:1688-1692; Lollar, P. et al. якому вимірюваному параметрі фактору VIII. Ре(1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657; Fay, PJ. et комбінантний фактор VIII людини має структуру та al. (1992) J. Biol. Chem. 267:13246-13250]. функцію, подібну до похідного з плазми фактору Молекули фактору VIII зі зменшеною імунореVIII, хоча він не глікозилований, якщо не експресоактивністю ваний у клітинах ссавця. Епітопи, що є імунореактивними стосовно анАктивований фактор VIII свині та фактор VIII титіл, що інгібують активність стосовно коагуляції 11 75064 12 фактору VIII ("інгібітори" або "інгібувальні антитіниками фактору VIII. ла") охарактеризовано на базі відомих взаємовідПісля ідентифікації клінічно значущих епітопів ношень структура-функція у факторі VIII. Ймовірможна експресувати рекомбінантні молекули факно, інгібітори могли б діяти руйнуванням будь-якої тору VIII, що мають меншу чи однакову кросз макромолекулярних взаємодій, пов'язаних зі реактивність порівняно з фактором VIII, похідним з структурою домену фактору VIII або їх зв'язуванплазми свині при дослідженні in vitro широкого ням з фактором вон Віллебранда, тромбіном, факкола інгібувальних плазм. Додатковий мутагенез у тором Ха, фактором ІХа, або фактором X. Однак, регіонах епітопу можна зробити, щоб зменшити більшість інгібувальних антитіл до фактору VIII крос-реактивність. Зменшена крос-реактивність, людини діє зв'язуванням з епітопами, розташовахоча і потрібна, не є необхідною для виготовлення ними у домені фактору VIII А2 розміром 40кДа або продукту, що може мати переваги над існуючим домені С2 розміром 20кДа, руйнуючи специфічні фактором VIII, похідним з концентрату плазми функції, пов'язані з цими доменами, як описано свині, який може продукувати побічну дію внасліFulcher et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA док забруднення білками свині або забруднення 82:7728-7732; та Scandella et al. (1988) Proc. Natl. такими інфекційними агентами, як віруси або пріоAcad. Sci. USA 85:6152-6156. На додаток до епітони. Молекули рекомбінантного фактору VIII свині пів А2 та С2, у домені A3 або С1 невеликого ланабо модифікованого фактору VIII свині не містять цюга фактору VIII може бути третій епітоп, згідно з чужинних білків свині Scandella et al. (1993) Blood 52:1767-1775. ЗначенДіагностичні дослідження. ня цього гаданого третього епітопу невідомо, але кДНК фактору VIII та/або білок, експресований він, здається, має значення для другорядної частз неї, повний чи неповний, можна використовувати ки реактивності епітопу у фактор VIII. у дослідженнях як діагностичні реагенти для виАнти-А2-антитіла блокують активацію фактору значення інгібувальних антитіл до фактору VIII X, як показано Lollar et al. (1994) J. Clin. Invest. людини або тварини або, модифікованого фактору 92:2497-2504. Попередні картувальні дослідження VIII тварини у субстратах, включаючи, наприклад, делеційним мутагенезом, описані Ware et al. зразки сироватки та рідини з тіла людини у пацієн(1992) Blood Coagul. Fibrinotysis 3:703-716, показатів з нестачею фактору VIII. Ці дослідження антили розташування епітопу A2 в межах 20кДа регіону тіл включають такі дослідження, як дослідження NH2-кінцевого закінчення домену А2 розміром ELISA, імуноблотування, радіоімунодослідження, 40кДа. Конкурентні імунорадіометричні дослідженімунодифузійні дослідження та дослідження біолоня показали, що інгібітори А2 розпізнають спільний гічної активності фактору VIII (наприклад, досліепітоп або обмежено згруповані епітопи, які опидженням коагуляції) Способи виготовлення цих сано Scandella et al. (1992) Throm. Haemostas реагентів та способи їх використання відомі фахіJ7:665-611, та які описані у Патенті США вцям. Наприклад, імунодослідження для визна№5859204. чення інгібувальних антитіл у зразку сироватки Молекули фактору VIII тварини або модифікопацієнта може включати реакцію тест-зразку з дованого фактору VIII тварини можна досліджувати статньою кількістю досліджуваного фактору VIII, на людях на їх зменшені антигенність та/або імупри цьому у зразку досліджуваного фактору VIII ногенність у клінічних дослідженнях. У одному типі може утворюватися виявлюваний комплекс з інгідослідження, призначеному для визначення, чи є бувальними антитілами, що є показником його фактор VIII імунореактивним з інгібувальними анантигенності.. титілами, фактор VIII застосовують переважно Зонди нуклеїнових кислот та амінокислот мовнутрішньовенними вливаннями приблизно 25 жна виготовити на основі послідовності кДНК гібпацієнтам, що мають нестачу фактору VIII і мають ридного фактору VIII або молекул його білку або антитіла, які інгібують активність стосовно коагуфрагментів. У деяких втіленнях їх можна мітити, ляції терапевтичного фактору VIII людини. Доза використовуючи барвники або ферментні, флуофактору VIII тварини або модифікованого фактору ресцентні, хемілюмінесцентні, або радіоактивні VIII тварини знаходиться переважно у межах між 5 мітки, що є комерційно доступними. Амінокислотні та 50одиниць/кг маси тіла, переважно 10зонди можна використовувати, наприклад, для 50одиниць/кг, а найкраще - 40одиниць/кг маси тіскринінгу сироваток або інших рідин з тіла, де є ла. Приблизно через 1 годину після кожного увеприпустимою присутність інгібіторів до фактору дення відновлення фактору VIII зі зразків крові VIII людини чи тварини або гібридного фактору VIII вимірюють у одно-етапному дослідженні коагулялюдини/тварини. Рівні інгібіторів у пацієнтів можна ції. Зразки беруть знов приблизно через 5 годин вимірювати та порівнювати з контрольними зразпісля вливання та вимірюють відновлення. Загаками від здорових людей, їх можна використовульне відновлення та швидкість зникнення фактору вати, наприклад, для визначення, чи можна пацієVIII зі зразків є прогнозувальними стосовно титру нта з нестачею фактору VIII лікувати фактором VIII антитіла та інгібувальної активності. Якщо титр тварини або модифікованим фактором VIII твариантитіла є високим, відновлення фактору VIII звини. Зонди кДНК можна використовувати, напричайно не можна вимірювати. Результати відновклад, для мети дослідження при скринінгу бібліолення порівнюють з результатами відновлення у тек ДНК. пацієнтів, лікованих фактором VIII, похідним з плаФармацевтичні композиції. зми людини, рекомбінантним фактором VIII людиФармацевтичні композиції, що містять рекомни, фактором VIII, похідним з плазми свині, та інбінантний фактор VIII свині або модифікований шими звичайно використовуваними фактор VIII свині, поодинці або у комбінації з притерапевтичними формами фактору VIII або замісйнятними фармацевтичними стабілізаційними 13 75064 14 сполуками, середовищами для доставки та/або Фактор VIII свині або модифікований фактор носіями, виготовляють відомими способами, як VIII свині можна зберігати зв'язаним з vWf для збіописав E.W. Martin у Remington's Pharmaceutical льшення часу напіввиведення та власного часу Sciences. існування гібридної молекули. Крім того, ліофіліЗгідно з одним втіленням винаходу запропозація фактору VIII може збільшити вихід активних новано кращі носії або середовища для доставки молекул у присутності vWf. Сучасні способи збевнутрішньовенним вливанням, якими є фізіологічреження фактору VIII людини та тварини, викорисний розчин або буферований фосфатом фізіологітовувані комерційними постачальниками, можна чний розчин. застосовувати для збереження рекомбінантного Згідно з іншим втіленням винаходу придатні фактору VIII. Ці способи включають: (1) ліофілізастабілізаційні сполуки, середовища для доставки цію фактору VIII у частково очищеному стані (як та носії включають, але без обмеження інші білки "концентрат" фактору VIII, що інфундують без полюдини або тварини, як-то альбумін. дальшої очистки); (2) імуноафінну очистку фактору Фосфоліпідні середовища або суспензії ліпоVIII способом Зиммерманна та ліофілізацію у присом є також кращими як фармацевтично прийнятні сутності альбуміну, який стабілізує фактор VIII; (3) носії або середовища для доставки. Їх можна виліофілізацію рекомбінантного фактору VIII у присуготовити способами, що відомі фахівцям, вони тності альбуміну. можуть містити, наприклад, фосфотидилсеКрім того, фактор VIII свині або модифіковарин/фосфотидилхолін, або інші композиції фосний фактор VIII свині, як виявлено, є необмежено фоліпідів або детергентів, що разом надають постабільним при 4°С у 0,6Μ NaCl, 20мМ MES, та верхні негативного заряду, оскільки фактор VIII 5мМ СаСl2 при рН 6,0, а також його можна зберігаприєднується до негативно заряджених фосфоліти замороженим у цих буферах та розтоплювати з підних мембран. Ліпосоми можна виготовити розмінімальною втратою активності. чиненням прийнятного ліпіду(ів) (як-то стеароїлСпособи лікування. фосфоти-дилетаноламін, Рекомбінантний фактор VIII свині або модифістеароїлфосфотидилхолін, арахадоїлфосфотидикований фактор VIII свині використовують для лілхолін та холестерин) у неорганічному розчиннику, кування неконтрольованої кровотечі внаслідок що далі випарюють, отримуючи після цього тонку нестачі фактору VIII (наприклад, внутрішньосуглоплівку висушеного ліпіду на поверхні посудини. бова, внутрішньочерепна, або шлунково-кишкова Далі у посудину уводять водний розчин гібридного кровотеча) при гемофілії з інгібувальними антитіфактору VIII. Посудину далі збовтують вручну для лами та без них, а також у пацієнтів з набутою вивільнення ліпідного матеріалу зі стінок посудини нестачею фактору VIII внаслідок розвинення інгіта для диспергування ліпідних агрегатів, утворююбувальних антитіл. Активні матеріали застосовучи тим самим суспензію ліпосом. ють переважно внутрішньовенно. Рекомбінантний фактор VIII свині або модифіКрім того, рекомбінантний фактор VIII свині кований фактор VIII свині можна комбінувати з або модифікований фактор VIII свині можна застоіншими придатними стабілізаційними сполуками, совувати трансплантуванням генетично змінених середовищами для доставки та/або носіями, клітин для виготовлення білку імплантуванням включаючи залежні від вітаміну К фактори згорзасобу, що містить такі клітини, які описано вище. тання, тканинний фактор та фактор вон ВіллебраЗгідно з кращим втіленням винаходу фарманда (vWf) або фрагмент vWf, що містить сайти цевтичні композиції рекомбінантного фактору VIII зв'язування фактору VIII, та полісахариди, як-то свині або модифікованого фактору VIII свині поосахароза. динці або у комбінації зі стабілізаторами, середоРекомбінантний фактор VIII свині або модифівищами для доставки, та/або носіями інфундують кований фактор VIII свині можна також доставляти у пацієнтів внутрішньовенно таким же способом, генною терапією таким чином, щоб доставляти що використовують для вливання фактору VIII фактор VIII людини, використовуючи такі засоби людини або тварини. доставки, як ретровірусні вектори. Цей спосіб Лікувальні дози композиції рекомбінантного складається з уведення потрібного констракту фактору VIII свині або модифікованого фактору кДНК фактору VIII у клітини людини, які трансплаVIII свині, яку слід застосовувати стосовно пацієннтують безпосередньо у пацієнта з нестачею факту, якому необхідне таке лікування, варіюватимуть тору VIII або які розміщають у придатному для залежно від суворості нестачі фактору VIII. Взагаімплантації засобі, проникному для молекул факлі, рівні доз підбирають за частотою, тривалістю та тору VIII, але непроникному для клітин, який далі кількістю одиниць у згоді з суворістю та тривалістю трансплантують. Кращий спосіб полягає у опосекожного випадку кровотечі у пацієнта. Відповідно, редкованому ретровірусом генному переносі. За фактор VIII включено у фармацевтично прийнятцим способом екзогенний ген (наприклад, кДНК ний носій, середовище для доставки, або стабіліфактору VIII) клонують у геном модифікованого затор у кількості, достатній для доставки пацієнту ретровірусу. Ген вставляють у геном клітини хазятерапевтично ефективної кількості білку для зупиїна за допомогою вірусу, де він буде експресуванки кровотечі, яку виміряно стандартними дослітися клітиною. Ретровірусний вектор модифікують дженнями згортання. так, щоб він не продукував вірус, попереджуючи Фактор VIII класично визначено як присутню у вірусну інфекцію хазяїна. Загальні принципи цього нормальній плазмі кров речовину, що коректує типу терапії відомі фахівцям та описані у літератудефект згортання у плазмі, похідній від осіб з гері [наприклад, Kohn, D.B. etal. (1989) Transiifusion мофілією А. Активність стосовно коагуляції in vitro 29:812-820]. очищених та частково очищених форм фактору 15 75064 16 VIII використовують для розрахунку дози фактору наявністю розвинених антитіл до фактору VIII люVIII для вливань у людей-пацієнтів, вона є надійдини. У цьому випадку активність стосовно коагуним індикатором активності, отриманої з плазми ляції, що є віщою у порівнянні з активністю фактопацієнта, та корекції дефекту кровотечі in vivo. He ру VIII людини або тварини поодинці не є описані відхилення між стандартним дослідженнеобхідною. Активність стосовно коагуляції, що є ням нових молекул фактору VIII in vitro та їх повенижчою у порівнянні з активністю фактору VIII людінкою у моделі вливання собакам або у людейдини (тобто менше 3000одиниць/мг) буде кориспацієнтів, згідно з Lusher, J.M. et al. New Engl. J. ною, якщо її не нейтралізують антитіла у плазмі Med. 328:453-459; Pittman, D.D. et al. (1992) Blood пацієнта. 79:389-397; та Brinkhous et al. (1985) Proc. Natl. Тут продемонстровано, що рекомбінантний Acad. Sci. 82:8:752-8755. фактор VIII свині та модифіковані фактори VIII Звичайно, потрібний рівень активності фактосвині можуть відрізнятися за специфічною активніру VIII плазми, що досягають у пацієнта застосустю від фактору VIII людини. Білки фактору VIII, ванням рекомбінантного фактору VIII свині або що мають більшу прокоагуляційну активність у модифікованого фактору VIII свині, знаходиться у порівняні з фактором VIII людини, є корисними при межах 30-100% від нормального. За кращим сполікуванні гемофілії, оскільки для корекції нестачі собом застосування терапевтичного фактору VIII, фактору VIII у пацієнта будуть потрібними нижчі композицію уводять внутрішньовенно у кращій дозі дози. Фактори VIII, що мають нижчу прокоагуляу межах приблизно від 5 до 50одиниць/кг маси ційну активність у порівняні з фактором VIII людитіла, переважно у межах 10-50одиниць/кг маси ни є також придатними для терапевтичного викотіла, а найкраще у дозі 20-40одиниць/кг маси тіла; ристання за умови, що вони мають щонайменше інтервал частоти знаходиться у межах приблизно 1% специфічної активності порівняно з нормальвід 8 до 24 годин (у випадку суворої гемофілії); а ним фактором VIII людини. Фактор VIII представтривалість лікування у добах знаходиться у межах леного винаходу, що має прокоагуляційну активвід 1 до 10 діб або доки не втихомириться кровоність, є тому визначено як такий, що має теча. Дивися, наприклад, Roberts, H.R., and M.R щонайменше 1% специфічної активності фактору Jones, "Hemophilia and Related Conditions - CongeVIII людини. nital Deficiencies of Prothrombhi (Factor II, Factor V, Молекула рекомбінантного фактору VIII свині and Factors VII to XII), (Гемофілія та споріднені або модифікованого фактору VIII свині та способи стани - уроджена нестача протромбіну (Фактор II, її виділення, аналізу, створення та використання, Фактор V, та Фактори VII -XII)), Ch. 153, 1453що взагалі описані вище, далі будуть зрозумілими 1474,1460, у Hematohzv. Williams, W. X, et al., ed. з посилання на наступні необмежувальні прикла(1990). Пацієнти з інгібіторами можуть потребувати ди. відмінної кількості рекомбінантного фактору VIII Приклад 1: Дослідження фактору VIII свині та свині або модифікованого фактору VIII свині, ніж їх гібридного фактору VIII людини/свині. попередня форма фактору VIII. Наприклад, пацієФактор Vllla свині має більшу активність стонти можуть потребувати менше рекомбінантного совно коагуляції у порівнянні з фактором VIII люфактору VIII свині або модифікованого фактору дини на основі специфічної активності молекули. VIII свині внаслідок його вищої специфічної активЦей висновок базується на використанні прийнятності у порівнянні з фактором VIII людини та змених стандартних кривих, що дозволяють достатньо ншеною реактивністю стосовно антитіл. Як при надійно порівнювати фактор VIII людини з фактолікуванні фактором VIII людини або фактором VIII, ром свині. Дослідження коагуляції базуються на похідним з плазми свині, кількість інфундованого здатності фактору VIII скорочувати час згортання терапевтичного фактору VIII визначають одноплазми, похідної від пацієнта з гемофілією А. Заетапним дослідженням коагуляції фактору VIII, а у стосовуваними типами досліджень були: одновибраних випадках відновлення in vivo визначають етапне та дво-етапне дослідження. виміром фактору VIII у плазмі пацієнта після влиУ одно-етапному дослідженні 0,1мл плазми вання. Слід розуміти, що для будь-якої певної пацієнта з гемофілією A [George King Biomedical, особи конкретні дозові режими слід підбирати проInc.] інкубували з 0,1мл активованого часткового тягом часу, зважаючи на особу та професійний тромбопластинового реагенту (АРТТ) (Organon розсуд персони, що надає допомогу, або контроTeknika) та 0,01мл зразку або стандарту, що склалюючи застосування композицій, та на те, що даються з доповненої цитратом плазми нормальпредставлені тут межі концентрацій є тільки прикної людини, протягом 5 хвилин при 37°С на водяладами і не обмежують рамок та практичного виній бані. Інкубування проводили з додаванням користання заявленої композиції. 0,1мл 20мМ СаСl2, а час розвитку фібринового Лікування може мати форму одиничного внуттромбу визначали візуально. рішньовенного уведення композиції або періодичОдиницю інтенсивності фактору VIII визначаного або безперервного уведення протягом тривають як кількість, присутню у 1мл доповненої цитлого періоду часу, за потребою. Альтернативно, ратом плазми нормальної людини. З плазмою лютерапевтичний фактор VIII можна застосовувати дини як стандартом активність фактору VIII свині підшкірно або перорально з ліпосомами одною та фактору VIII людини порівнювали безпосередабо кількома дозами при різних інтервалах часу. ньо. Розбавлення плазми стандартним або очиРекомбінантний фактор VIII свині або модифіщеним білками здійснювали у 0,15Μ NaCl, 0,02Μ кований фактор VIII свині можна також використоГЕПЕС, рН 7,4. Стандартну криву створювали на вувати для лікування неконтрольованої кровотечі основі 3 або 4 розбавлень плазми, найвище розвнаслідок нестачі фактору VIII при гемофіліях з бавлення складало 1/50, та на залежності Iog10 17 75064 18 часу згортання від Iog10 концентрації плазми, що людини та фактору VIII свині препарати високоопризводить до лінійної залежності. Число одиниць чищеного рекомбінантного фактору VIII людини фактору VIII у невідомому зразку визначали інтер(Cutter Laboratories, Berkeley, CA) та фактору VIII поляцією за стандартною кривою. свині [імуноочищений як описано Pass et al. (1982) Одно-етапне дослідження основане на ендоBlood 59:594] піддавали високоефективній рідинній генній активації фактору VIII активаторами, утвохроматографії (ВЕРХ) на аніоно-обмінній колонці реними у плазмі пацієнта з гемофілією А, в той час Mono Q™ (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) (Pharяк у дво-етапному дослідженні вимірюють прокоаmacia, Inc.). Метою етапу ВЕРХ Mono Q™ була гуляційну активність попередньо активованого оцінка наявності незначних забруднень обміну фактору VIII. У дво-етапному дослідженні, зразки, фактору VIII людини та фактору VIII свині у спільщо містять фактор VIII, що прореагував з тромбіному буфері з метою порівняння. Склянки, що місном, додавали до суміші активованого часткового тили 1000-2000одиниць фактору VIII відтворювали тромбопластину та плазми людини-пацієнта з гедодаванням 5мл Н2О. Гепес (2Μ при рН 7,4) далі мофілією А, яку попередньо інкубовано протягом 5 додавали до кінцевої концентрації 0,02М. Фактор хвилин при 37°С. Одержані часи згортання перетVIII вносили у колонку Mono Q™. HR 5/5, урівноворювали далі у число одиниць/мл, базуючись на важену у 0,15Μ NaCl, 0,02Μ Гепес, 5мМ СаСl2, при вищенаведеній стандартній кривій для людини. рН 7,4 (Буфер А плюс 0,15Μ NaCl); промивали Відносна активність у дво-етапному дослідженні 10мл буферу А + 0,15Μ NaCl; та елюювали 20мл з була вищою, ніж у одно-етапному дослідженні, лінійним градієнтом від 0,15Μ до 0,90Μ NaCl у оскільки фактор VIII був попередньо активованим. буфері А при швидкості потоку 1мл/хвилин. Приклад 2: Визначення параметрів функціонаДля порівняння похідного з плазми фактору льної відмінності між фактором VIII свині людини VIII людини (очищений за допомогою ВЕРХ Mono та. Q™) та імуноафінно очищеного фактору VIII свині, Виділення похідних з плазми фактору VIII свифактор VIII, похідні з плазми свині розбавляли 1:4 ні і фактору VIII людини та рекомбінантного фак0,04Μ Гепес, 5мМ СаСl2, 0,01% Твін-80, при рН тору VIII людини описано у літературі Fulcher, С. A. 7,4, та піддавали ВЕРХ Mono Q™ в таких же умоet al. (1982) Proc. Nail. Acad Sci. USA 79:1648-1652; вах, як описані у попередньому розділі для фактоTook et al. (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Inру Vllla людини. Ці способи виділення фактору VIII stitute); Gitschier et al. (1984) Nature 312:326-330 людини та фактору VIII свині є стандартними для (Genentech); Wood et al. (1984) Nature 312:330-337 фахівців. (Genentech); Vehar et al. 312 Nature 312:337-342 Фракції з колонки досліджували на активність (Genentech); Pass et al. (1982) Blood 59:594; Toole фактору VIII одно-етапним дослідженням коагуляet al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5939ції. Середні результати досліджень, виражені у 5942. Цього можна досягти кількома шляхами. Усі одиницях активності на A280 матеріалу, надано у ці препарати є подібними за складом субелементу, Таблиці II показано, що фактор VIII свині має щохоча існують функціональні відмінності у стабільнайменше у шість разів більшу активність, ніж фаності між фактором VIII людини та фактором VIII ктор VIII людини при використанні одно-етапного свині. дослідження. Для порівняння рекомбінантного фактору VIII Таблиця ll Порівняння активності стосовно коагуляції фактору VIll людини та фактору VllI свині Свині Похідної з плазми людини Людини рекомбінантний Приклад 3: Порівняння стабільності фактору VIII людини та фактору VIII свині Результати одноетапного дослідження фактору VIII відображають активацію фактору VIII до фактору Vllla у зразку та можливу втрату утвореної фактором Villa активності. Здійснювали пряме порівняння стабільності фактору VIII людини та фактору VIII свині. Зразки з ВЕРХ Mono Q™ [Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.] розбавляли до такої ж концентрації та складу буферу і піддавали дії тромбіну. В різні часи зразки видаляли для дво-етапного дослідження коагуляції. Звичайно пік активності (через 2 хвилини) був у 10 разів більшим для фактору Vllla свині, ніж фактору Vllla людини, а активності фактору Vllla свині та фактору Vllla людини далі зменшувалися при більш швидкому зниженні активності фактору Vllla людини. Активність (одиниць/Α280) 21300 3600 2400 Взагалі, спроби виділити стабільний фактор Vllla людини є безуспішниминавіть коли використовують умови, що продукують стабільний фактор Vllla свині. Для демонстрації цього очищений за допомогою ВЕРХ Mono Q™ фактор VIII людини активували тромбіном та піддавали дії катіонообмінної ВЕРХ Mono S™ (Pharmacia, Inc.) в умовах, що продукують стабільний фактор Vllla свині, як описано Lollar et al. (1989) Biochemistry 28:666. Фактор VIII людини, 43мг/мл (0,2мкMJ у 0,2Μ NaCl, 0,01Μ Гепес, 2,5мМ СаСl2) при рН 7,4, у загальному об'ємі 10мл, реагував з тромбіном (0,036мкМ) протягом 10 хвилин, протягом якого часу додавали FPR-CH2CI D-феніл-проліл-аргінілхлорметилкетон до концентрації 0,2мкМ для необоротної інактивації тромбіну. Суміш далі розбавляли 1:1 40мМ 2-(N-морфоліно)етансульфоновою 19 75064 20 кислотою (MES), 5мМ СаСl2, при рН 6,0, та заван7500одиниць/А280). Однак, за контрастом до фактажували при швидкості 2мл/хвилини у колонку тору Vllla свині, виділеному при рН 6,0, який є неоMono S™ HR 5/5 ВЕРХ (Pharmacia, Inc.), урівновабмежено стабільним при 4°С, активність фактору жену у 5мМ MES, 5мМ СаСl2, при рН 6,0 (Буфер В) Vllla людини зменшувалася постійно протягом кіплюс 0. 1Μ NaCl. Фактор Vllla елюювали без пролькох годин після елюювання з Mono S™. Крім мивки колонки 20мл з градієнтом від 0,1Μ NaCl до того, специфічна активність фактору Vllla очище0,9Μ NaCl у буфері В при швидкості 1мл/хвилину. ного при рН 5,0 та дослідженого негайно, складає Фракцію з активністю стосовно коагуляції у тільки 5% від активності фактору Vllla свині, вкадво-етапному дослідженні елюювали як одиничзуючи, що перед дослідженням відбувалася суттєний пік в цих умовах. Специфічна активність пікова дисоціація. вої фракції була приблизно 7500 одиниць/А280. Ці результати демонструють, що фактор Vllla Електрофорез на гелі з додецилсульфатом налюдини та фактор Vllla свині складаються з трьох трію-поліакриламідом (SDS-PAGE) Mono S™ піку субелементів (А1, А2, та А3-С1-С2). Відщеплення фактору Vllla, з наступним проявленням білку срісубелементу А2 є відповідальним за втрату активблом, виявив дві смуги, відповідні гетеродимерноності фактору Vllla людини та фактору Vllla свині в му (А3-С1-С2/А1) похідному фактору VIII. Хоча деяких умовах, як-то фізіологічні іонна сила, рН, та фрагмент А2 не було ідентифіковано проявленням концентрація. Відносна стабільність фактору Vllla сріблом в цих умовах внаслідок його низької консвині в деяких умовах відбувається внаслідок сицентрації, його було ідентифіковано як слідову льнішого зв'язування субелементу А2. складову міченням 125-І. Приклад 4: Виділення та секвенсування ДНК, За контрастом до результатів з фактором VIII що кодує домен А2 фактору VlII свині. людини фактор Vllla свині, виділений за допомоТільки нуклеотидна послідовність, що кодує гою ВЕРХ Mono S™ в таких же умовах мав специдомен В та частину домену А2 фактору VIII свині секвенсовано раніше [Toole et al. (1986) Proc. Natl. фічну активність 1,6 106 одиниць/А280,. Аналіз фаAcad. Sci. USA 83:5939-5942]. Тут розкриті кДНК та ктору Vllla свині за допомогою SDS-PAGE виявив 3 передбачувані амінокислотні послідовності (SEQ фрагменти, відповідні субелементам А1, А2, та ID NO: 3 та 4, відповідно) для повного домену А2 А3-С1-С2, демонструючи, що фактор Vllla свині фактору VIII свині. має три субелементи. Домен А2 фактору VIII свині клонували звороРезультати ВЕРХ Mono S™ препаратів актитною транскрипцією загальної РНК селезінки свині вованого тромбіном фактору VIII людини при рН та PCR-ампліфікацією; використовували виродже6,0 свідчать, що фактор Villa людини є лабільним в ні праймери на основі відомої послідовності кДНК умовах, що дають стабільний фактор Vllla свині. фактору VIII людини та належний праймер свині Однак, хоча у піковій фракції було ідентифіковано на основі частини послідовності фактору VIII свині. слідові кількості фрагменту А2, визначення, чи Продукт PCR розміром 1 ко виділяли та ампліфібула неможливою при використанні цього способу кували вставкою у фагемідний (phagemid) вектор поодинці активність стосовно коагуляції, що є реBluescript™ (Stratagene). зультатом невеликої кількості гетеротримерного Домен А2 свині було повністю секвенсовано фактору Vllla або від гетеродимерного фактору дидезоксисеквенсуванням. кДНК та передбачувані Vllla, що має низьку специфічну активність. амінокислотні послідовності описані SEQ lD NO: 3 Спосіб виділення фактору Villa людини перед та 4, відповідно. втратою ним його субелементу А2 є потрібним для Приклад 5: Повна послідовність ДНК, що кодує розв'язання цього питання. Щоб покінчити з цим, фактор VIII свині. виділення досягали способом, що включає зменКленовий фрагмент, фосфориловані лінкери шення рН буферів Mono S™ до рН 5. Mono Q™СlаІ, лінкери NotI, лігазу Т4, та ДНК-полімеразу очищений фактор VIII людини (0,5мг) розбавляли Taq отримували від Promega (Madison, Wisconsin). водою для одержання кінцевої композиції з Полінуклеотидну кіназу отримували від Life Tech0,25мг/мл (1мкм) фактору VIII у 0,25Μ NaCl, 0,01Μ nologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. 32Ρ-ΑΤΡ Гепес, 2,5мМ СаСl2, 0,005% Твін-80, при рН 7,4 (загальний об'єм 7,0мл). Тромбін додавали до кін(Redivue, >5000Кі/ммоль) отримували від Amerцевої концентрації 0,072мкм та давали реагувати sham. pBluescript II KS-, а клітини Е. coli Epicurean протягом 3 хвилин. Тромбін далі інактивували XL1-Blue отримували від Stratagene (La Jolla, CaliFPR-СН2СІ (0,2мкм). Суміш далі розбавляли 1:1 fornia). Синтетичні олігонуклеотиди отримували від 40мМ ацетату натрію, 5мМ СаСl2, 0,01% Твін-80, Life Technologies, Inc. або Cruachem, Inc. 5'при рН 5,0, та завантажували при швидкості фосфориловані праймери використовували, коли 2мл/хвилин у колонку Mono S™ HR 5/5 ВЕРХ, уріPCR-продукти виготовляли з метою клонування. вноважену у 0,01Μ ацетаті натрію, 5мМ СаСl2, Нуклеотидна (нк) нумерація олігонуклеотидів, ви0,01% Твін-80, при рН 5,0, плюс 0,1Μ NaCl. Фактор користовуваних як праймери для полімеразної Vllla елюювали без промивки колонки 20мл з граланцюгової реакції ампліфікації (PCR) кДНК або дієнтом від 0,1М NaCl до 1,0Μ NaCl у такому ж геномної ДНК fVIII свині, використовує кДНК fVIII буфері при швидкості 1мл/хвилину. Це призводить людини як посилання (Wood et al. (1984) вище). до відновлення активності стосовно коагуляції у Загальну РНК селезінки свині виділяли кислопіці, що містить виявлювані кількості фрагменту тною екстракцією з тіоціанатом гуанідініюА2, як показано за допомогою SDS-PAGE та профенолом-хлороформом [Chomczynski et al. (1987) явлення сріблом. Специфічна активність пікової Anal. Biochem. 162:156-159]. кДНК свині виготовфракції була у десять разів більшою, ніж отримана ляли з загальної РНК селезінки, використовуючи при рН 6,0 (75000одиниць/А280 проти зворотну транскриптазу (RT) вірусу Молоні миша 21 75064 22 чої лейкемії та випадкові гексамери для праймуним стосовно 8 нуклеотидів на закінченні 3' [Sieвання реакції (комплект First-Strand cDNA Synthebert, P.D., et al. (1995) Nucleic. Acids. Res. 23:1087sis Kit, Pharmacia Biotech) якщо не показано інше. 1088]. Перший раунд PCR здійснювали, викорисРеакційні суміші RT містили по 45мМ Трис-Сl, рН товуючи адаптер-специфічний олігонуклеотид, 8,3, 68мМ КСl, 15мМ DTT, 9мМ MgCl2, 0,08мг/мл SEQ lD NO:6 5'-ССА ТСС ТАА TAG GAG ТСА СТА альбуміну коров'ячої сироватки та 1,8мМ трифосTAG GGC-3' (позначені АРІ) як сенсовий праймер, фату дезоксинуклеотиду (dNTP). Геномну ДНК та специфічний стосовно домену А2 fVIII свині свині виділяли з селезінки, використовуючи станолігонуклеотид SEQ ID NO:7 5-ССА TTG АСА TGA дартний спосіб (Strauss, W.M. (1995) Current ProtoAGA CCG ТТТ СТС-3' (нк 2081-2104) як антисенcols in Molecular Biology (Сучасні протоколи у мосовий праймер. Другий раунд PCR здійснювали, лекулярній біології), Μ. Ausubel et al., видавн., John використовуючи ущільнений, адаптерWiley & Sons, стор. 2,2,1-2,2,3). Виділення ДНК з специфічний олігонуклеотид, SEQ ID NO:8 5'-АСТ агарозних гелів здійснювали, використовуючи CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (позначений комплект Geneclean II (Bio 101) чи Quiex II Gel ExАР2) як сенсів праймер, та ущільнений, специфічtraction (Qiagen). ний стосовно домену А2 свині олігонуклеотид SEQ Реакції PCR здійснювали, використовуючи lD ND:9 5'-GGG TGC ААА GCG CTG АСА ТСА термоциклер Hybaid OmniGene. Для реакцій PCR GTG-31 (нк 1497-1520) як антисенсовий праймер. із застосуванням ДНК-полімерази Taq, реакційні PCR проводили, використовуючи комерційний суміші включали 0,6мМ MgCl2, 0,2мМ різних dNTP, комплект (Advantage cDNA PCR core kit), який має 0,5мкМ олігонуклеотидних праймерів, протокол опосередкованого антитілом гарячого 50одиниць/мл полімерази та 0,1 об'єму реакційної запуску [Kellogg, D.E. et al. (1994) BioTechniques суміші першого ланцюга кДНК. Якщо не показано 16:1134-1137]. Умови PCR включали денатурацію інше, PCR-продукти очищали на гелі, притуплювапри 94°С протягом 60с, далі 30 циклів (перша ли закінчення кленовим фрагментом, осаджували PCR) або 25 циклів (друга PCR) денатурації протяз етанолу та зшивали з сайтом EcoRV дефосфогом 30с при 94°С, гібридизація протягом 30с при рилованого pBluescript II KS- або зшивали з фос60°С та продовження протягом 4 хвилин при 68°С, форилованими лінкерами СlаІ, використовуючи використовуючи регулювання температури туби. лігазу Т4, розщеплювали за допомогою СlаІ, очиЦей спосіб дав відомий продукт розміром приблищали за допомогою хроматографії Sephacryl S400, зно 1,6 ко, який був узгодженим з ампліфікацією та зшивали за допомогою Clal-cut, дефосфорилофрагменту протяжністю приблизно 150 по у 5' ваним pBluescript II KS-. Зшивання здійснювали, UTR. PCR-продукт клонували у pBluescript, виковикористовуючи лігазу ДНК Т4 (комплект Rapid ристовуючи лінкери CM. Вставки чотирьох клонів ДНК ligation kit, Boehringer Mannheim), якщо не було секвенсовано у обох напрямках. показано інше. Плазміди з вмістом вставки pBluesПослідовність цих клонів включала регіони, віcript II KS- використовували для трансформації дповідні 137 по 5' UTR, сигнальному пептиду, доклітин Е. соlі Enicurean XLl-Blue. мену А1 та частині домену А2. Узгодження досягСеквенсування плазмідної ДНК здійснювали, ли щонайменше у 3 з 4 сайтів. Однак, клони використовуючи секвенсор Applied Biosystems містили середнє число явних PCR-генерованих 373a automated DNA та комплект PRISM dye termiмутацій 4, ймовірно внаслідок множинності раундів nator kit, або вручну, використовуючи комплект PCR, потрібних для створення здатного до клонуSequenase v. 2.0 sequencing kit (Amersham Corpoвання продукту. Отже, ми використовували посліration). Пряме секвенсування PCR-продуктів, довність, отриману з регіону сигнального пептиду включаючи мічені на кінці 32Р олігонуклеотиди, для створення сенсового PCR-праймеру з фосфоздійснювали, використовуючи протокол циклічного рилованим ланцюгом, SEO lD NQ:10 5'-ССТ СТС секвенсування (dsDNA Cycle Sequencing System, GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG СТА Life Technologies). GAG CTC ТСС АСС TG-3', позначеного як REВиділення клонів кДНК fVIII свині, що містять 5' NEOPIGSP, для синтезу іншого PCR-продукту для UTR послідовність, сигнальний пептид та колони підтвердження послідовності та для клонування у домену А1. вектор експресії. Послідовність, що підкреслена, кДНК fVlII свині, розташовану 5' стосовно допредставляє старт-кодон. Послідовність 5' стосовмену А2, ампліфікували за допомогою ущільненої но цього представляє послідовність, ідентичну RT-PCR загальної РНК селезінки самиці свині, послідовності 5' сайту вставки у векторі експресії використовуючи протокол 5'-швидкої ампліфікації ReNeo ссавця, використовуваному для експресії кінців кДНК (5'-RACE) (Marathon cDNA fVIII (Lubin et al. (1994) вище). Цей сайт включає Amplification, Clontech, Version PR55453). Це вклюсайт розщеплення Xhol (підкреслений). RENEOчало синтез першого ланцюга кДНК, використовуPIGSP, а олігонуклеотид з нк 1497-1520 викорисючи зістиковуваний жмутом праймер оліго (dT) товували для праймування опосередкованої полі[Borson, N.D. et al. (1992) ΡCR Methods Appi. 2:144меразою ДНК Taq PCR-реакції, використовуючи 148], синтез другого ланцюга кДНК, використовуюкДНК селезінки самиці свині як темплат. ДНКчи полімеразу І ДНК Ε. соlі, та зшивку з 5' продовполімерази від кількох інших виробників були неженим дволанцюговим адаптером, SEQ ID NO:5 придатними для отримання виявлюваного продукту. Умови PCR включали денатурацію при 94°С протягом 4 хвилин, далі 35 циклів денатурації протягом 1 хвилини при 94°С, гібридизацію протягом 2 чий короткий ланцюг було блоковано на закінченні 3' аміногрупою для зменшення неспецифічхвилин при 55°С та продовження протягом 2 хвилин при 72°С, а далі кінцевий етап продовження ного PCR-праймування, і який був комплементар 23 75064 24 протягом 5 хвилин при 72°С. PCR-продукт клонулено, що кДНК людини та свині від нк 6565 до 3' вали у pBluescript, використовуючи лінкери СlаІ. закінчення домену СІ були ідентичні. PCR-продукт Вставки двох цих клонів було секвенсовано у обох клонували у сайт EcoRV pBluescript II KS-. Чотири напрямках та сполучено з узагальнюючою типоклони було повністю секвенсовано у обох напрямвою послідовністю. ках. Узгодженості було досягнуто щонайменше у 3 Виділення клонів кДНК fVIII свині, що містять з 4 сайтів. колони A3, СІ та 5' половину домену C2. Виділення клонів кДНК fVlll свині, що містять 3' Спочатку клонували два RT-PCR-продукти з частину кодонів домену С2. селезінки свині, відповідні фрагменту домену В-А3 Домен С2 людини fVIII (нуклеотиди 6574-7053) (нк 4519-5571) та фрагменту домену С1-С2 (нк міститься всередині екзонів 24-26 [Gitschier J. et al. 6405-6990). 3' закінчення домену С2 було отрима(1984) Nature 312:326-330]. Екзон людини 26 місно розташованим у регіоні екзону 26, який є кінцетить 1958 по, відповідних нуклеотидам 6901-8858. вим екзоном у fVTII. Продукт В-А3 створювали, Він включає 1478 по 3' нетрансльованої послідоввикористовуючи специфічний стосовно домену В ності. Спроби клонування кДНК екзону 26, відповісвині праймер, SEQ lD NO: 11 5' CGC GCG GCC дного 3' закінченню домену С2, та 3'UTR, 3' RACE GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT Τ 3', де підкре[Siebert et al. (1995) вище], зворотною PCR [Ochслений регіон стосується регіону у fVIII свині, що man, H. et al. (1990) Biotechnology (NY). 8:759-760], суміщений з нк 4519-4530 у fVIII людини. 5' регіон PCR, сайт-обмеженою [Sarkar, G. et al. (1993) олігонуклеотиду включає сайт NotI, що був спочатPCRMeth. Appl. 2:318-322], "непередбачувано ку призначений для клонування. Антисенсовий праймованою" PCR [Dominguez, О. et al. (1994) праймер, використовуваний при створенні продукNucleic. Acids Res. 22:3247-3248] та скринінгом ту В-АЗ, SEQ lD NO: 12 5'-GAA ATA AGC CCA GGC бібліотеки кДНК печінки свині були невдалим. БуTTT GCA GTC RAA-3' базувалися на зворотному ло спробувано 3' RACE, використовуючи таку ж комплементі послідовності кДНК fVIII людини на нк адаптер-зшиту бібліотеку дволанцюгової кДНК, що 5545-5571. PCR-реакційна суміш містила 50мМ використовували для успішного використання для КСl, 10мМ Трис-Сl, рН 9,0, 0,1% Тритон Хклонування 5' закінчення кДНК fVIII свині. Отже, 100,1,5мМ MgCl2, 2,5мМ суміші dNTP, 20мкМ невдача цього способу відбувалася не внаслідок праймерів, 25одиниць/мл полімерази ДНК Taq та відсутності кДНК, відповідної екзону 26. 1/20 об'єму реакційної суміші RT. Умови PCR такі: Спосіб цільової PCR з блукаючим геном [Parkденатурація при 94°С протягом 3 хвилин, далі 30 er, J.D. et al. (1991) Nucleic. Acids. Res. 19:3055циклів денатурації протягом 1 хвилини при 94°С, 3060] використовували для клонування 3' частини гібридизація протягом 2 хвилин при 50°С та продомену С2. Специфічний стосовно свині сенсовий довження протягом 2 хвилин при 72°С. PCRпраймер, SEQ lD NO17 5'продукти фосфорилували, використовуючи кіназу TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (нк 6904-6924) синДНК Т4 та додавали лінкери NotI. Після культивутезували на основі вихідної послідовності домену вання з NotI PCR-фрагменти клонували у сайт NotI С2 та використовували у PCR-реакції з неспецифіBlueScript H KS- та трансформували у клітини XLlчними "блукаючими" праймерами, вибраними з Blue. доступних у лабораторії олігонуклеотидів. PCRПродукт С1-С2 створювали, використовуючи продукти далі таргетували аналізом подовження відому послідовність кДНК людини для синтезу праймерами [Parker et al. (1991) BioTechniques сенсових та антисенсових праймерів, SEQ ED 10:94-101], використовуючи мічену на кінці 32Р NO:13 5'-AGG ААА ТТС САС TGG ААС СТТ N-3' специфічну стосовно внутрішнього праймеру свині (нк 6405-6426) та SEQ lD NO:14 5'-CTG GGG GTG SEQ ID NO:18 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACCААТ TCG AAG GTA GCG N-3' (зворотний компле3' (нк 6932-6952). Цікаво, що з 40 досліджень немент з нк 6966-6990), відповідно. Умови PCR були специфічних праймерів, тільки два дали позитивні ідентичними використовуваним для створення продукти при аналізі подовження праймерами, і ці продукту В-А2 Утворений фрагмент зшивали з два продукти відповідали точній та виродженій вектором клонування pNOT, використовуючи послідовності людини на 3і закінченні домену С2: праймову систему Prime PCR Cloner Cloning SysSEQ ID NO: 19 5'tem (5 Prime-3 Prime, Inc., Boulder, Colorado) та GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (нк 7030вирощували у клітинах JМ109. 7053) та SEQ ID NO:20 5'Плазміди В-А3 та С1-С2 було частково секвеGTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG-3', (нк нсовано для створення специфічних стосовно 7027-7053). Ці праймери спочатку призначили для свині сенсових та антисенсових олігонуклеотидів, отримання продукту звичайною RT-PCR, але вони SEQ lD NO: 15 5'-GAG TTC АТС GGG AAG ACC були невдалими для отримання достатньої кількоTGT TG-3' (нк 4551-4573) та SEQ lD NO:16 5'-ACA сті продукту, яку можна було б візуалізувати зв'яGCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (нк 6541зуванням барвнику броміду етидіуму. Однак, PCR6564), відповідно. Ці олігонуклеотиди використопродукт можна було б ідентифікувати чутливішим вували як праймери для створення RT-PCRспособом подовження праймерами. Цей продукт продукту розміром 2013 по, використовуючи комбуло очищено на гелі та безпосередньо секвенсоплект Clontech Advantage cDNA PCR kit. Цей провано. Ці подовжувало 3' послідовність fVIII свині до дукт, який стосується нк 4551-6564 людини, вклюнк 7026. чає регіон, відповідний активаційному пептиду з Додаткову послідовність отримували аналізом невеликим ланцюгом (нк 5002-5124), домен A3 (нк подовження праймерами ущільненого PCR5125-6114) та більшу частину домену СІ (нк 6115продукту, створеного, використовуючи бібліотеку 6573). Послідовністю клону С1-С2 було встановзшитої з адаптером дволанцюгової кДНК, викорис 25 75064 26 товуваної у протоколі 5'-RACE, описаному перед томіцин, середовище DMEM/F12 та середовище тим. У першому раунді реакції використовували AIM-V отримували від Life Technologies, Inc. Політочний праймер свині SEQ ID NO:21 5'меразу ДНК Taq отримували від Promega. ПолімеCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT-3' (нк 6541разу ДНК Vent отримували від New England Bi6564) та праймер АРІ. У другому раунді реакції olabs. Полімеразу Pftt та фагемід pBlueScript II KSвикористовували SEQ ID NO:22 5отримували від Stratagene. Синтетичні олігонуклеAATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3' (нк 6913-6934) отиди отримували від Life Technologies або Cruaта праймер АР2. Пряме PCR-секвенсування подоchem, Inc. Restriction. Ферменти отримували від вжувало послідовність 3' до закінчення домену С2 New England Biolabs або Promega. 5'(нк 7053). Послідовність домену С2 була унікальфосфориловані праймери використовували, коли ною окрім позиції нк 7045 поблизу 3' закінчення PCR-продукти виготовляли з метою клонування. домену С2. Аналіз повторюваних реакцій PCR дав Нумерація олігонуклеотидів, використовуваних як зчитування A, G або подвійне зчитування A/G на праймери для полімераз-ної ланцюгової реакції цьому сайті. ампліфікації (PCR) кДНК або геномної ДНК fVIII Секвенсування продовжували у 3' UTR, викосвині, використовує кДНК fVIII людини як посиланристовуючи два додаткові праймери, SEQ ID ня [Wood et al. (1984) Nature 312:330-337]. Вектор NO:23 5'-GGA ТСС АСС CCA CGA GCT GG-3' (нк експресії fVIII, позначений як HB-/ReNeo, отриму6977-6996) та SEQ ID NO:24 5'-CGC CCT GAG вали від Biogen, Inc. HB-/ReNeo містить гени резиGCT CGA GGT TCT AGG-3' (нк 7008-7031). Отристентності до ампіциліну та генетицину, а кДНК мували приблизно 15 по послідовності 3і UTR, хоfVIII людини, що втратила повний домен В, познача послідовні на кількох сайтах були неясними. чена як відщеплений фрагмент Ser741-Arg1648, Кілька антисенсових праймерів далі синтезували продукований тромбіном. Для спрощення мутагена основі найкращих оцінок 3' нетрансльованої незу домену С2 кДНК fVIII, який знаходиться на 3' послідовності. Ці праймери включали зворотний закінченні вставки fVIII у ReNeo, у сайт NotI уводикомплемент стоп-кодо ну TGA на їх 3' закінченнях. ли дві основи 3' для стоп-кодону HBT-/ReNeo мутаPCR-продукти отримували з геномної ДНК селезігенезом сплайсингом-частковим перекриванням нки свині та кДНК селезінки свині, що візуалізувапродовження (SOE) {Horton, R.M. et al. (1993) Meли електрофорезом на агарозному гелі та проявthods Enzymol. 217:270-279]. Цей констракт позналенням бромідом етидіуму, використовуючи чено як HB-/ReNeo /Notl. специфічний сенсовий праймер SEQ ID NO: 25 5'Загальну РНК виділяли кислотною екстракцією ААТ CAG GAG ТСС ТСС АСС ССС G-3' (нк 6913з тіоціанатом гуанідінію-фенолом-хлороформом 6934) та антисенсовий праймер 3' UTR, SEQ ID [Chomczyns Μ, P. et al. (1987) AnalBiochem. J, 8: NO:26 5'-CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3'. Для 156-159]. кДНК синтезували з мРНК, використовуотримання достатньої кількості матеріалу з метою ючи зворотну транскриптазу (RT) вірусу Молоні клонування, здійснювали другий раунд PCR, викомишачої лейкемії та випадкові гексамери згідно з ристовуючи ущільнений сенсовий праймер, SEQ інструкціями виробника (First-Strand cDNA SyntheID NO:27 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (нк sis Kit, Pharmacia Biotech). Плазмідну ДНК очища6932-6952) та той же антисенсовий праймер. PCRли, використовуючи комплект Qiagen Plasmid Maxi продукт розміром 141 по клонували у EcoRV-cut Kit (Qiagen, Inc.). Реакції PCR здійснювали, викоpBluescript II KS-. Послідовність трьох клонів, похіристовуючи термоциклер Hybaid OmniGene, викодних від геномної ДНК, та трьох клонів, похідних ристовуючи полімерази ДНК Taq, Vent, або Pfii від кДНК, отримували у обох напрямках. ПослідоPCR-продукти очищали на гелі, осаджували з етавність була безсумнівною окрім позиції нк 7045, де нолу, та вшивали у плазмідну ДНК, використовуюгеномна ДНК була завжди А, а кДНК була завчи лігазу ДНК Т4 (комплект Rapid DNA ligation kit, жди G. Boehringer Mannheim). Плазміди з вмістом вставки Багатократне суміщення послідовностей ДНК використовували для трансформації клітин Е. coli людини, свині, та миші fVIII (Фіг.1А-1Н) EpicureanXLl-Blue. Усі нові послідовності ДНК, Суміщення регіонів А1, А2, A3, С1 та С2 сигстворені, використовуючи PCR, підтверджували нального пептиду здійснювали, використовуючи дидезокси-секвенсуванням, використовуючи секпрограму CLUSTALW [Thompson, J.D. et al. (1994) венсор Applied Biosystems 373 a automated DNA та Nucleic. Acids. Res. 22:4673-680]. Очки гепу відккомплект PRISM dye terminator kit. риття та гепу подовження складали 10 та 0,05, Створення гібридного вектору експресії fVIII. відповідно. Суміщення доменів В людини, миші та HP20, що містить домен С2 свині. свині описано перед тим [Elder et al. (1993) вище]. кДНК fVIII свині, що відповідає 3' закінченню Послідовність А2 людини стосується амінокислот домену С1 та усьому домену С2 клонували у pBlu373-740 у SEQ ID NO:2. Амінокислотну послідовescript за допомогою RT-PCR з загальної РНК сеність А2 свині представляє SEQ lD NO:4, а амінолезінки, використовуючи праймери на основі відокислотну послідовність домену А2 миші представмої послідовності кДНК fVIII свині [Healey, J.F. et al. ляє SEQ lD NO:28, амінокислоти 392-759. (1996) Blood 88:4209-4214]. Цей констракт та HBПриклад 6: Експресія активного рекомбінант/ReNeo використовували як темплати для ствоного фактору VIII свині без домену В (РВ-) рення конденсованрго продукту С1 людини - С2 Матеріали свині у pBlueScript мутагенезом SOE. Фрагмент Доповнену цитратом плазму людини з гемофіС1-С2 у цій плазміді видаляли за допомогою АраІ лією А та нормальну поєднану плазму людини та Notl та вшивали у ApallNotl-cut HB-/ReNeo/Notl отримували від George King Biomedical, Inc. Сиродля виготовлення HP20/ReNeo/Notl. ватку зародка теляти, генетицин, пеніцилін, стрепСтворення гібридного fVIII людини/свині без 27 75064 28 домену В, що містить невеликий ланцюг свині НР22: 100 (HΡ18V)підробка: