Композиція та спосіб лікування раку

Реферат: Винахід належить до моноклонального антитіла, що специфічно зв'язується з позаклітинним доменом DLL4 людини і впливає на ріст пухлин, які містить ракові стовбурові клітини, а також до способу лікування раку, що включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти DLL4. UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь Даний винахід належить до галузі онкології й пропонує нові композиції та способи для діагностики й лікування раку. Даний винахід стосується антитіл проти маркера ракової стволової клітини для діагностики й лікування солідних пухлин. Рівень техніки Рак є найпоширенішою причиною смерті в розвинених країнах, причому більше мільйона людей отримує діагноз рак, і 500000 вмирають на рік тільки у Сполучених Штатах. У цілому визначили, що більш ніж в 1 з 3 осіб розвивається рак протягом життя. Існує більше 200 різних типів раку, чотири з яких - рак молочної залози, легені, ободової й прямої кишки і передміхурової залози - служить причиною більше половини всіх нових випадків (Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26). Рак молочної залози є найпоширенішим у жінок, при цьому 12 % жінок оцінюють як схильних до ризику розвитку захворювання протягом життя. Хоча рівень смертності зменшився завдяки ранішій детекції й покращуваним способам лікування, рак молочної залози залишається провідною причиною смерті у жінок середніх років, і метастазуючий рак молочної залози досі є невиліковним захворюванням. При його прояві більшість пацієнтів з метастазуючим раком молочної залози мають лише одну або дві уражені системи органів, проте при прогресі захворювання зазвичай безліч ділянок стають ураженими. Найбільш поширеними ділянками метастатичного ураження є місцеві рецидиви на шкірі і в м'яких тканинах стінки грудної клітини, так само як у пахвовій западині й надключичних ділянках. Найбільш поширеною ділянкою віддаленого метастазування є кістка (30-40 % віддаленого метастазування), потім легені й печінка. І хоча лише приблизно 1-5 % жінок з уперше діагностованим раком молочної залози мають віддалене метастазування на час діагнозу, приблизно у 50 % пацієнтів з місцевим захворюванням, кінець кінцем, відбувається рецидив з метастазуванням протягом п'яти років. У даний час медіана виживаності від прояву віддаленого метастазування складає приблизно три роки. Сучасні способи діагностики й визначення стадії раку молочної залози включають систему пухлина-вузол-метастаз (TNM), засновану на розмірі пухлини, наявності пухлини в лімфатичних вузлах і наявності віддаленого метастазування (American Joint Committee on Cancer: AJCC Cancer Staging Manual. Philadelphia, Ра.: Lippincott-Raven Publishers, 5th ed., 1997, pp 171-180; Harris, J. R.: "Staging of breast carcinoma" in Harris, J. R., Hellman, S.; Henderson, I. C, Kinne D. W. (eds.): Breast Diseases. Philadelphia, Lippincott, 1991). Ці параметри використовують для визначення прогнозу й вибору відповідної терапії. Морфологічні ознаки пухлини також можна оцінювати, проте, оскільки пухлини зі схожими гістопатологічними ознаками можуть мати значну клінічну мінливість, цей спосіб має серйозні обмеження. Нарешті, аналізи маркерів поверхні клітин можна використовувати для розділення певних пухлин на підкласи. Наприклад, одним з чинників, що враховується при прогнозуванні й лікуванні раку молочної залози, є наявність рецептора естрогенів (ER), оскільки ER-позитивні типи раку молочної залози, як правило, відповідають більш повно на гормональні лікарські засоби, як-от: тамоксифен або інгібітори ароматази, ніж ER-негативні пухлини. Досі аналізи, хоча і є корисними, є лише частково такими, що їх можна передбачити, для клінічної поведінки пухлин молочної залози, та існує велика фенотипова різноманітність, наявна в типах раку молочної залози, яку неможливо детектувати сучасними діагностичними засобами й неможливо лікувати сучасними видами терапії. Рак передміхурової залози є найбільш поширеним раком у чоловіків у розвинених країнах, що становить, як оцінюють, 33 % від всіх нових випадків раку в США, і є другою з найбільш частих причин смерті (Jemal et al., 2003, CA Cancer J. Clin. 53:5-26). Після введення аналізу крові на специфічний антиген простати (PSA) рання детекція раку передміхурової залози надзвичайно поліпшила рівні виживаності; рівень п'ятирічної виживаності пацієнтів з місцевою і регіонарною стадією раку передміхурової залози на час діагностики складає близько 100 %. Проте в більше 50 % пацієнтів кінець кінцем розвиватиметься місцево поширене або метастазуюче захворювання (Muthuramalingam et al., 2004, Clin. Oncol. 16:505-16). В даний час радикальна простатектомія й радіотерапія забезпечують радикальне лікування для більшості локалізованих пухлин передміхурової залози. Проте терапевтичні можливості дуже обмежені для запущених захворювань. У разі метастазуючого захворювання видалення андрогену за допомогою агоністу гормону, що вивільняє лютеїнізуючий гормон (LHRH), окремо або в поєднанні з антиандрогенами, є загальноприйнятим лікуванням. Проте, попри максимальну блокаду андрогенів, захворювання майже завжди прогресує з розвитком у більшості незалежного захворювання. В даний час не існує єдиного прийнятого лікування для стійкого до гормонів раку передміхурової залози, й загальноприйнятими є режими хіміотерапій 1 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (Muthuramalingam et al., 2004, Clin. Oncol. 16:505-16; Trojan et al., 2005, Anticancer Res. 25:55161). Рак ободової й прямої кишки є третім з найбільш поширених видів раку і четвертою з найбільш частих причин смерті від раку в усьому світі (Weitz et al., 2005, Lancet 365:153-65). Приблизно 5-10 % від всіх типів раку ободової й прямої кишки є спадковими, де однією з основних форм є родинний аденоматозний поліпоз (FAP), аутосомно-домінантне захворювання, при якому приблизно 80 % уражених індивідуумів несуть зародкову мутацію в гені аденоматозного поліпозу кишечнику (APC). Колоректальні карциноми поширюються локально за допомогою периферичного зростання і в інших місцях за допомогою лімфатичного, гематогенного, черезчеревинного і периневрального поширення. Найбільш поширеною ділянкою екстралімфатичного ураження є печінка, причому легені є найбільш часто ураженим екстраабдомінальним органом. Інші ділянки гематогенного поширення включають кістки, нирки, надниркові залози й мозок. Сучасна система визначення стадій для раку ободової й прямої кишки заснована на ступені проникнення пухлини через стінку кишечнику й наявності або відсутності ураження лімфатичних вузлів. Цю систему визначення стадій визначають по трьох головних класифікаціях Дюка: захворювання A за Дюком обмежене підслизовими шарами ободової або прямої кишки; захворювання B за Дюком має пухлини, які проникають через власну мускулатуру ободової або прямої кишки й можуть проникати через стінку ободової або прямої кишки; і захворювання C за Дюком включає будь-який ступінь інвазії стінки кишечнику з метастазуванням регіонарного лімфатичного вузла. Тоді як хірургічне видалення є високоефективним для ранніх стадій раку ободової й прямої кишки, забезпечуючи показники ефективності лікування 95 % для пацієнтів із захворюванням A за Дюком, показник знижується до 75 % для пацієнтів із захворюванням B за Дюком, а при наявності позитивного лімфатичного вузла при захворюванні C за Дюком передбачають 60 % вірогідність рецидиву протягом п'яти років. Лікування пацієнтів із захворюванням C за Дюком за допомогою післяопераційного курсу хіміотерапії знижує частоту рецидиву до 40-50 % і в даний час є стандартом лікування для цих пацієнтів. Рак легені є найбільш поширеним раком у всьому світі, третім з типів раку, що найчастіше діагностуються в Сполучених Штатах, і, поза сумнівом, найбільш частою причиною смерті від раку (Spiro et al., 2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166: 1166-96; Jemal et al., 2003, CA Cancer J. CHn. 53:5-26). Вважають, що паління цигарок є відповідальним за приблизно 87 % всіх типів раку легені, що робить їх найбільш смертельними із захворювань, що їм запобігають. Рак легені розділяють на два головних типи, які складають більше 90 % всіх типів раку легені: дрібноклітинний рак легені (SCLC) і недрібноклітинний рак легені (NSCLC). SCLC складає 1520 % випадків і характеризується його виникненням у великих центральних дихальних шляхах і гістологічним складом з шарів дрібних клітин з невеликою кількістю цитоплазми. SCLC є активнішим, ніж NSCLC, швидко зростаючим і рано метастазуючим. NSCLC складає 80-85 % від всіх випадків, і його додатково розділяють на три головні підтипи на підставі гістології: аденокарцинома, плоскоклітинна карцинома (епідермоїдна карцинома) і великоклітинна недиференційована карцинома. Рак легені, як правило, виявляється пізно в його перебігу й, таким чином, має медіану виживаності лише 6-12 місяців після діагнозу, і загальний рівень 5-річної виживаності складає лише 5-10 %. Хоча хірургія надає найкращий шанс на лікування, вона застосовна лише для невеликої частини пацієнтів з раком легені, причому більшість покладається на хіміотерапію й радіотерапію. Попри спроби варіювати час і інтенсивність дози цих видів терапії, рівні виживаності лише трохи збільшилися за останніх 15 років (Spiro et al., 2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166:1166-96). Ці чотири типи раку, так само як багато інших, виявляються як солідні пухлини, що складаються з гетерогенних популяцій клітин. Наприклад, при раку молочної залози наявна суміш ракових клітин і нормальних клітин, включаючи мезенхімальні (стромальні) клітини, запальні клітини, й ендотеліальні клітини. Декілька моделей раку надають різні пояснення наявності цієї гетерогенності. Одна модель, класична модель раку, передбачає, що всі фенотипово різні популяції клітин мають здатність проліферувати й давати початок нової пухлини. В класичній моделі гетерогенність клітин пухлини є результатом зовнішніх чинників, так само як безперервних мутацій у ракових клітинах, що приводить до різноманітної популяції клітин, що викликають утворення пухлини. Ця модель заснована на ідеї, що всі популяції пухлинних клітин до певної міри мають потенціал до утворення пухлини. (Pandis et al., 1998, Genes, Chromosomes & Cancer 12:122-129; Kuukasjrvi et al., 1997, Cancer Res. 57:1597-1604; Bonsing et al., 1993, Cancer 71:382-391; Bonsing et al., 2000, Genes Chromosomes & Cancer 82: 2 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 173-183; Beerman H et al., 1991, Cytometry 12:147-54; Aubele M & Werner M, 1999, Analyt. Cell. Path. 19:53; Shen L et al., 2000, Cancer Res. 60:3884). Альтернативна модель для спостережуваної гетерогенності клітин солідної пухлини витікає з внеску стволових клітин у розвиток пухлини. Згідно з цією моделлю рак виникає в результаті порушення регуляції механізмів, контролюючих нормальний розвиток і підтримку тканин. (Beachy et al., 2004, Nature 432:324). Під час нормального розвитку тварини клітини більшості або всіх тканин походять з нормальних попередників, називаних стволовими клітинами (Morrison et al., 1997, Cell 88:287-98; Morrison et al., 1997, Curr. Opin. Immunol. 9:216-21; Morrison et al., 1995, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11:35-71). Стволовими клітинами є клітини, які: (1) мають надлишкову здатність до проліферації; 2) здатні до асиметричного ділення клітин з утворенням одного або декількох видів потомства зі зниженою здатністю до проліферації й розвитку; і (3) здатні до симетричних ділень клітин для самооновлення або самопідтримки. Найбільш добре вивченим прикладом оновлення дорослих клітин за допомогою диференціювання стволових клітин є гематопоетична система, де незрілі за розвитком попередники (гематопоетичні стволові клітини й клітини-попередники) відповідають на молекулярні сигнали з утворенням різних типів клітин крові і лімфоїдних клітин. Інші клітини, включаючи клітини кишечнику, системи проток молочної залози і шкіри, постійно поповнюються з невеликої популяції стволових клітин у кожній тканині, й нещодавні дослідження дозволяють передбачати, що більшість інших дорослих тканин також несуть стволові клітини, включаючи мозок. Пухлини, що походять зі "стволової клітини солідної пухлини" (або "ракової стволової клітини" з солідної пухлини), потім піддаються хаотичному розвитку за допомогою циклів як симетричного, так і асиметричного ділення клітин. У цій моделі стволових клітин солідні пухлини містять окрему й обмежену (можливо, навіть рідку) підгрупу клітин, які мають загальні властивості з нормальними "стволовими клітинами", в тому що вони інтенсивно проліферують і ефективно дають початок як додатковим стволовим клітинам солідної пухлини (самооновлення), так і більшості пухлинних клітин солідної пухлини, в яких відсутній потенціал до утворення пухлини. Дійсно, мутації всередині довгоживучої популяції стволових клітин можуть викликати формування ракових стволових клітин, які лежать в основі зростання і підтримки пухлин і наявність яких робить внесок у невдачу сучасних терапевтичних способів. Походження раку зі стволових клітин уперше виявили для раку крові, гострого мієлоїдного лейкозу (AML) (Lapidot et al., 1994, Nature 17:645-8). Пізніше показали, що злоякісні пухлини молочної залози й ободової кишки людини так само містять невелику, окрему популяцію ракових стволових клітин, збагачених за здатністю формувати пухлини у мишей з імунодефіцитом. Виявили, що популяція клітин ESA+, CD44+, CD24-/низький, Lin- у пухлинах молочної залози є в 50 разів збагаченою клітинами, що викликають утворення пухлини, в порівнянні з нефракціонованими пухлинними клітинами (Al-Hajj et al., 2003, Proa Nat'l Acad. Sci. 100:3983-8). Так само виявили, що субпопуляція ESA+, CD44+ в пухлинах ободової і прямої кишки містить єдино викликаючі утворення пухлини клітини, і додавання CD166 до цього профілю дозволяє додаткове збагачення по стволових клітинах раку ободової кишки (COCSC) (Dalerba et al. 2007 Proc Nat 7 Acad Sci 104:10158-63). Можливість у перспективі виділяти викликаючі утворення пухлини ракові клітини дозволяє дослідження критичних біологічних шляхів, що лежать в основі здатності цих клітин утворювати пухлини, й, таким чином, обіцяє розвиток кращих діагностичних аналізів і лікарських засобів для пацієнтів з раком. Це наближає до мети, на яку спрямовано цей винахід. КОРОТКИЙ ВИКЛАД Представлені антитіла, які специфічно зв'язуються з епітопом дельта-подібного ліганду 4 (DLL4) людини, сформованої поєднанням N-кінцевої ділянки DLL4 людини (SEQ ID NO: 27) і домену DSL людини (SEQ ID NO: 26), де антитіло впливає на зростання пухлини. Представлена також фармацевтична композиція, що містить антитіло за даним винаходом і фармацевтично прийнятний носій. Крім того, представлений спосіб лікування раку, що включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла анти-DLL4 за даним описом. Додаткові об'єкти й переваги винаходу частково будуть описані в подальшому описі й частково будуть очевидними з опису, або про них можна буде дізнатися з практичного здійснення винаходу. Об'єкти й переваги винаходу можна здійснити й отримати за допомогою елементів і поєднань, зокрема, вказаних у доданій формулі винаходу. Слід розуміти, що як наведений вище загальний опис, так і подальший детальний опис є лише зразковими і роз'яснювальними й не є такими, що обмежують винахід, як зазначено в формулі винаходу. Додані креслення, включені в цей опис і складають його частину, ілюструють декілька варіантів здійснення винаходу і, разом з описом, служать для пояснення принципів винаходу. В описі і 3 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 доданій формулі винаходу форми однини включають посилання на множину, якщо контекст явно не вимагає іншого. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР Фігура 1: Специфічне зв'язування антитіл 21M18 анти-DLL4 з нативним білком поверхні клітин DLL4. Клітини HEK 293, трансфіковані спільно повнорозмірним DLL4 і GFP, інкубували з антитілами проти DLL4 і сортували за допомогою FACS. Для антитіл проти DLL4 21M14 і 21M18 показали специфічне зв'язування з клітинами, експресуючими DLL4, як видно за лінійним взаємозв'язком між зв'язуванням антитіла анти-DLL4 й експресії GFP. Фігура 2: Антитіла проти DLL4 блокують взаємодію DLL4 людини з рецептором Notch. A) Клітини HEK 293, експресуючі DLL4, інкубували з Notch-Fc або контрольним білком Fc за наявності антитіл анти- DLL4 або контрольних антитіл. Висока інтенсивність флуоресценції вказує на наявність зв'язування Notch і DLL4 за наявності контрольного антитіла (лінія 2) і антитіл 21M12 анти-DLL4 (лінія 5). Низька інтенсивність флуоресценції вказує на відсутність взаємодій Notch і DLL4 за відсутності Notch (лінія 1) і порушення взаємодій Notch і DLL4 за наявності антитіл анти-DLL4 21M18 (лінія 3) і 21M14 (лінія 4). B) Клітини HEK 293, експресуючі Notch 1, інкубували з DLL4-Fc або людини, або миші. Зв'язування детектували за допомогою флуоресцентно мічених анти-Fc і аналізували за допомогою FACS, де висока інтенсивність флуоресценції є показовою для зв'язування між DLL4 і клітинами, експресуючими Notch1. 21M18 блокує зв'язування DLL4 людини (сірі квадрати), але не DLL4 миші (чорні круги) з рецептором Notch. Фігура 3: Картування епітопів антитіл анти-DLL4. A) Злиті білки з вкладеними делеціями позаклітинного домену DLL4 людини інкубували в аналізі ELISA з антитілами антих-DLL4 21M14 і 21M18. Не виявили зв'язування вище фонового у наявності злитих білків, що містять амінокислоти між 1 і 154 (ак 1-96, білий стовпець з чорними крапками; ак 1-154, чорний стовпець з білими крапками). На відміну від цього, детектували зв'язування між антитілами анти-DLL4 і всіма злитими білками, що містять амінокислоти між 1 і 217, включаючи домен DSL, з DLL4 (ак 1-217, стовпець з горизонтальними смугами; ак 1-251, стовпець з діагональними смугами; ак 1283, заштрихований стовпець; ак 1-323, сірий стовпець з білими крапками). B) На Вестернблотах показали експресію білків DLL4 людини (h-DLL4) з C-кінцевими делеціями й химерних злитих білків мишачий-людський DLL4 (анти-hFc; верх). Злиті білки з DLL4 містять один або декілька з доменів 1-6, де домени 1 і 2 є N-кінцевими амінокислотами 1-154; домен 3 є доменом DSL від амінокислоти 155 до 217; і кожен з доменів 4, 5 і 6 є доменом EGF, як графічно змальовано на C. Антитіла 21M18 впізнають білок h-DLL4 лише за наявності амінокислот 1-217 (hDLL4домен1-3). На відміну від білка людини 21M18 не впізнає злиті білки (m-DLL4 домен1-3:hDLL4домен4-6), містять амінокислоти 1-217 (домен1-3) DLL4 миші (m-DLL4). 21M18 ще впізнає злиті білки, які містять амінокислоти 1-154 h-DLL4 (домен1-2) за наявності домену3 миші (hDLL4 домен1-2:mDLL4домен3-6). C) Показано схематичне узагальнення даних зв'язування. Зверху показана доменна структура DLL4 зі злитими білками, з DLL4, перерахованими і показаними схематично ліворуч, де білок людини представлений світло-сірим, а білок миші представлений темно-сірим. Зв'язування 21M18 з кожним фрагментом DLL4 відмічене "+" у зіставленні з "-". D) Аналіз ELISA зв'язування 21M18 із фрагментами білка DLL4, що містять заміну відповідних мишачих залишків на людські залишки у вибраних положеннях. Для 21M18 показали порушене зв'язування з фрагментами білка DLL4 із замінами амінокислот 68, 69 і 71 (заміна валіну, валіну і проліну) або амінокислот 142 і 144 (заміна лізину й аланіну). E) Аналіз ELISA зв'язування антитіл 21M18 і 21M21 з фрагментами білка DLL4, що містять заміну відповідних мишачих залишків на людські залишки у вибраних положеннях усередині домену DSL. Для антитіла 21M21 показали порушене зв'язування з фрагментами білка DLL4 людини, що містять амінокислотні заміни амінокислот 161 і 162 (заміна треоніну й серину). Оскільки 21M21 не порушує функцію DLL4 в аналізах передачі сигналу (див. фігуру 6), це показує, що не всі антитіла, що зв'язуються з ділянкою DSL, впливають на функцію DLL4. Фігура 4: Вирівнювання послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга. A) Показані вихідна послідовність антитіла миші 21M18 (m-21M18-Vh, зверху), людська експресована каркасна послідовність (h-EST-каркас, всередині) і послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга гуманізованого 21M18 (21M18-H7, знизу) з консервативними амінокислотними залишками, забарвленими чорним. Відмічені три CDR, що показує збереження вихідних мишачих послідовностей у гуманізованому антитілі 21M18. Залишок цистеїну в положенні 52a за Kabat у CDR2 замінений на залишок серину й валіну без втрати специфічного зв'язування з Dll4 в 21M18 H7 і 21M18 H9, відповідно. Заміни всередині каркасної ділянки, показані на 4A, пронумеровані 1-6 з відповідними положеннями за Kabat у положеннях 16, 20, 27, 28, 38, 48 у ланцюзі Vh. B) Показані вихідна послідовність антитіла 21M18 миші (m-21M18-Vh, зверху), 4 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовність Vh зародкової лінії людини (h-зародкова-Vh, в середині) і послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга гуманізованого 21M18 (21M18-H2, знизу) з консервативними амінокислотними залишками, забарвленими чорним. Відмічені три CDR, що показує збереження вихідних мишачих послідовностей у гуманізованому антитілі 21M18. Залишок цистеїну в положенні 52a за Kabat у CDR2 замінений на залишок серину й валіну без утрати специфічного зв'язування з Dll4 в 21M18 H7 і 21M18 H9, відповідно. П'ять збережених мишачих залишків усередині варіабельної каркасної ділянки всіх варіантів важкого ланцюга пронумеровані 1-5 у відповідних їм положеннях за Kabat 20, 28, 38, 48 і 69. Фігура 5: Вирівнювання послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга. Показані вихідна послідовність антитіла миші 21M18 (m-21M18-Vk, зверху), послідовність зародкової лінії людини (h-зародкова Vk, знизу) і послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга гуманізованого 21M18 (21M18-L2, всередині) з консервативними амінокислотними залишками, забарвленими чорним. Відмічені три CDR, що показує збереження вихідних мишачих послідовностей у гуманізованому антитілі 21M18. Два збережені мишачі залишки всередині варіабельної каркасної ділянки пронумеровані 1-2 у відповідних їм положенням за Kabat 22 і 36. Фігура 6: Антитіла анти-DLL4 блокують передачу сигналу Notch. Клітини HeLa, трансфіковані спільно векторами з репортером Hes1-Luc і з репортером люциферази Renilla, інкубували з білком DLL4-Fc за наявності або відсутності антитіл анти-DLL4. Знижені рівні люциферази показують послаблення активації DLL4 шляху Notch за допомогою антитіл 21M14 і 21M18. Фігура 7: Антитіла анти-DLL4 модулюють експресію генів-мішеней для Notch у пухлинах ободової кишки. A) Виділяли пухлини ободової кишки C8, оброблені антитілами 21M18 антиDLL4 або PBS (Контроль), і визначали експресію HES1 і ATOH-1 за допомогою кількісної RTПЦР. Відносна експресія гена (γ-вісь) у порівнянні з клітинами після контрольної обробки показує, що обробка антитілами анти-DLL4 зменшувала експресію HES1 і збільшувала експресію ATOH-1. B) Показано співвідношення відносної експресії (γ-вісь) HES1 відносно ATOH1 в колоніях лінійно виснажених клітин пухлини ободової кишки OMP-C11 миші. Для колоній C11, покритих клітинами 3T3 з надекспресією DLL4 (3T3+DLL4), показали збільшення співвідношення експресії HES1/ATOH1 в порівнянні з клітинами ободової кишки, покритих клітинами 3T3 (3T3) або що не піддавалися дії покривного шару клітин (Контроль). Це збільшення співвідношення експресії HES1/ATOH1 припиняли за допомогою інкубації з 10 мкг/мл антитіл 21M18 (21M18) або з 5 мкМ інгібітором секретази DBZ (5 мкМ GSI). Фігура 8: Антитіла анти-DLL4 зменшують зростання пухлини. Мишам NOD/SCID вводили ін'єкції дисоційованих клітин UM-C4 і обробляли їх антитілами 21M18 анти-DLL4 (n=5) або PBS (n=10). Обробка антитілами 21M18 (ромби) зменшувала зростання пухлини, починаючи з доби 23, і зменшення аж до 54 % спостерігали на добу 48 у порівнянні з контролями після ін'єкції PBS (чорні квадрати). Фігура 9: Обробка антитілами анти-DLL4 знижує кількість проліферуючих пухлинних клітин in vivo. Виділяли пухлини ободової кишки C8, оброблені антитілами 21M18 анти-DLL4 або контрольними Ab. Імуногістохімічно за допомогою антитіла проти Ki67 показали зниження кількості проліферуючих клітин у пухлинах, оброблених 21M18, у порівнянні з контролем. Фігура 10: Обробка антитілами анти-DLL4 у поєднанні з фторурацилом (5-FU) зменшує зростання пухлини. Мишам NOD/SCID уводили ін'єкції дисоційованих клітин UM-C4, і обробляли їх антитілами анти-DLL4 або PBS за наявності або за відсутності 5-FU. A) Обробка антитілами 21M18 у поєднанні з 5-FU (круги, штрихова лінія) зменшувала зростання пухлини через 46 діб після ін'єкції пухлинних клітин більшою мірою, ніж обробка або 5-FU (трикутники, суцільна лінія), або антитілами 21M18 (ромби, пунктирна лінія) окремо, й більшою мірою, ніж у контролях після 3 ін'єкції PBS (квадрати, суцільна лінія). Об'єм пухлини в мм вказаний на γ-осі. B) Графіки вимірювань пухлини індивідуальних тварин на добу 46. Кожна крапка представляє одну 3 тварину. Кожна з обробок антитілами 21M18 або 5-FU зменшувала розмір пухлини (мм ) у порівнянні з контролем. Більш того, комбінована обробка антитілами 21M18 і 5-FU мала адитивний ефект, знижуючи розмір пухлини до 1/5 розміру контролю. Фігура 11: Обробка антитілами анти-DLL4 у поєднанні з антитілами проти EGFR зменшує зростання пухлини. Мишам NOD/SCDD уводили ін'єкції дисоційованих клітин UM-C4, і обробляли їх антитілами анти-DLL4 або PBS за наявності або відсутності антитіл проти EGFR. Показані графіки вимірювань пухлин індивідуальних тварин на добу 46. Кожна крапка представляє одну тварину. Кожна з обробок антитілами 21M18 або антитілами проти EGFR 3 зменшувала розмір пухлини (мм ) в порівнянні з контролем. Більш того, комбінована обробка антитілами 21M18 і антитілами проти EGFR мала адитивний ефект, знижуючи розмір пухлини до менш ніж 1/5 від розміру контролю. 5 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 12: mAb 21M18 анти-DLL4 й іринотекан діють синергічно для інгібування зростання пухлини ободової кишки. Мишам NOD/SCID уводили ін'єкції дисоційованих клітин C8, і обробляли їх антитілами анти-DLL4 або контрольного антитіла за наявності або за відсутності іринотекану. A) Кожна з обробок антитілами 21M18 миші (круги) або іринотеканом (трикутники) 3 окремо зменшувала об'єм пухлини (γ-вісь, мм ) у порівнянні з тваринами після контрольної обробки (чорні квадрати). Проте комбіноване лікування 21M18 й іринотеканом (перегорнуті трикутники) мало синергетичний ефект, повністю припиняючи зростання пухлини аж до 55 діб після ін'єкції клітин. B) Обробка гуманізованим 21M18 (h21M18) у поєднанні з іринотеканом (irtcn) (круги) мала ефективність, схожу з ефективністю мишачого 21M18 (m21M18) (трикутники) в порівнянні з контрольним антитілом (чорні квадрати) або контрольним антитілом з іринотеканом (трикутники). Фігура 13: Комбінована обробка анти-DLL4 21M18 й іринотеканом запобігає повторному зростанню пухлини ободової кишки. Мишам NOD/SCID вводили ін'єкції дисоційованих клітин C8, і обробляли їх іринотеканом або іринотеканом у поєднанні з антитілами 21M18 анти-DLL4 (n=10 на групу). A) Обробка одним іринотеканом уповільнювала зростання пухлини, проте зростання тривало після припинення лікування на добу 56 (* стрілка) в усіх, окрім двох тварин після лікування. B) На відміну від цього, обробка поєднанням іринотекану й антитіл 21M18 анти-DLL4 припиняла зростання пухлини ободової кишки як під час лікування, так і протягом аж до п'яти тижнів після припинення лікування на добу 56 у всіх десяти тварин після лікування. Кожна лінія представляє криву зростання для індивідуальної тварини. Фігура 14: Комбінована обробка анти-DLL4 21M18 й іринотеканом інгібує зростання пухлин ободової кишки, що прижилися, ефективніше, ніж обробка монотерапією. Мишам NOD/SCID уводили ін'єкції дисоційованих клітин C8 і обробляли їх антитілами анти-DLL4 або контрольного антитіла за наявності або відсутності іринотекану. Кожна з обробок антитілами 21M18 (ромби) 3 або іринотеканом (трикутники) окремо зменшувала об'єм пухлини (γ-вісь, мм ) в порівнянні з тваринами після контрольної обробки (чорні квадрати). Проте комбінована обробка 21M18 плюс іринотекан (перегорнуті трикутники) інгібувала зростання пухлини ефективніше, ніж обробка або 21M18, або іринотеканом окремо. Фігура 15: Для пухлин, оброблених антитілами анти-DLL4, показали знижену кількість клітин, що викликають утворення пухлин. Мишам з імунною недостатністю (n=10 на групу) вводили ін'єкції зменшуваних доз пухлинних клітин з експерименту, показаного на фігурі 14, які обробляли контрольним антитілом, іринотеканом плюс контрольне антитіло, лише антитілами 21M18 анти-DLL4, або поєднанням антитіл анти-DLL4 21M18 й іринотекану (Поєднання). A) 3 Результати для частоти придбання пухлин на добу 81. Об'єм пухлини (мм ) наносили на графік у порівнянні з кількістю ін'єктованих клітин пухлини людини: 900, 300, 100 і 50 для кожної групи обробки. Кількість тварин з пухлинами, що піддаються детекції, з десяти тварин після ін'єкції для кожної дози пухлинних клітин записано під графіком об'єму пухлини для кожної дози клітин, де пухлинні клітини після контрольної обробки - ліворуч (забарвлені круги), оброблені антитілом 21M18 анти-DLL4 пухлинні клітини - другі ліворуч (незабарвлені квадрати), оброблені іринотеканом пухлинні клітини - другі праворуч (забарвлені трикутники), й пухлинні клітини після комбінованої обробки - праворуч (незабарвлені круги). B) Підраховували частоту стволових клітин на добу 81. Частка ракових стволових клітин (γ-вісь) від контрольної обробки (ліворуч) у порівнянні з пухлинними клітинами, обробленими анти-DLL4 (другі ліворуч), обробленими лише іринотеканом (другі праворуч) і після комбінованої обробки (праворуч), нанесена на графік з 95 % довірчим інтервалом. Група після обробки анти-DLL4 має статистично значиму різницю в порівнянні з контрольною групою (*), і комбінована група значимо відрізняється як від контрольної групи (*), так і від групи одного іринотекану (**). Фігура 16: Комбінована обробка анти-DLL4 21M18 й іринотеканом затримує рецидив пухлини. Мишам з імунною недостатністю вводили ін'єкції дисоційованих клітин C8, і пухлини, 3 що прижилися, приблизно 150 мм обробляли поєднанням іринотекану (45 мг/кг, дозування двічі на тиждень) або з антитілами 21M18 анти-DLL4, або з контрольними антитілами протягом 32 діб, після чого обробку іринотеканом припиняли. Обробку або контрольним антитілом, або 21M18 продовжували. Повторне виникнення пухлин за об'ємом пухлин (γ-вісь) затримувалося в оброблених 21M18 тварин (трикутники) в порівнянні з контрольними (круги). Фігура 17: Комбінована обробка анти-DLL4 21M18 і іринотеканом затримує рецидив пухлини. Показані індивідуальні тварини з експерименту, показаного на фігурі 16. Показаний загальний об'єм пухлини (γ-вісь) у кожної тварини через 47 діб після припинення обробки іринотеканом. Фігура 18: Поєднання анти-DLL4 21M18 і анти-VEGF зменшує зростання пухлини. Імплантували пухлинні клітини C17 і через дві доби починали обробку контрольним антитілом (чорні квадрати, суцільна лінія), 21M18 (трикутники, штрихова лінія), анти-VEGF (ромби, 6 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 суцільна лінія) або поєднанням обох антитіл (круги, пунктирна лінія). Кожне антитіло дозували при 10 мг/кг, вводили двічі на тиждень, і були присутні по 10 тварин на групу. Як 21M18, так і анти-VEGF знижували зростання пухлини, й поєднання було ефективнішим, ніж будь-яке окреме антитіло. ОПИС ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ Термін "антитіло" використовують на позначення молекули імуноглобуліну, який розпізнає і специфічно зв'язує мішень, як-от: білок, поліпептид, пептид, вуглевод, полінуклеотид, ліпід або поєднання вищезгаданого, за допомогою щонайменше однієї ділянки впізнавання антигену всередині варіабельної ділянки молекули імуноглобуліну. В конкретних варіантах здійснення антитіла за даним винаходом включають антитіла-антагоністи, які специфічно зв'язують маркерний білок ракової стволової клітини і заважають, наприклад, зв'язуванню ліганду, димеризації рецептора, експресії маркерного білка ракової стволової клітини та/або нижчій передачі сигналу маркерним білком ракової стволової клітини. В конкретних варіантах здійснення описані антитіла включають антитіла-агоністи, які специфічно зв'язують маркерний білок ракової стволової клітини і сприяють, наприклад, зв'язуванню ліганду, димеризації рецептору й/або передачі сигналу маркерним білком ракової стволової клітини. В конкретних варіантах здійснення описані антитіла не перешкоджають або не сприяють біологічній активності маркерного білка ракової стволової клітини, проте інгібують зростання пухлини за допомогою, наприклад, інтерналізації та/або розпізнавання імунною системою антитіла. Як застосовують тут, термін "антитіло" охоплює інтактні поліклональні антитіла, інтактні моноклональні антитіла, фрагменти антитіл (такі як фрагменти Fab, Fab', F(ab')2 і Fv), одноланцюгові мутанти Fv (scFv), мультиспецифічні антитіла, такі як біспецифічні антитіла, отримані, щонайменше, з двох інтактних антитіл, химерні антитіла, гуманізовані антитіла, антитіла людини, злиті білки, що містять частину антитіла, яка впізнає антиген, і будь-яку іншу модифіковану молекулу імуноглобуліну, що містить ділянку впізнавання антигену, поки антитіла мають бажано біологічну активність. Антитіло може належати до будь-якого з п'яти головних класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, або їх підкласів (ізотипів) (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2), основаних на ідентичності константних доменів їх важких ланцюгів, що позначаються альфа, дельта, епсилон, гамма і мю відповідно. Різні класи імуноглобулінів мають різні й добре відомі субодиничні структури й тривимірні конфігурації. Антитіла можуть бути голими або кон'югованими з іншими молекулами, такими як токсини, радіоактивні ізотопи тощо. Як застосовують тут, термін "фрагмент антитіла" стосується частини інтактного антитіла і стосуються варіабельних ділянок інтактного антитіла, які впізнають антиген. Приклади фрагментів антитіл включають як необмежуючі приклади фрагменти Fab, Fab', F(ab')2 і Fv, лінійні антитіла, одноланцюгові антитіла й мультиспецифічні антитіла, сформовані із фрагментів антитіл. "Fv антитіло" стосується мінімального фрагмента антитіла, що містить повну ділянку впізнавання й зв'язування антигену або у вигляді двох ланцюгів, у яких варіабельний домен одного важкого й одного легкого ланцюга формують нековалентний димер, або у вигляді одного ланцюга (scFv), в якому варіабельний домен одного важкого й одного легкого ланцюга ковалентно зв'язані гнучким пептидним лінкером, так що два ланцюги сполучено в подібну димерну структуру. В цій конфігурації визначальні комплементарність ділянки (CDR) кожного варіабельного домену взаємодіють для визначення антигенсполучної специфічності димеру Fv. Альтернативно один варіабельний домен (або половину з Fv) можна використовувати для впізнавання й зв'язування антигену, хоча, як правило, з нижчою афінністю. "Моноклональне антитіло", як застосовують тут, стосується гомогенної популяції антитіл, залучених у високоспецифічне впізнавання і зв'язування однієї антигенної детермінанти, або епітопу. В цьому їх відмінність від поліклональних антитіл, які, як правило, включають різні антитіла, спрямовані проти різних антигенних детермінант. Термін "моноклональне антитіло" охоплює як інтактні, так і повнорозмірні моноклональні антитіла, так само як фрагменти антитіл (такі як Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноланцюгові мутанти (scFv), злиті білки, містять частину антитіла, й будь-яку іншу модифіковану молекулу імуноглобуліну, що містить ділянку впізнавання антигену. Більш того, "моноклональне антитіло" стосується таких антитіл, отриманих будь-якою кількістю способів, включаючи, як необмежуючі приклади, гібридому, фаговий відбір, рекомбінантну експресію й трансгенних тварин. Як застосовують тут, термін "гуманізоване антитіло" стосується форм антитіл, що не належать людині (наприклад, мишачих), які є специфічними ланцюгами імуноглобулінів, химерними імуноглобулінами або їх фрагментами, що містять мінімальні послідовності, що не належать людині. Як правило, гуманізованими антитілами є імуноглобуліни людини, в яких залишки з визначальних компліментарність ділянок (CDR) усередині ділянки впізнавання 7 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антигену (або гіперваріабельної ділянки) з варіабельної ділянки ланцюга або ланцюгів антитіла замінені залишками з CDR видів, що не стосуються людини (наприклад, миші, щура, кроля, хом'яка), що має бажану специфічність, афінність та ємкість. У деяких випадках залишки каркасної ділянки (FR) варіабельного ланцюга імуноглобуліну людини замінені відповідними залишками антитіла з видів, що не стосуються людини, що мають бажану специфічність, афінність і ємкість. Гуманізоване антитіло можна додатково модифікувати за допомогою заміни додаткового залишку або у варіабельній каркасній ділянці, й усередині замінених залишків, що не належать людині, для поліпшення й оптимізації специфічності, афінності та/або ємкості антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло міститиме по суті всі з, щонайменше, одного і, як правило, двох або трьох, або чотирьох варіабельних доменів, що містять всі або по суті всі з ділянок CDR, відповідних імуноглобуліну, що не стосується людини, тоді як всі або переважно всі ділянки FR є ділянками FR з консенсусною послідовністю імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло може також містити щонайменше частину константної ділянки або домену імуноглобуліну (Fc), як правило, з імуноглобуліну людини. Приклади способів, вживаних для одержання гуманізованих антитіл, описані в Патенті США 5225539. Термін "антитіло людини", як застосовують тут, позначає антитіло, що продукується людиною, або антитіло, що має амінокислотну послідовність, відповідну антитілу, що продукується людиною, отримане з використанням будь-якого способу, відомого в даній галузі. Це визначення антитіла людини охоплює інтактні або повнорозмірні антитіла, їхні фрагменти, та/або антитіла, що містять щонайменше один поліпептид важкого і/або легкого ланцюга людини, наприклад, таке як антитіло, що містить поліпептиди легкого ланцюга миші й важкого ланцюга людини. "Гібридними антитілами" є молекули імуноглобуліну, в яких пари важких і легких ланцюгів з антитіл з різними ділянками антигенних детермінант об'єднані разом, так що отриманий тетрамер може впізнавати і зв'язувати два різні епітопи або два різні антигени. Термін "химерні антитіла" стосуються антитіл, де амінокислотна послідовність молекули імуноглобуліну отримана з двох або декількох видів. Як правило, варіабельна ділянка як легкого, так і важкого ланцюгів відповідає варіабельній ділянці антитіл, отриманих з одного вигляду ссавців (наприклад, миша, щур, кріль і так далі), з бажаною специфічністю, афінністю і ємкістю, тоді як константні ділянки є гомологічними послідовностям антитіл, отриманих з іншого виду (зазвичай людина), щоб уникнути викликання імунної відповіді в цього виду. Термін "епітоп" або "антигенна детермінанта" використовують тут взаємозамінно, і вони позначають ту частину антигену, яку може впізнавати й специфічно зв'язувати конкретне антитіло. Коли антигеном є поліпептид, епітопи можуть бути сформовані як із сусідніх амінокислот, так і не з сусідніх амінокислот, що розташовуються поруч за допомогою четвертинного згортання білка. Епітопи, сформовані з сусідніх амінокислот, як правило, зберігаються при денатурації білка, тоді як епітопи, сформовані за допомогою четвертинного згортання, як правило, втрачаються при денатурації білка. Епітоп, як правило, містить щонайменше 3 і більш зазвичай, щонайменше, 5 або 8-10 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Конкуренцію між антитілами визначають за допомогою аналізу, в якому тестований імуноглобулін інгібує специфічне зв'язування контрольного антитіла із загальним антигеном. Відомі багаточисленні типи аналізів конкурентного зв'язування, наприклад: твердофазний прямий або непрямий радіоімунний аналіз (RIA), твердофазний прямий або непрямий ферментний імуноаналіз (EIA), конкурентний сендвіч-аналіз (див. Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); твердофазний прямий біотин-авідиновий EIA (дивися Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); твердофазний прямий аналіз з міткою, твердофазний прямий сендвіч-аналіз з міткою (див. Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Press (1988)); твердофазний прямий аналіз RIA з міткою з використанням мітки I125 (див. Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)); твердофазний прямий біотинавідиновий EIA (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)) і прямий RIA з міткою (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)). Як правило, такий аналіз включає використання очищеного антигену, пов'язаного з твердою поверхнею, або клітин, що несуть який-небудь з них, неміченого тестованого імуноглобуліну й міченого контрольного імуноглобуліну. Конкурентне інгібування вимірюють за допомогою визначення кількості мітки, зв'язаної з твердою поверхнею або клітинами за наявності тестованого імуноглобуліну. Зазвичай тестований імуноглобулін наявний у надлишку. Антитіла, ідентифіковані за допомогою конкурентного аналізу (конкуруючі антитіла), включають антитіла, що зв'язуються з тим же самим епітопом, що й контрольне антитіло, та антитіла, що зв'язуються з сусіднім епітопом, досить близьким до епітопу, що зв'язується контрольним антитілом, щоб виникала стерична 8 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перешкода. Зазвичай, коли конкуруюче антитіло наявне в надлишку, воно інгібуватиме специфічне зв'язування контрольного антитіла із загальним антигеном, щонайменше, на 50 або 75 %. Те, що антитіло "вибірково зв'язується" або "специфічно зв'язується", означає, що антитіло реагує або зв'язується частіше, швидше, з більшою тривалістю, з більшою афінністю або з яким-небудь поєднанням вищезгаданого з епітопом, ніж з іншими речовинами, включаючи неродинні білки. "Вибірково зв'язується" або "специфічно зв'язується" означає, наприклад, що антитіло зв'язується з білком з KD, щонайменше, приблизно 0,1 мМ, проте більш зазвичай щонайменше приблизно 1мкм. "Вибірково зв'язується" або "специфічно зв'язується" інколи означає, що антитіло зв'язується з білком інколи з KD, щонайменше, приблизно 0,1 мкм або краще й інколи, щонайменше, приблизно з 0,01 мкм або краще. Через ідентичність послідовності між гомологічними білками в різних видах специфічне зв'язування може включати антитіло, яке впізнає маркерний білок ракової стволової клітини більше, ніж в одному вигляді. Як застосовують тут, терміни "неспецифічне зв'язування" й "фонове зв'язування" при використанні відносно взаємодії антитіла й білка або пептиду стосуються взаємодії, яка не залежить від наявності конкретної структури (тобто антитіло зв'язується з білками взагалі, а не з конкретною структурою, як-от епітоп). Терміни "виділений" або "очищений" стосується матеріалу, який є по суті або в основному вільним від компонентів, які в нормі супроводжують його в його природному стані. Чистоту й гомогенність, як правило, визначають з використанням способів аналітичної хімії, таких як електрофорез у поліакриламідному гелі або високоефективна рідинна хроматографія. Білок (наприклад, антитіло) або нуклеїнова кислота з даного опису, який є переважаючою молекулою, наявною в препараті, є по суті очищеним. Зокрема, виділена нуклеїнова кислота відокремлена від відкритих рамок зчитування, які природно фланкують ген і кодують білки, відмінні від білка, що кодується геном. Виділене антитіло відокремлене від інших білків, що не належать до імуноглобуліну, і від інших імуноглобулінових білків з іншою антигенсполучною специфічністю. Він означає також, що нуклеїнова кислота або білок у деяких варіантах здійснення є, щонайменше, на 80 % чистими, в деяких варіантах здійснення, щонайменше, на 85 % чистими, в деяких варіантах здійснення, щонайменше, на 90 % чистими, в деяких варіантах здійснення, щонайменше, на 95 % чистими і в деяких варіантах здійснення, щонайменше, на 99 % чистими. Як застосовують тут, терміни "рак" і "раковий" позначають або описують фізіологічний стан у ссавців, при якому популяція клітин характеризується нерегульованим зростанням клітин. Приклади раку включають як необмежуючі приклади карциному, лімфому, бластому, саркому й лейкоз. Конкретніші приклади таких типів раку включають плоскоклітинний рак, дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарциному легені, плоскоклітинну карциному легені, рак очеревини, гепатоцелюлярний рак, рак шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак ободової кишки, рак ободової і прямої кишки, карциному ендометрію або матки, карциному слинної залози, рак нирки, рак печінки, рак передміхурової залози, рак жіночих зовнішніх статевих органів, рак щитовидної залози, карциному печінки й різних типів раку голови й шиї. Терміни "проліферативне порушення" й "проліферативне захворювання" стосуються порушень, пов'язаних з аномальною проліферацією клітин, як-от рак. "Пухлина" й "неоплазія", як застосовують тут, стосуються будь-якої маси тканини, утвореної в результаті надлишкового зростання або проліферації клітин, чи то доброякісної (нераковою), чи то злоякісної (ракової), включаючи передракові вогнища. "Метастаз", як застосовують тут, позначає процес, за допомогою якого рак поширюється або переноситься від ділянки виникнення до інших ділянок організму з розвитком схожого ракового вогнища в новій локалізації. "Метастатична" або "метастазуюча" клітина є клітиною, що втрачає адгезійні контакти з сусідніми клітинами й мігрує через кровотік або лімфу від первинної ділянки захворювання для проникнення в сусідні структури організму. Терміни "ракова стволова клітина", "стволова клітина пухлини", або "стволова клітина солідної пухлини" використовують тут взаємозамінно, й вони позначають популяцію клітин з солідної пухлини, які: (1) мають широку здатність до проліферації; 2) здатні до асиметричного ділення клітин з утворенням одного або декількох видів диференційованого потомства зі зниженою здатністю до проліферації й розвитку; і (3) здатні до симетричних ділень клітин для самооновлення або самопідтримки. Ці властивості "ракових стволових клітин", "стволових клітин пухлини" або "стволових клітин солідної пухлини" додають цим раковим стволовим клітинам здатність формувати пальповані пухлини при серійній трансплантації миші з імунною недостатністю, на відміну від більшості ракових клітин, які нездатні формувати пухлини. Ракові 9 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 стволові клітини піддаються самооновленню, на противагу диференціюванню хаотичним чином з формуванням пухлин з аномальними типами клітин, які можуть мінятися з часом при виникненні мутацій. Стволові клітини солідної пухлини відрізняються від "ракової стволової лінії", представленої в патенті США № 6004528. У цьому патенті "ракову стволову лінію" визначають як повільно зростаючий тип клітин-попередників, який сам має небагато мутацій, але який піддається симетричним, а не асиметричним діленням клітин в результаті змін, що викликають утворення пухлини, які відбуваються в оточенні клітин. Ця гіпотеза "ракової стволової лінії", таким чином, передбачає, що пухлинні клітини з високим рівнем мутацій, швидко проліферуючі, виникають переважно в результаті аномального оточення, яке примушує відносно нормальні стволові клітини накопичуватися й потім піддаватися мутаціям, що примушує їх ставати раковими клітинами. В патенті США № 6004528 передбачають, що таку модель можна використовувати для поліпшення діагностики раку. Модель стволової клітини солідної пухлини фундаментально відрізняється від моделі "ракової стволової лінії" і в результаті має корисні властивості, що не надаються моделлю "ракової стволової лінії". Поперше, стволові клітини солідної пухлини не є "позбавленими мутацій". "Позбавлену мутацій ракову стволову лінію", описану в патенті США № 6004528, можна вважати передраковим вогнищем, тоді як стволовими клітинами солідної пухлини є ракові клітини, які самі по собі можуть містити мутації, відповідальні за утворення пухлин, починаючи від передракового стану до пізньої стадії раку. Тобто стволові клітини солідної пухлини ("ракові стволові клітини") будуть включені в клітини з високим рівнем мутацій, що їх відрізняють від "ракової стволової лінії" в патенті США No. 6004528. По-друге, генетичні мутації, які призводять до раку, можуть переважно бути властивими стволовим клітинам солідної пухлини, так само як бути зовнішніми. Модель стволової клітини солідної пухлини передбачає, що виділені стволові клітини солідної пухлини можуть викликати додаткові пухлини при трансплантації (таким чином, пояснюючи метастазування), в той час модель "ракової стволової лінії" передбачатиме, що клітини трансплантованої "ракової стволової лінії" будуть нездатні викликати нову пухлину, оскільки це їхнє аномальне оточення було таким, що викликає утворення пухлини. Дійсно, можливість трансплантувати дисоційовані й виділені за фенотипом стволові клітини солідної пухлини мишам (у оточення, яке дуже відрізняється від нормального оточення в пухлині), де вони ще формують нові пухлини, відрізняє даний винахід від моделі "ракової стволової лінії". По-третє, стволові клітини солідної пухлини, ймовірно, діляться як симетрично, так і асиметрично, так що симетричне ділення клітин не є обов'язковою властивістю. По-четверте, стволові клітини солідної пухлини можуть ділитися швидко або повільно, залежно від багатьох змінних, так що повільна швидкість проліферації не є визначальною характеристикою. Терміни "ракова клітина", "пухлинна клітина" і граматичні еквіваленти стосуються загальної популяції клітин, отриманих з пухлини або передракового вогнища, включаючи як не викликаючі утворення пухлини клітини, що складають більшість популяції пухлинних клітин, так і викликаючі утворення пухлини стволові клітини (ракові стволові клітини). Як застосовують тут, термін "викликаючий утворення пухлини" стосується функціональних властивостей стволової клітини солідної пухлини, включаючи властивості самооновлення (утворення додаткових ракових стволових клітин, що викликають утворення пухлини) й проліферації для одержання всіх інших клітин пухлини (утворення диференційованих і, таким чином, не викликаючих утворення пухлини пухлинних клітин), що дозволяє стволовим клітинам солідної пухлини утворювати пухлину. Як застосовують тут, терміни "раковий(і) маркер(и) стволової клітини", "маркер(и) ракової стволової клітини", "маркер(и) стволової клітини пухлини" або "маркер(и) стволової клітини солідної пухлини" стосуються гена або генів, або білка, поліпептиду, або пептиду, експресованому за допомогою гена або генів, рівень експресії якого, окремо або в поєднанні з іншими генами, корелює з наявністю ракових клітин, що викликають утворення пухлини, на відміну від клітин, що не викликають утворення пухлини. Кореляція може стосуватися або збільшеної, або зменшеної експресії гена (наприклад, збільшених або зменшених рівнів мРНК або пептиду, що кодується геном). Як застосовують тут, терміни "біопсія" або "біоптат тканини" стосуються зразка тканини або рідини, який відбирають у суб'єкта з метою визначення, чи містить зразок ракову тканину. В деяких варіантах здійснення біоптат тканини або рідини отримують, оскільки підозрюють, що суб'єкт страждає на рак, і потім біоптат тканини або рідини досліджують на наявність або відсутність раку. Як застосовують тут, термін "суб'єкт" стосується будь-якої тварини (наприклад, ссавця), включаючи, як необмежуючі приклади, людину, приматів, що не належать до людини, гризунів й 10 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тому подібне, яка призначена, щоб бути реципієнтом конкретного лікування. Як правило, терміни "суб'єкт" і "пацієнт" використовують взаємозамінно тут у відношенні до суб'єкта-людини. "Фармацевтично прийнятний" стосується того, що схвалено або може бути схвалено органом регулювання федерального або державного уряду або перераховано в U.S. Pharmacopeia або іншій загальновідомій фармакопеї для вживання для тварин, включаючи людину. "Фармацевтично прийнятна сіль" стосується солі сполуки, яка є фармацевтично прийнятною й має бажану фармакологічну активність вихідної сполуки. "Фармацевтично прийнятний наповнювач, носій або ад'ювант" стосується наповнювача, носія або ад'юванту, що його можна вводити суб'єктові разом, щонайменше, з одним антитілом з даного опису і який не порушує його фармакологічну активність і є не токсичним при введенні в дозах, достатніх для доставки терапевтичної кількості сполуки. "Фармацевтично прийнятний носій" стосується розчинника, ад'юванту, наповнювача або носія, з яким уводять щонайменше одне антитіло з даного опису. "Проліки" стосуються похідної терапевтично ефективної сполуки, якій необхідна трансформація всередині організму для одержання терапевтично ефективної сполуки. Проліки можуть бути фармакологічно неактивними до переведення в терапевтично ефективну вихідну сполуку. Термін "терапевтично ефективна кількість" стосується кількості антитіла, поліпептиду, полінуклеотиду, малої органічної молекули або іншого лікарського засобу, ефективного для "лікування" захворювання або порушення у суб'єкта або ссавця. В разі раку терапевтично ефективна кількість лікарського засобу може зменшувати кількість ракових клітин; зменшувати розмір пухлини; інгібувати або зупиняти інфільтрацію ракових клітин у периферичні органи, включаючи, наприклад, поширення раку в м'яку тканину і кістку; інгібувати й зупиняти метастазування пухлини; інгібувати й зупиняти зростання пухлини; полегшувати до деякої міри один або декілька симптомів, пов'язаних з раком, зменшувати захворюваність і смертність; покращувати якість життя; або поєднувати такі ефекти. В тих випадках, коли лікарський засіб запобігає зростанню існуючих ракових клітин і/або вбиває їх, його можна позначати цитостатичним і цитотоксичним. Як застосовують тут, "постановка діагнозу" або "діагностична інформація" стосується будьякої інформації, включаючи, наприклад, наявність ракових стволових клітин, яка є корисною для визначення, чи має пацієнт захворювання або стан, і/або для класифікації захворювання або стану за фенотиповою категорією або будь-якою категорією, що має значення відносно до прогнозу або можливої відповіді на лікування (чи то на лікування взагалі, чи то на будь-яке конкретне лікування) захворювання або стану. Так само, діагноз стосується надання будь-якого типу діагностичної інформації, включаючи, як необмежуючі приклади, інформацію, чи має суб'єкт, ймовірно, стан (як-от пухлина), чи містить пухлина суб'єкта ракові стволові клітини, інформацію відносно характеру або класифікації пухлини, наприклад пухлину з високим ризиком або пухлину з низьким ризиком, інформацію відносно прогнозу та інформацію, корисну для вибору відповідного лікування. Вибір лікування може включати вибір конкретного хіміотерапевтичного засобу або іншого способу лікування, такого як хірургія або радіоактивне опромінення, або вибір відносно зупинки або проведення лікування. Як застосовують тут, терміни "надання прогнозу", "прогностична інформація" або "прогнозна інформація" стосуються надання інформації, включаючи, наприклад, наявність ракових стволових клітин у пухлині суб'єкта, інформацію відносно впливу наявності раку (наприклад, як визначено діагностичними способами за даним винаходом) на майбутнє здоров'я суб'єкта (наприклад, очікувану захворюваність або смертність, вірогідність придбання раку й ризик метастазування). Такі терміни, як "лікування" або "обробка", або "лікувати", або "полегшення", або "полегшувати", стосуються як 1) терапевтичних заходів, які виліковують, уповільнюють, зменшують симптоми і/або зупиняють прогрес діагностованого патологічного стану або порушення, так і 2) профілактичних або застережливих заходів, які запобігають і/або уповільнюють розвиток наміченого патологічного стану або порушення. Таким чином, ті, хто потребує лікування, включають тих, хто вже має порушення, тих, хто схильний до придбання порушення, й тих, хто підлягає запобіганню порушенню. Суб'єкта успішно "лікують" згідно зі способами за даним винаходом, якщо для пацієнта показують одне або декілька з наступного: зниження кількості або повна відсутність ракових клітин; зменшення розміру пухлини; інгібування або відсутність інфільтрації ракових клітин у периферичні органи, включаючи, наприклад, поширення раку в м'яку тканину й кістку; інгібування або відсутність метастазування пухлини; інгібування або відсутність зростання пухлини; полегшення одного або декількох 11 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 симптомів, пов'язаних з конкретним раком; зниження захворюваності й смертності; поліпшення якості життя; або яке-небудь поєднання ефектів. Як застосовують тут, терміни "полінуклеотид" або "нуклеїнова кислота" стосуються полімеру, що складається з безлічі нуклеотидних одиниць (рибонуклеотид або дезоксирибонуклеотид або родинні структурні варіанти), зв'язаних за допомогою фосфодіефірних зв'язків, включаючи як необмежуючі приклади ДНК або РНК. Термін охоплює послідовності, які містять будь-який з відомих аналогів основ з ДНК і РНК, включаючи, як необмежуючі приклади, 4-ацетилцитозин, 8-гідрокси-N6-метиладенозин, азиридинілцитозин, псевдоізоцитозин, 5(карбоксигідроксилметил)урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5карбоксиметил-амінометил-2-тіоурацил, 5-карбоксиметиламінометилурацил, дигідроурацил, інозин, N6-ізопентеніладенін, 1-метиладенін, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанін, 1метилінозин, 2,2-диметилгуанін, 2-метиладенін, 2-метилгуанін, 3-метилцитозин, 5метилцитозин, N6-метиладенін, 7-метилгуанін, 5-метиламінометилурацил, 5метоксіамінометил-2-тіоурацил, бета-D-манозилквеуозин, 5'-метоксикарбоніл-метилурацил, 5метоксіурацил, 2-метилтіо-N6-ізопентеніладенін, метиловий ефір урацил-5-оксіоцтової кислоти, урацил-5-оксіоцтову кислоту, оксибутоксозин, псевдоурацил, квеуозин, 2-тіоцитозин, 5-метил-2тіоурацил, 2-тіоурацил, 4-тіоурацил, 5-метилурацил, метиловий ефір N-урацил-5-оксіоцтової кислоти, урацил-5-оксіоцтову кислоту, псевдоурацил, квеуозин, 2-тіоцитозин і 2,6-діамінопурин. Фраза "суворі умови гібридизації" стосується умов, за яких зонд буде гібридизуватися з його підпослідовністю-мішенню, як правило, у складній суміші нуклеїнових кислот, але не з іншими послідовностями. Суворі умови є залежними від послідовності й будуть різними за різних обставин. Довші послідовності специфічно гібридизуються при вищих температурах. Детальне керівництво з гібридизації нуклеїнових кислот представлене в Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Як правило, вибирають суворі умови, що є приблизно на 5-10 °C нижчі за термічну точку плавлення (Tm) для конкретної послідовності при певній іонній силі і pH. Tm є температурою (при певній іонній силі, pH і концентрації нуклеїнової кислоти), при якій 50 % зондів, комплементарних мішеней, гібридизується з послідовністюмішенню при рівновазі (оскільки послідовності-мішені наявні в надлишку, при Tm 50 % зондів зайнято при рівновазі). Суворих умов можна також досягати за допомогою додавання дестабілізаторів, таких як формамід. Для вибіркової або специфічної гібридизації позитивний сигнал, щонайменше, вдвічі перевищує фон, переважно в 10 разів перевищує фонову гібридизацію. Зразкові суворі умови гібридизації можуть бути наступними: 50 % формамід, 5SSC і 1 % SDS, інкубація при 42 °C, або 5SSC, 1 % SDS, інкубація при 65 °C, з промиванням у 0,2SSC і 0,1 % SDS при 65 °C. Термін "ген" стосується послідовності нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК), яка містить кодуючі послідовності, необхідні для одержання поліпептиду, попередника або РНК (наприклад, рРНК, тРНК). Поліпептид може кодувати повнорозмірна кодуюча послідовність або будь-яка частина кодуючої послідовності, поки зберігаються бажана активність або функціональні властивості (наприклад, ферментативна активність, зв'язування ліганду, передача сигналу, імуногенність і так далі) повнорозмірного поліпептиду або фрагмента. Термін охоплює також кодуючу ділянку структурного гена й послідовності, локалізовані поряд з кодуючою ділянкою як з 5'-, так і з 3'-кінців на відстані приблизно 1 т.п.н. або більше на кожному кінці, так що ген відповідає довжині повнорозмірної мРНК. Послідовності, локалізовані на 5' кодуючій ділянці й наявні в мРНК, позначають як 5'-нетрансльовані послідовності. Послідовності, локалізовані на 3' або нижче кодуючої ділянки й наявні в мРНК, позначають як 3'-нетрансльовані послідовності. Термін "ген" охоплює як кДНК, так і геномні форми гена. Форма геному або клон гена містить кодуючу ділянку, що переривається некодуючими послідовностями, названими "інтрони" або "вбудовані ділянки", або "вбудовані послідовності". Інтронами є фрагменти гена, які транскрибуються в ядерну РНК (гяРНК); інтрони можуть містити регуляторні елементи, такі як енхансери. Інтрони віддаляються або "піддаються сплайсингу" з ядерного або первинного транскрипту; інтрони, таким чином, відсутні в транскрипті матричної РНК (мРНК). мРНК функціонує під час трансляції для визначення послідовності або порядку амінокислот у виникаючому поліпептиді. На додаток до наявних інтронів, геномні форми гена можуть також містити послідовності, локалізовані як на 5'-, так і на 3’-кінці послідовностей, наявних у транскрипті РНК. Ці послідовності позначають як "фланкуючі" послідовності або ділянки (ці фланкуючі послідовності локалізовані до 5' або 3' від нетрансльованих послідовностей, наявних у транскрипті мРНК). 5'-фланкуюча ділянка може містити регуляторні послідовності, такі як промотори й енхансери, які контролюють транскрипцію гена або впливають на неї. 3' 12 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фланкуюча ділянка може містити послідовності, які управляють термінацією транскрипції, посттранскрипційним розщеплюванням й поліаденілюванням. Термін "рекомбінантний" при використанні відносно клітини, нуклеїнової кислоти, білка або вектору позначає те, що клітина, нуклеїнова кислота, білок або вектор були модифіковані введенням гетерологічної нуклеїнової кислоти або білка, зміною природної нуклеїнової кислоти або білка, або що клітина отримана з модифікованої таким чином клітини. Таким чином, наприклад, рекомбінантні клітини експресують гени, не виявлені в природній (не рекомбінантній) формі клітини, або експресують природні гени, які є надекспресованими або іншим чином аномально експресованими, наприклад, експресованими у вигляді фрагментів, що не зустрічаються в природі, або варіантів сплайсингу. Терміном "рекомбінантна нуклеїнова кислота" тут позначають нуклеїнову кислоту, спочатку отриману in vitro, як правило, за допомогою маніпуляції з нуклеїновою кислотою, наприклад, з використанням полімераз і ендонуклеаз, у формі, в нормі не виявленій у природі. За цим способом досягають функціонального зв'язування різних послідовностей. Таким чином, виділену нуклеїнову кислоту, в лінійній формі, або експресуючий вектор, отриманий in vitro лігуванням молекул ДНК, які в нормі не є сполученими, обидва вважають рекомбінантними для цілей за даним винаходом. Зрозуміло, що після одержання рекомбінантної нуклеїнової кислоти і введення у клітину або організм-господаря, вона буде реплікуватися нерекомбінантним чином, тобто з використанням in vivo клітинного апарату клітини-господаря, а не маніпуляцій in vitro; проте такі нуклеїнові кислоти, одного дня отримані рекомбінантним чином, хоча вони й реплікуються потім нерекомбінантним чином, все ще вважають рекомбінантними для цілей винаходу. Подібним чином, "рекомбінантним білком" є білок, отриманий з використанням рекомбінантних способів, тобто за допомогою експресії рекомбінантної нуклеїнової кислоти, як описано вище. Як застосовують тут, термін "гетерологічний ген" стосується гена, наявного не у своєму природному оточенні. Наприклад, гетерологічний ген включає ген з одних видів, уведений в інші види. Гетерологічний ген включає також ген, природний для організму, який є зміненим якимнебудь чином (наприклад, підданим мутаціям, доданим у багатьох копіях, зв'язаним з неприродними регуляторними послідовностями і так далі). Гетерологічні гени відрізняються від ендогенних генів тим, що послідовності гетерологічного гена, як правило, приєднані до послідовностей ДНК, які не виявлені зв'язаними з послідовностями гена на хромосомі, або зв'язані з частинами хромосоми, не виявленими в природі (наприклад, гени, експресовані в локусах, де гени в нормі не експресовані). Як застосовують тут, термін "вектор" використовують відносно до молекул нуклеїнової кислоти, які переносять фрагмент(и) ДНК від однієї клітини до іншої. Термін "носій" інколи використовують взаємозамінно з "вектором". Вектори часто отримують з плазмід, бактеріофагів або вірусів рослин або тварин. "Лігування" стосується процесу формування фосфодіефірних зв'язків між двома фрагментами дволанцюжкової нуклеїнової кислоти. Якщо не передбачено інакше, лігування можна здійснювати з використанням відомих буферів і умов за допомогою 10 одиниць T4 Днклігази ("лігази") на 0,5 мкг приблизно еквімолярних кількостей фрагментів ДНК, що підлягають лігуванню. Лігування нуклеїнової кислоти може служити для зв'язування двох білків разом у рамці зчитування для одержання одного білка, або злитого білка. Як застосовують тут, термін "експресія гена" стосується процесу переведення генетичної інформації, закодованої в гені, в РНК (наприклад, мРНК, рРНК, тРНК, або мяРНК) за допомогою "транскрипції" гена (наприклад, за допомогою ферментативної дії РНК-полімерази), і, для кодуючих білок генів, у білок за допомогою "трансляції" мРНК. Експресію гена можна регулювати на багатьох стадіях процесу. "Підвищувальна регуляція" або "активація" стосується регуляції, яка збільшує продукцію продуктів експресії гена (наприклад, РНК або білка), тоді як "знижуюча регуляція" або "репресія" стосується регуляції, яка зменшує продукцію. Молекули (наприклад, чинники транскрипції), які залучені в підвищувальну регуляцію, або знижуючу регуляцію, часто називають "активаторами" і "репресорами", відповідно. Терміни "поліпептид", "пептид", "білок" і "фрагмент білка" використовують тут взаємозамінно для позначення полімеру із залишків амінокислот. Терміни застосовують до полімерів амінокислот, у яких один або декілька залишків амінокислот є штучним хімічним міметиком відповідної в природі амінокислоти, так само як до полімерів амінокислот, що зустрічаються в природі, і полімерів амінокислот, що не зустрічаються в природі. Термін "амінокислота" стосується тих, що зустрічаються в природі і синтетичних амінокислот, так само аналогів амінокислот і міметиків амінокислот, які функціонують схожим чином з амінокислотами, що зустрічаються в природі. Амінокислотами, що зустрічаються в природі, є амінокислоти, що кодуються генетичним кодом, так само як амінокислоти, які є 13 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 модифікованими пізніше, наприклад гідроксипролін, гамма-карбоксиглутамат і O-фосфосерин. Аналоги амінокислот стосуються сполук, які мають таку саму основну хімічну структуру, як амінокислоти, що зустрічаються в природі, наприклад альфа-вуглець, який є пов'язаним з воднем, карбоксильною групою, аміногрупою і R-групою, наприклад гомосерин, норлейцин, метіонінсульфоксид, метіонінметилсульфоній. Такі аналоги можуть мати модифіковані R-групи (наприклад, норлейцин) або модифіковані пептидні остови, але зберігати таку саму основну хімічну структуру, як амінокислота, що зустрічається в природі. Міметики амінокислот стосуються хімічних сполук, які мають структуру, що відрізняється від основної хімічної структури амінокислоти, але які функціонують схожим чином з амінокислотою, що зустрічається в природі. "Консервативно модифіковані варіанти" застосовують до послідовностей як амінокислот, так і нуклеїнової кислоти. "Варіанти амінокислот" стосуються послідовностей амінокислот. У відношенні до конкретних послідовностей нуклеїнової кислоти, консервативно модифіковані варіанти стосуються тих нуклеїнових кислот, які кодують ідентичні або по суті ідентичні послідовності амінокислот, або коли нуклеїнова кислота не кодує амінокислотну послідовність, по суті ідентичних або зв'язаних (наприклад, близьких у природі) послідовностей. Через виродженість генетичного коду велика кількість функціонально ідентичних нуклеїнових кислот кодує більшість білків. Наприклад, кодони GCA, GCC, GCG і GCU всі кодують амінокислоту аланін. Таким чином, у кожному положенні, де кодон визначає аланін, кодон можна замінювати на інший з відповідних описаних кодонів без зміни кодованого поліпептиду. Такими варіантами нуклеїнової кислоти є "мовчазні варіанти", які є одним з видів консервативно модифікованих варіантів. Кожна послідовність нуклеїнової кислоти тут, яка кодує поліпептид, описує також мовчазні варіанти нуклеїнової кислоти. Фахівцеві в даній галузі відомо, що в конкретному контексті кожен кодон у нуклеїновій кислоті (окрім AUG, який зазвичай є єдиним кодоном для метіоніну, і TGG, який зазвичай є єдиним кодоном для триптофану) можна модифікувати з одержанням функціонально ідентичної молекули. Відповідно, під мовчазними варіантами нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, маються на увазі в описаній послідовності відносно до продукту експресії, але не відносно до дійсної послідовності зонда. Що стосується послідовностей амінокислот, фахівцеві в даній галузі відомо, що окремі заміни, делеції або вставки в послідовність нуклеїнової кислоти, пептиду, поліпептиду або білка, які замінюють, додають або делетують окрему амінокислоту або невеликий відсоток амінокислот у кодованій послідовності, є "консервативно модифікованим варіантом", включаючи ті, де зміни приводять до заміни амінокислоти на хімічно схожу амінокислоту. Таблиці консервативних замін, що представляють функціонально схожі амінокислоти, добре відомі в даній галузі. Такі консервативно модифіковані варіанти є доповненням і не виключають поліморфні варіанти, міжвидові гомологи й алелі за винаходом. Як правило, консервативні заміни включають: 1) Аланін (A), Гліцин (G); 2) Аспарагінову кислоту (D), Глутамінову кислоту (E); 3) Аспарагін (N), Глутамін (Q); 4) Аргінін (R), Лізин (K); 5) Ізолейцин (I), Лейцин (L), Метіонін (M), Валін (V); 6) Фенілаланін (F), Тирозин (Y), Триптофан (W); 7) Серин (S), Треонін (T); і 8) Цистеїн (C), Метіонін (M) (див., наприклад, Creighton, Proteins (1984)). Термін "мічений епітопом", як застосовують тут, стосуються химерного поліпептиду, що містить послідовність маркерного білка або домену ракової стволової клітини, або її частину, злиту з "епітопом-міткою". Поліпептид епітопа-мітки містить досить залишків амінокислот для надання епітопа для впізнавання антитілом, проте є досить коротким, так що він не заважає активності маркерного білка ракової стволової клітини. Відповідні епітопи-мітки, як правило, мають щонайменше шість залишків амінокислот, зазвичай між приблизно 8 і приблизно 50 залишками амінокислот та інколи між приблизно 10 і приблизно 20 залишками. Загальноприйняті епітопи-мітки включають мітки Fc, HA, His і FLAG. Даний винахід стосуються композицій і способів для дослідження, діагностики, характеристики й лікування раку. Зокрема, даний винахід стосується антитіл проти маркерів стволових клітин солідної пухлини і способів використання цих антитіл для інгібування зростання пухлини й лікування раку у пацієнтів-людей. У конкретних варіантах здійснення антитіла за даним винаходом включають антитіла-антагоністи, які специфічно зв'язують маркерний білок ракової стволової клітини і заважають, наприклад, зв'язуванню ліганду, димеризації рецептора, експресії маркерного білка ракової стволової клітини й передачі сигналу маркерним білком ракової стволової клітини. В конкретних варіантах здійснення описані антитіла включають антитіла-агоністи, які специфічно зв'язують маркерний білок ракової стволової клітини і сприяють, наприклад, зв'язуванню ліганду, димеризації рецептора, й передачі сигналу маркерним білком ракової стволової клітини. В конкретних варіантах здійснення описані антитіла не перешкоджають або не сприяють біологічній активності 14 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 маркерного білка ракової стволової клітини, проте інгібують зростання пухлини за допомогою, наприклад, інтерналізації й розпізнавання імунною системою антитіла. В конкретних варіантах здійснення антитіла специфічно впізнають більш за один маркерний білок клітин солідної пухлини. Представлено виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом DLL4 людини, сформованим поєднанням N-кінцевої ділянки DLL4 людини (SEQ ID NO: 27) і DSL людини (SEQ ID NO: 26), де антитіло впливає на зростання пухлини. В конкретних варіантах здійснення антитілом є моноклональне антитіло. В конкретних варіантах здійснення антитілом є химерне антитіло. В конкретних варіантах здійснення антитілом є гуманізоване антитіло. В конкретних варіантах здійснення антитілом є антитіло людини. Крім того, представлена фармацевтична композиція, що містить антитіло за даним описом і фармацевтично прийнятний носій. Крім того, представлений спосіб лікування раку, що включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла або фармацевтичної композиції за даним описом. У конкретних варіантах здійснення антитіло кон'югують з цитотоксичною групою. В конкретних варіантах здійснення спосіб додатково включає введення щонайменше одного терапевтичного засобу, придатного для здійснення комбінованої терапії. В конкретних варіантах здійснення пухлинні клітини вибрані з клітин пухлини молочної залози, пухлини ободової і прямої кишки, пухлини легені, пухлини передміхурової залози, пухлини підшлункової залози й пухлини голови і шиї. Подібно до тканин, з яких вони походять, солідні пухлини складаються з гетерогенної популяції клітин. Те, що більшість цих клітин не викликають утворення пухлини, дозволяє передбачати, що розвиток й підтримка солідних пухлин також засновані на невеликій популяції стволових клітин (тобто викликаючих пухлину ракових клітин) із здатністю проліферувати й ефективно давати початок як додатковим стволовим клітинам пухлин (самооновлення), так і більшості більш диференційованих пухлинних клітин, які не мають потенціалу викликати утворення пухлини (тобто не викликаючих утворення пухлини ракові клітини). Концепцію ракових стволових клітин вперше представили незабаром після відкриття гематопоетичних стволових клітин (HSC) і довели експериментально для гострого мієлогенного лейкозу (AML) (Park et al., 1971, J. Natl. Cancer Inst. 46:411-22; Lapidot et al., 1994, Nature 367:645-8; Bonnet & Dick, 1997, Nat. Med. 3:730-7; Норі et al., 2004, Nat. Immunol. 5:738-43). Пізніше виділили стволові клітини з солідних пухлин на підставі їх експресії унікального набору рецепторів поверхні клітин і оцінки їхніх властивостей самооновлення й проліферації в культурі і в моделях на тваринах з ксенотрансплантацією. Виявили лінійну популяцію ESA+CD44+CD24-/низький, більш ніж у 50 разів збагачену за здатністю утворювати пухлини в порівнянні з нефракціонованими пухлинними клітинами (Al-Hajj et al., 2003, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 100:3983-8). Можливість виділяти викликаючі утворення пухлини ракові стволові клітини з безлічі пухлинних клітин, що не викликають утворення пухлини, привела до ідентифікації маркерів ракових стволових клітин, генів з диференціальною експресією в ракових стволових клітинах у порівнянні з пухлинними клітинами, що не викликають утворення пухлин, або нормальним епітелієм молочної залози з використанням аналізу на мікрочіпах. За даним винаходом використовують знання цих ідентифікованих маркерів ракової стволової клітини для діагностики й лікування раку. Маркери ракової стволової клітини за даним винаходом стосуються DLL4 людини, ліганду рецептора Notch. Шлях передачі сигналу Notch є одним з декількох критичних регуляторів формування ембріональної картини, постембріональної підтримки тканин і біології стволових клітин. Конкретніше, передача сигналу Notch залучена в процес латерального гальмування між сусідніми клітинами, що визначає їхню долю, і грає важливу роль у визначенні шляху розвитку клітини під час асиметричних ділень клітин. Нерегульована передача сигналів Notch зв'язана з безліччю типів раку людини, де вона може змінювати напрям розвитку пухлинних клітин для підтримки їх у недиференційованому й проліферативному стані (Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69). Таким чином, канцерогенез може тривати, захоплюючи механізми гомеостазу, контролюючі нормальний розвиток і репарацію тканин за допомогою популяцій стволових клітин (Beachy et al., 2004, Nature 432:324). Рецептор Notch вперше ідентифікували у мутантів Drosophila. Гаплонедостатність Notch у Drosophila призводить до вирізів на краю крила, тоді як втрата функції приводить до ембріонального летального "нейрогенного" фенотипу, коли клітини епідермісу перемикають розвиток на нервову тканину (Moohr, 1919, Genet. 4:252; Poulson, 1937, PNAS 23:133; Poulson, 1940, J. Exp. Zool. 83:271). Рецептором Notch є однопрохідний трансмембранний рецептор, що містить безліч тандемних повторів, подібних до епідермального чинника зростання (EGF) і багатих цистеїном повторів Notch/LIN-12 усередині великого позаклітинного домену (Wharton et al., 1985, Cell 43:567; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094; огляд в Artavanis et al., 1999, Science 15 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 284:770). Ідентифікували чотири білки Notch ссавців (NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 і NOTCH4), і мутації в цих рецепторах незмінно приводять до аномалій розвитку й патологій людини, включаючи важкі типи раку, як детально описано нижче (Gridley, 1997, Mol. Cell Neurosci. 9:103; Joutel & Tournier-Lasserve, 1998, Semin. CellDev. Biol. 9:619-25). Рецептор Notch активують однопрохідні трансмембранні ліганди сімейства Delta, Serrated, Lag-2 (DSL). Відомі ліганди Notch у ссавців, Delta-подібний 1 (Dll1), Delta-подібний 3 (Dll3), Deltaподібний 4 (Dll4), Jagged 1 і Jagged 2, характеризуються доменом DSL і тандемними EGFподібними повторами всередині позаклітинного домену. Позаклітинний домен рецептора Notch взаємодіє з позаклітинним доменом його лігандів, як правило, на сусідніх клітинах, що приводить до двох протеолітичних розщеплювань Notch, позаклітинного розщеплювання, опосередкованого протеазою ADAM, і розщеплювання всередині трансмембранного домену, опосередкованого гамма-секретазою. Це останнє розщеплювання утворює внутрішньоклітинний домен Notch (NICD). Потім NICD входить у ядро, де він активує сімейство чинників транскрипції CBF1, супресор Hairless [Su(H)], Lag-2 (CSL) як головні нижчестоячі ефектори для збільшення транскрипції ядерних основних чинників транскрипції спіраль-петля-спіраль з сімейства Hairy і Enhancer of Split [E(spl)] (Artavanis et al., 1999, Science 284:770; Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69; Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:543). Альтернативні внутріклітинні шляхи, що залучають цитоплазматичний білок Deltex, ідентифікований у Drosophila, може також існувати у ссавців (Martinez et al., 2002, Curr. Opin. Genet. Dev. 12:52433), і цей залежний від Deltex шлях може діяти для супресії експресії генів-мішеней Wnt (Brennan et al., 1999, Curr. Biol. 9:707-710; Lawrence et al., 2001, Curr. Biol. 11:375-85). Гематопоетичні стволові клітини (HSC) є найбільш вивченими стволовими клітинами в організмі, й передача сигналу Notch є залученою як у їх нормальну підтримку, так і в лейкемічну трансформацію (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73). HSC є рідкою популяцією клітин, які можуть зберігатися в стомальній ніші всередині дорослого кісткового мозку. Ці клітини характеризуються як унікальним профілем експресії генів, так і здатністю постійно давати почало більш диференційованим клітинам-попередникам для реконструювання всієї гематопоетичної системи. Конститутивна активація передачі сигналів Notch1 в HSC і клітинахпопередниках приводить до утворення іморталізованих ліній клітин, з яких утворюються як лімфоїдні, так і мієлоїдні клітини in vitro і в довготривалих аналізах реконструкції (Varnum-Finney et al., 2000, Nat. Med. 6:1278-81), і присутність Jagged 1 збільшує приживлення популяцій клітин кісткового мозку людини, збагачених за HSC (Karanu et al., 2000, J. Exp. Med. 192:1365-72). Пізніше показали передачу сигналів Notch у HSC in vivo і показали, що вона залучена в інгібування диференціювання HSC. Більш того, передача сигналів Notch, мабуть, необхідна для опосередкованого Wnt самооновлення HSC (Duncan et al., 2005, Nat. Immunol. 6:314). Шлях передачі сигналів Notch також грає центральну роль у підтримці нервових стволових клітин і залучений як у їх нормальну підтримку, так і в злоякісні пухлини мозку (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73; Purow et al., 2005, Cancer Res. 65:2353-63; Hallahan et al., 2004, Cancer Res. 64:7794-800). Нервові стволові клітини дають початок всім нейрональним і гліальним клітинам у нервовій системі ссавців у ході розвитку, і зовсім нещодавно їх ідентифікували в дорослому мозку (Gage, 2000, Science 287:1433-8). Для мишей, дефіцитних за Notch1, генам-мішеням Notch Hes1, 3 і 5 і регулювальникові передачі сигналів Notch пенесиліну 1 (PS1), показали знижену кількість ембріональних нервових стволових клітин. Більше того, кількість дорослих нервових стволових клітин знижена в мозку гетерозиготних за PS1 мишей (Nakamura et al., 2000, J. Neurosci. 20:283-93; Hitoshi et al., 2002, Genes Dev. 16:846-58). Зменшення кількості нервових стволових клітин, мабуть, є результатом їх передчасного диференціювання в нейрони (Hatakeyama et al., 2004, Dev. 131:5539-50), що дозволяє передбачати, що передача сигналів Notch регулює диференціювання й самооновлення нервових стволових клітин. Неправильна передача сигналів Notch залучена в ряд типів раку людини. Ген NOTCH1 у людини вперше ідентифікували в підгрупі T-клітинних гострих лімфобластних лейкозів як транслокований локус, що приводить до активації шляху Notch (Ellisen et al., 1991, Cell 66:64961). Конститутивна активація передачі сигналів Notch1 в T-клітинах у моделях на мишах так само викликає T-клітинні лімфоми, що дозволяє передбачати її роль як причину (Robey et al., 1996, Cell 87:483-92; Pear et al., 1996, J. Exp. Med. 183:2283-91; Yan et al., 2001, Blood 98:3793-9; Bellavia et al., 2000, EMBO J. 19:3337-48). Нещодавно виявили, що точкові мутації, вставки й делеції в NOTCH1, що приводять до неправильної передачі сигналів NOTCH1, часто наявні при T-клітинному гострому лімфобластному лейкозі/лімфомі як у дітей, так і у дорослих (Pear & Aster, 2004, Curr. Opin. Hematol. 11:416-33). 16 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Часта вставка вірусу пухлини молочної залози миші в локуси як Notch1, так і Notch4 в пухлинах молочної залози й отримані в результаті активовані фрагменти білка Notch в першу чергу залучені в передачу сигналів Notch при раку молочної залози (Gallahan & Callahan, 1987, J. Virol 61:66-74; Brennan & Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69; Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7). Подальші дослідження трансгенних мишей підтвердили роль Notch у розгалуженні проток у ході нормального розвитку молочної залози, й конститутивно активна форма Notch4 в епітеліальних клітинах молочної залози інгібує диференціювання епітелію й приводить до утворення пухлин (Jhappan et al., 1992, Genes & Dev. 6:345-5; Gallahan et al., 1996, Cancer Res. 56:1775-85; Smith et al., 1995, Cell Growth Differ. 6:563-77; Soriano et al., 2000, Int. J. Cancer 86:652-9; Uyttendaele et al., 1998, Dev. Biol 196:204-17; Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7). У даний час доказ ролі Notch при раку молочної залози людини обмежений експресією рецепторів Notch при карциномах молочної залози і її кореляцією з результатом хвороби (Weijzen et al., 2002, Nat. Med. 8:979-86; Parr et al., 2004, Int. J. Mol. Med. 14:779-86). Більш того, надекспресію для шляху Notch спостерігали при раку шийки матки (Zagouras et al., 1995, PNAS 92:6414-8)', нирковоклітинному раку (Rae et al., 2000, Int. J. Cancer 88:726-32), плоскоклітинному раку голови й шиї (Leethanakul et al., 2000, Oncogene 19:3220-4), раку ендометрію (Suzuki et al., 2000, Int. J. Oncol. 17:1131-9), і нейробластомах (van Limpt et al., 2000, Med. Pediatr. Oncol. 35:554-8), що вказує на потенційну роль Notch у розвитку низки неоплазій. Цікаво, що передача сигналів Notch може грати роль у підтримці в недиференційованому стані Аре-мутантних неопластичних клітин ободової кишки (van Es & Clevers, 2005, Trends Mol. Med. 11:496-502). Шлях Notch залучений також у багато аспектів розвитку судин, включаючи проліферацію, міграцію, диференціювання гладких м'язів, ангіогенез і артеріально-венозне диференціювання (Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 23:543). Наприклад, гомозиготні нульові мутації в Notch-1/4 і Jagged-1, так само як гетерозиготна втрата Dll4, приводить до важких, хоча й різних, дефектів у розвитку артерій і васкуляризації жовткового мішка. Більш того, для Dll1-дефіцитних і Notch-2-гіпоморфних ембріонів миші показали геморагію, яка, ймовірно, є результатом слабкого розвитку судинних структур (Gale et al., 2004, PNAS, 101:15949-54; Krebs et al., 2000, Genes Dev. 14:1343-52; Xue et al., 1999, Hum. Mel Genet. 8:723-30; Hrabe de Angelis et al., 1997, Nature 386:717-21; McCright et al., 2001, Dev. 128:491-502). У людини мутації в JAGGED1 пов'язані з синдромом Алажіля, порушенням розвитку, що включає дефекти судин, а мутації в NOTCH3 є відповідальними за успадковану судинну деменцію (CADASIL), при якій гомеостаз у судині є дефектним (Joutel et al., 1996, Nature 383:707-10). Ідентифікація DLL4, як експресованого в ракових стволових клітинах у порівнянні з нормальним епітелієм молочної залози, дозволяє передбачати націлювання шляху Notch на знищення не лише більшості клітин, що не викликають утворення пухлини ракових клітин, але також клітин, що викликають утворення пухлини, відповідальних за утворення й повторну появу солідних пухлин. Більш того, через значну роль ангіогенезу в утворенні й підтримці пухлини, націлювання на шлях Notch за допомогою антитіла проти DLL4 також може ефективно інгібувати ангіогенез, позбавляючи злоякісну пухлину живильних речовин і роблячи внесок до її знищення. Таким чином, даний винахід стосується маркера ракової стволової клітини, експресію якого можна аналізувати для діагностики або моніторування захворювання, пов'язаного з раком. У деяких варіантах здійснення експресію маркера ракової стволової клітини визначають за експресією полінуклеотиду, наприклад такого, як мРНК, що кодує маркер ракової стволової клітини. Полінуклеотид можна детектувати й оцінювати кількісно за допомогою будь-якої кількості способів, добре відомих фахівцям у даній галузі. В деяких варіантах здійснення мРНК, що кодує маркер ракової стволової клітини, детектують гібридизацією in situ зрізів тканини, наприклад, з біоптату пацієнта. В деяких варіантах здійснення РНК виділяють з тканини і проводять детекцію, наприклад, за допомогою Нозерн-блотингу, кількісною RT-ПЦР або мікрочіпів. Наприклад, можна виділяти тотальну РНК із зразка тканини, і праймери, які специфічно гібридизуються з маркером ракової стволової клітини й ампліфікують його, можна використовувати для детекції експресії маркерного полінуклеотиду ракової стволової клітини з використанням RT-ПЦР. У конкретних варіантах здійснення експресію маркера ракової стволової клітини можна визначати за допомогою детекції відповідного поліпептиду. Поліпептид можна детектувати й оцінювати кількісно за допомогою будь-якої кількості способів, добре відомих фахівцям у даній галузі. В деяких варіантах здійснення маркерний поліпептид ракової стволової клітини детектують з використанням аналітичних біохімічних способів, наприклад, таких як електрофорез, капілярний електрофорез, високоефективна рідинна хроматографія (HPLC) або 17 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тонкошарова хроматографія (TLC). Виділений поліпептид можна також секвенувати загальноприйнятими способами. В деяких варіантах здійснення білковий маркер ракової стволової клітини детектують за допомогою антитіл, індикованих проти білка, з використанням, наприклад, імунофлуоресценції або імуногістохімії, на зрізах тканин. Альтернативно з антитілами проти маркера ракової стволової клітини можна детектувати експресію, наприклад, ELISA, FACS, Вестерн-блотингу, імунопреципітації або білкових мікрочіпів. Наприклад, можна виділити з біоптату пацієнта ракові стволові клітини й детектувати експресію маркерного білка ракової стволової клітини флуоресцентний мічених антитіл з використанням FACS. За іншим способом клітини, експресуючі маркер ракової стволової клітини, можна детектувати in vivo з використанням мічених антитіл у звичайній системі відеодокументації. Наприклад антитіла, що мітяться парамагнітними ізотопами, можна використовувати для магнітно-резонансної томографії (MRI). У деяких варіантах здійснення даного винаходу діагностичний аналіз включає визначення того, експресується чи ні маркер ракової стволової клітини в пухлинних клітинах, з використанням, наприклад, імуногістохімії, гібридизації in situ або RT-ПЦР. У інших варіантах здійснення діагностичний аналіз включає визначення рівнів експресії маркера ракової стволової клітини з використанням, наприклад, кількісного RT-ПЦР. У деяких варіантах здійснення діагностичний аналіз додатково включає визначення рівнів експресії маркера ракової стволової клітини в порівнянні з контрольною тканиною, наприклад, як-от нормальний епітелій. Детекцію експресії маркера ракової стволової клітини можна потім використовувати для надання прогнозу й вибору терапії. Прогноз може бути заснований на будь-якому відомому ризику, на який вказує експресія маркера ракової стволової клітини. Більш того, детекцію маркера ракової стволової клітини можна використовувати для вибору відповідної терапії, включаючи, наприклад, лікування за допомогою антитіл проти детектованого маркерного білка ракової стволової клітини. У конкретних варіантах здійснення антитіло специфічно зв'язується з позаклітинним доменом маркерного білка ракової стволової клітини, такого як ліганд рецептора Notch, DLL4. У контексті даного винаходу відповідне антитіло є засобом, який може мати один або декілька з наступних ефектів, наприклад: заважати експресії маркера ракової стволової клітини; заважати активації шляху передачі сигналу ракової стволової клітини, наприклад, за допомогою стеричного інгібування взаємодій між маркером ракової стволової клітини і його лігандом, рецептором або співрецепторами; активувати шляхи передачі сигналу ракової стволової клітини, наприклад, за допомогою дії як ліганду або сприяння зв'язуванню ендогенного ліганду; або зв'язуватися з маркером ракової стволової клітини та інгібувати проліферацію пухлинної клітини. У конкретних варіантах здійснення антитіла проти маркера ракової стволової клітини діють поза клітиною для модуляції функції білкового маркера ракової стволової клітини. В деяких варіантах здійснення позаклітинне зв'язування антитіла проти маркера ракової стволової клітини може інгібувати передачу сигналу білковим маркером ракової стволової клітини, наприклад, за допомогою інгібування активації, властивої маркеру ракової стволової клітини (наприклад, кіназної активності), і за допомогою стеричного інгібування взаємодії, наприклад, маркера ракової стволової клітини з його лігандом, з його рецептором, з співрецептором або з позаклітинним матриксом. У деяких варіантах здійснення позаклітинне зв'язування антитіла проти маркера ракової стволової клітини може здійснювати знижуючу регуляцію експресії маркера ракової стволової клітини на поверхні клітини, наприклад, за допомогою інтерналізації білкового маркера ракової стволової клітини або зменшення перенесення маркера ракової стволової клітини на поверхню клітини. В деяких варіантах здійснення позаклітинне зв'язування антитіла проти маркера ракової стволової клітини може стимулювати передачу сигналу білковим маркером ракової стволової клітини, наприклад, за допомогою дії як ліганду-приманки або збільшення зв'язування ліганду. У конкретних варіантах здійснення антитіла проти маркера ракової стволової клітини зв'язуються з білковим маркером ракової стволової клітини і мають один або декілька з наступних ефектів: інгібують проліферацію пухлинних клітин, запускають клітинну смерть пухлинних клітин, стимулюють диференціювання пухлинних клітин у тип клітин з меншою здатністю викликати утворення пухлин або запобігають метастазуванню пухлинних клітин. У конкретних варіантах здійснення антитіла проти маркера ракової стволової клітини запускають клітинну смерть за допомогою кон'югованого токсину, хіміотерапевтичного засобу, радіоактивного ізотопу або іншого такого засобу. Наприклад, антитіло проти маркера ракової стволової клітини кон'югують з токсином, який активується в пухлинних клітинах, експресуючих маркер ракової стволової клітини, за допомогою інтернализації білка. 18 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У конкретних варіантах здійснення антитіла проти маркера ракової стволової клітини опосередкують клітинну смерть клітини, експресуючої білковий маркер ракової стволової клітини, через антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC). ADCC залучає лізис клітин за допомогою ефекторних клітин, які впізнають Fc-фрагмент антитіла. Багато лімфоцитів, моноцитів, тканинних макрофагів, гранулоцитів й еозинофілів, наприклад, мають Fc рецептори й можуть опосередкувати цитоліз (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497). У конкретних варіантах здійснення антитіла проти маркера ракової стволової клітини запускають клітинну смерть клітини, експресуючої білковий маркер ракової стволової клітини за допомогою активації комплемент-залежної цитотоксичності (CDC). CDC залучає зв'язування комплементу сироватки з Fc-фрагментом антитіла й подальшу активацію каскаду білків комплементу, що приводить до руйнування мембрани клітин і можливої клітинної смерті. Відомо, що біологічну активність антитіл у великій мірі визначають константні домени або ділянка Fc молекули антитіла (Uananue and Benacerraf, Textbook of Immunology, 2nd Edition, Williams & Wilkins, р. 218 (1984)). Антитіла різних класів і підкласів відрізняються в цьому відношенні, так само як антитіла того самого підкласу, але з різних видів. З антитіл людини IgM є класом антитіл, що найефективніше зв'язує комплемент, потім слідують IgG1, IgG3 і IgG2, тоді як IgG4, ймовірно, є абсолютно нездатним активувати каскад комплементу (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). Відповідно до даного винаходу отримані антитіла цих класів, що мають бажану біологічну активність. Здатність будь-якого конкретного антитіла проти ракової стволової клітини опосередкувати лізис клітини-мішені за допомогою активації комплементу і/або ADCC можна аналізувати. Клітини, що становлять інтерес, вирощують і мітять in vitro; антитіло додають до культури клітин у поєднанні або з комплементом сироватки, або з імунними клітинами, які можна активувати за допомогою комплексів антигена з антитілом. Цитоліз клітин-мішеней детектують, наприклад, за вивільненням мітки з лігованих клітин. Фактично скринінг антитіл можна проводити з використанням власної сироватки пацієнта як джерела комплементу й/та імунних клітин. Антитіло, яке здатне активувати комплемент або опосередкувати ADCC у тесті in vitro, можна потім використовувати терапевтично для цього конкретного пацієнта. У конкретних варіантах здійснення антитіла проти маркера ракової стволової клітини можуть запускати клітинну смерть, інгібуючи ангіогенез. Ангіогенезом є процес, за допомогою якого нові кровоносні судини формуються з передіснуючих судин, і є фундаментальним процесом, необхідним для нормального зростання, наприклад, під час ембріонального розвитку, загоєння 2 ран і у відповідь на овуляцію. Для зростання солідних пухлин більше 1-2 мм також необхідний ангіогенез для постачання живильними речовинами й киснем, без яких пухлинні клітини гинуть. У конкретних варіантах здійснення антитіло проти маркера ракової стволової клітини націлене на клітини судин, які експресують маркер ракової стволової клітини, включаючи, наприклад, ендотеліальні клітини, гладком'язові клітини, або компоненти позаклітинного матриксу, необхідні для збирання судини. В конкретних варіантах здійснення антитіло проти маркера ракової стволової клітини інгібує передачу сигналу чинником зростання, необхідну для залучення, об'єднання, підтримки або виживання клітин судини. Антитіла проти маркера ракової стволової клітини знаходять вживання в діагностичних і терапевтичних способах, описаних тут. У конкретних варіантах здійснення антитіла за даним винаходом використовують для детекції експресії білкового маркера ракової стволової клітини в біологічних зразках, наприклад, таких як біоптат тканини пацієнта, плевральний випіт або зразок крові. Можна отримувати зрізи біоптатів тканини й детектувати білок, наприклад, імунофлуоресценції або імуногістохімії. Крім того, можна виділяти окремі клітини із зразка й детектувати експресію білка у фіксованих або живих клітинах за допомогою аналізу FACS. У конкретних варіантах здійснення антитіла можна використовувати на білкових чіпах для детекції експресії маркера ракової стволової клітини, наприклад, на пухлинних клітинах, у лізатах клітин або в інших зразках білка. В конкретних варіантах здійснення антитіла за даним винаходом використовують для інгібування зростання пухлинних клітин за допомогою приведення антитіл у контакт з пухлинними клітинами в аналізах на основі клітин in vitro, в моделях на тваринах in vivo і так далі. У конкретних варіантах здійснення антитіла використовують для лікування раку в пацієнта за допомогою введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти маркера ракової стволової клітини. Антитіла за винаходом можна отримувати будь-якими загальноприйнятими способами, відомими в даній галузі. Наприклад, поліклональні антитіла можна отримувати імунізацією тварини (наприклад, кроля, щура, миші, віслюка й так далі) за допомогою множинних підшкірних або внутрішньочеревинних ін'єкцій відповідного антигена (очищеного фрагмента пептиду, повнорозмірного рекомбінантного білка, злитого білка тощо), необов'язково кон'югованого з 19 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гемоціаніном морського блюдечка (KLH), сироватковим альбуміном і так далі, розведеного в стерильному сольовому розчині й об'єднаного з ад'ювантом (наприклад, повним або неповним ад'ювантом Фрейнда) для одержання стабільної емульсії. Потім поліклональне антитіло виділяють з крові, асцитів і т.п. імунізованої таким чином тварини. Зібрана кров згортається, і сироватку декантують, освітлюють центрифугуванням і аналізують за титром антитіла. Поліклональні антитіла можна виділяти з сироватки або асцитів згідно із загальноприйнятими в даній галузі способами, включаючи афінну хроматографію, іонообмінну хроматографію, гельелектрофорез, діаліз тощо. Моноклональні антитіла можна отримувати з використанням способів гібридоми, таких як описані в Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495. З використанням способу гібридоми мишу, хом'яка або іншу відповідну тварину-господаря імунізують, як описано вище, щоб викликати продукцію лімфоцитами антитіл, що специфічно зв'язуються з імунізуючим антигеном. Лімфоцити можна також імунізувати in vitro. Після імунізації лімфоцити виділяють і зливають з відповідною лінією клітин мієломи з використанням, наприклад, поліетиленгліколю для одержання клітин гібридоми, які потім можна відбирати від незлитих лімфоцитів і клітин мієломи. Гібридоми, які продукують моноклональні антитіла, спрямовані специфічно проти вибраного антигена, як визначено імунопреципітацією, імуноблотингом або аналізом зв'язування in vitro (наприклад, радіоімунний аналіз (RIA), твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA)), можна потім розмножувати або в культурі in vitro з використанням загальноприйнятих способів (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986), або in vivo у вигляді асцитних пухлин у тварині. Моноклональні антитіла можна потім очищати з культурального середовища або асцитної рідини, як описано для поліклональних антитіл вище. Альтернативно моноклональні антитіла можна також отримувати з використанням способів рекомбінантної ДНК, як описано в патенті США 4816567. Полінуклеотиди, що кодують моноклональне антитіло, виділяють із зрілих B-клітин або клітин гібридоми, наприклад, за допомогою RT-ПЦР з використанням олігонуклеотидних праймерів, специфічно ампліфікуючих гени, що кодують важкий і легкий ланцюги антитіла, і їх послідовність визначають з використанням загальноприйнятих способів. Виділені полінуклеотиди, що кодують важкий і легкий ланцюги, клонують потім у придатні експресуючі вектори, при трансфекції яких у клітинигосподарі, такі як клітини E. coli, клітини мавпи COS, клітини яєчника китайського хом'яка (CHO) або клітини мієломи, що в інших випадках не продукують імуноглобуліновий білок, клітинигосподарі утворюють моноклональні антитіла. Рекомбінантні моноклональні антитіла або їхні фрагменти з бажаних видів можна також виділяти з бібліотек фагового дисплея, експресуючих CDR з бажаного вигляду, як описано в (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; і Marks et al., 1991, J. Mol. Biol, 222:581-597). Полінуклеотид(и), що кодують моноклональне антитіло, можна далі модифікувати низкою різних способів з використанням способу рекомбінантної ДНК для одержання альтернативних антитіл. У деяких варіантах здійснення константні домени легкого й важкого ланцюгів, наприклад, з моноклонального антитіла миші, можна замінювати на 1) ці ділянки, наприклад, з антитіла людини для одержання химерного антитіла або 2) на поліпептид, що не належить до імуноглобулінів, для одержання злитого антитіла. У деяких варіантах здійснення константні ділянки укорочують або видаляють для одержання бажаного фрагмента антитіла з моноклонального антитіла. Сайт-специфічний або високодозвільний мутагенез варіабельної ділянки можна використовувати для оптимізації специфічності, афінности і т.д. моноклонального антитіла. У деяких варіантах здійснення даного винаходу моноклональне антитіло проти маркера ракової стволової клітини є гуманізованим антитілом. Гуманізованими антитілами є антитіла, що містять мінімальні послідовності з антитіл, що не належать людині (наприклад, мишачих), усередині варіабельних ділянок. Такі антитіла використовують терапевтично для зменшення антигенності й відповідей HAMA (антитіло людини проти антитіла миші) при введенні людині. На практиці, гуманізованими антитілами, як правило, є антитіла людини з мінімумом аж до відсутності послідовностей, що не належать людині. Антитілом людини є антитіло, продуковане людиною, або антитіло, що має амінокислотну послідовність, відповідну антитілу, що продукується людиною. Гуманізовані антитіла можна отримувати з використанням різних способів, відомих у даній галузі. Антитіло можна гуманізувати заміною CDR з антитіла людини на CDR з антитіла, що не належить людині (наприклад, миші, щура, кроля, хом'яка тощо), що має бажану специфічність, афінність і ємкість, слідуючи способам (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). Гуманізоване 20 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіло можна далі модифікувати за допомогою заміни додаткового залишку або у варіабельній людській каркасній ділянці, й/або всередині замінених та що не належать людині залишків, для поліпшення й оптимізації специфічності, афінності та/або ємкості антитіла. Вибір варіабельних доменів важких і/або легких ланцюгів людини для вживання для використання для одержання гуманізованих антитіл може бути важливим для зменшення антигенності. Згідно зі способом "найкращої відповідності" проводять скринінг послідовності варіабельного домену антитіла гризунів проти повної бібліотеки відомих послідовностей амінокислот варіабельних доменів людини. Таким чином, у конкретних варіантах здійснення людську амінокислотну послідовність, найбільш гомологічну послідовності антитіла гризуна, з якої узяті CDR, використовують як людську каркасну ділянку (FR) для гуманізованого антитіла (Sims et al., 1993, J. Immunol, 151:2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol, 196:901). За іншим способом використовують конкретну FR, виведену з консенсусної послідовності всіх людських антитіл конкретної підгрупи легких або важких ланцюгів, і її можна використовувати для декількох різних гуманізованих антитіл (Carter et al., 1992, PNAS, 89; 4285; Presta et al., 1993, J. Immunol, 151:2623). У конкретних варіантах здійснення використовують поєднання способів для відбору варіабельної FR людини для використання для одержання гуманізованих антитіл. Крім того зрозуміло, що антитіла (наприклад, гризунів), що підлягають гуманізації, повинні зберігати високу афінність до антигена, так само як інші сприятливі біологічні властивості. Для досягнення цієї мети гуманізовані антитіла можна отримувати способом аналізу вихідної послідовності антитіла гризуна, що підлягає гуманізації, і різних послідовностей – кандидатів для гуманізації. Тривимірні моделі імуноглобулінів є доступними і відомими фахівцям у даній галузі. Комп'ютерні програми можна використовувати для ілюстрації і виводу на екран можливих тривимірних конформаційних структур вибраних послідовностей антитіл-кандидатів. Дослідження таких моделей дозволяє аналіз можливої ролі залишків у функціонуванні антитіла, що підлягає гуманізації, тобто аналіз залишків, що впливають на здатність імуноглобулінукандидата зв'язувати його антиген. Таким чином, можна вибирати й поєднувати залишки FR з вихідного антитіла й реципієнтного гуманізованого антитіла, так щоб досягати бажаних характеристик антитіла. Як правило, залишки в CDR ділянці впізнавання антигена (або гіперваріабельній ділянці) зберігають з вихідного антитіла (наприклад, антитіла гризуна з бажаними властивостями зв'язування антигена) в гуманізованому антитілі для зв'язування антигена. В конкретних варіантах здійснення щонайменше один додатковий залишок усередині варіабельної FR зберігають з вихідного антитіла в гуманізованому антитілі. В конкретних варіантах здійснення аж до шести додаткових залишків у варіабельній FR зберігають з вихідного антитіла в гуманізованому антитілі. Амінокислоти з варіабельних ділянок зрілих важкого і легкого ланцюгів імуноглобулінів позначають Hx і Lx, відповідно, де x є номером, що позначає положення амінокислоти згідно зі схемою з Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health і Human Services, 1987, 1991. Kabat перераховує багато послідовностей амінокислот для антитіл для кожної підгрупи й перераховує амінокислоту, що зустрічається найчастіше, для кожного положення залишку в кожній підгрупі для одержання консенсусної послідовності. Kabat використовує спосіб для надання номера залишку кожній амінокислоті в перерахованій послідовності, й цей спосіб для надання номерів залишків став стандартним у даній галузі. Схему Kabat можна розширювати на інші антитіла, не включені в його перелік, за допомогою вирівнювання даного антитіла з однією з консенсусних послідовностей за Kabat у співвідношенні з консервативними амінокислотами. З використанням системи нумерації Kabat легко ідентифікувати амінокислоти в еквівалентних положеннях у різних антитілах. Наприклад, амінокислота в положенні L50 антитіла людини займає положення, еквівалентне положенню амінокислоти L50 антитіла миші. Більш того, будь-які дві послідовності антитіла можна однозначно вирівнювати, наприклад, для визначення відсотка ідентичності, з використанням системи нумерації Kabat, так що кожна амінокислота в послідовності одного антитіла є вирівняною з амінокислотою в іншій послідовності, що має той самий номер за Kabat. Після вирівнювання, якщо ділянку даного антитіла (наприклад, повну зрілу варіабельну ділянку важкого або легкого ланцюга) порівнюють з такою ж ділянкою контрольного антитіла, відсоток ідентичності послідовності між ділянками даного й контрольного антитіла є кількістю положень, зайнятих такою самою амінокислотою в ділянці як даного, так і контрольного антитіла, діленою на загальну кількість вирівняних положень двох ділянок, де пропуски не рахують, помножену на 100 для переведення у відсотки. У прикладі 1 нижче описане одержання зразкових гуманізованих антитіл проти DLL4, специфічно зв'язуючих DLL4 людини, маркер ракової стволової клітини з даного опису (21M18 H9L2, депозит в ATCC №№ PTA-8427 і 21M18 H7L2, номер депозиту в ATCC PTA-8425, 21 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 депоновані 10 травня 2007 г.; (American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA)). У конкретних варіантах здійснення гуманізовані антитіла містять ділянку впізнавання антигена, що не належить людині, отриману з моноклонального антитіла миші 21M18. Зокрема, в конкретних варіантах здійснення одну або декілька CDR важкого ланцюга з вихідного антитіла гризуна, CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4, які розрізняються в положенні 52a за Kabat) і CDR3 (SEQ ID NO: 5), зберігають у гуманізованому антитілі 21M18. У конкретних варіантах здійснення одну або декілька з CDR легкого ланцюга вихідного антитіла гризуна, CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 10) і CDR3 (SEQ ID NO: 11), зберігають у гуманізованому антитілі 21M18. У конкретних варіантах здійснення гуманізовані антитіла додатково містять щонайменше одну заміну FR усередині варіабельної ділянки або важкого, або легкого ланцюга людини. У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується гуманізованого антитіла, що специфічно зв'язує епітоп DLL4 людини, сформований поєднанням N-кінцевої ділянки DLL4 людини (SEQ ID NO: 27) і DSL людини (SEQ ID NO: 26), де антитіло впливає на зростання пухлини. В конкретних варіантах здійснення гуманізованим антитілом є інтактне антитіло IgG. У конкретних варіантах здійснення гуманізованим антитілом є інтактне антитіло IgG 2. У конкретних варіантах здійснення гуманізованим антитілом є фрагмент антитіла. У конкретних варіантах здійснення гуманізованим антитілом є фрагмент Fab. У конкретних варіантах здійснення гуманізоване антитіло за даним винаходом містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (VH), що містить ділянку впізнавання антигена, яка не належить людині, й людську варіабельну каркасну ділянку. В конкретних варіантах здійснення ділянка впізнавання антигена, яка не належить людині, містить визначальні комплементарність ділянки (CDR), що походять від гризунів. У конкретних варіантах здійснення ділянка впізнавання антигена, яка не належить людині, містить CDR з антитіла миші. У конкретних варіантах здійснення CDR гризунів отримані з моноклонального антитіла 21M18, де 21M18 містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, позначену SEQ ID NO: 6. У конкретних варіантах здійснення, де гуманізоване антитіло містить ділянку VH, що містить амінокислотну послідовність (a) CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4) і CDR3 (SEQ ID NO: 5) або (b) SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8. У конкретних варіантах здійснення варіабельна каркасна ділянка важкого ланцюга людини містить експресовані послідовності людини. В конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці людини є заміненим. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці важкого ланцюга людини наявний у положенні, вибраному з групи, що складається з 16, 20, 27, 28, 38 і 48, на підставі системи нумерації Kabat. У конкретних варіантах здійснення положення 16, 20, 27, 28, 38 і 48 замінені на підставі системи нумерації Kabat. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці людини замінений на залишок, що займає відповідне положення в антитілі, що містить ділянку впізнавання антигена, що не належить людині. У конкретних варіантах здійснення варіабельна каркасна ділянка важкого ланцюга людини містить IGH(V) 1-18. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці людини є заміненим. В конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці важкого ланцюга людини наявний у положенні, вибраному з групи, що складається з 20H, 28H, 38H, 48H і 69H на підставі системи нумерації Kabat. У конкретних варіантах здійснення положення 20H, 28H, 38H, 48H і 69H замінені на підставі системи нумерації Kabat. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці людини замінений на залишок, що займає відповідне положення в антитілі, що містить ділянку впізнавання антигена, яка не належить людині. У конкретних варіантах здійснення гуманізоване антитіло за даним винаходом містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL), що містить ділянку впізнавання антигена, що не належить людині, й людську варіабельну каркасну ділянку. В конкретних варіантах здійснення ділянка впізнавання антигена, що не належить людині, містить CDR, що походять від гризунів. У конкретних варіантах здійснення ділянка впізнавання антигена, що не належить людині, містить CDR з антитіла миші. У конкретних варіантах здійснення CDR отримані з моноклонального антитіла 21M18, де 21M18 містить ділянку VL, позначену SEQ ID NO: 12. У конкретних варіантах здійснення ділянка VL містить амінокислотну послідовність (a) CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 10) і CDR3 (SEQ ID NO: 11) або (b) SEQ ID NO: 12. У конкретних варіантах здійснення варіабельна каркасна ділянка легкого ланцюга людини містить IGK(V) 4-1. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у 22 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельній каркасній ділянці легкого ланцюга людини є заміненим. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці людини наявний у положенні, вибраному з групи, що складається з 22L і 36L на підставі системи нумерації Kabat. У конкретних варіантах здійснення положення 22L і 36L замінені на підставі системи нумерації Kabat. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок з варіабельної каркасної ділянки людини замінений на залишок, що займає відповідне положення в антитілі, що містить ділянку впізнавання антигена, що не належить людині. У конкретних варіантах здійснення антитіло за даним винаходом є антитілом, що конкурує з антитілом 21M18 за специфічне зв'язування з DLL4 людини, де антитіло 21M18 містить: (a) важкий ланцюг з варіабельною ділянкою, позначеною SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8, і (b) легкий ланцюг з варіабельною ділянкою, позначеною SEQ ID NO: 12. У конкретних варіантах здійснення антитілом є гуманізоване антитіло або антитіло людини. У конкретних варіантах здійснення гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом DLL4 людини, сформованим поєднанням N-кінцевої ділянки DLL4 людини (SEQ ID NO: 27) і домену DSL людини (SEQ ID NO: 26), де антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має щонайменше 90 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має щонайменше 90 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO:12. У деяких варіантах здійснення варіабельна ділянка важкого ланцюга має щонайменше 95 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8, і варіабельна ділянка легкого ланцюга має щонайменше 95 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 12. У деяких варіантах здійснення варіабельна ділянка важкого ланцюга має щонайменше 99 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8, і варіабельна ділянка легкого ланцюга має щонайменше 99 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 12. У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділеної молекули полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом DLL4 людини, сформованим поєднанням N-кінцевої ділянки DLL4 людини (SEQ ID NO: 27) і DSL людини (SEQ ID NO: 26), де антитіло містить ділянку V H, що містить ділянку впізнавання антигена, що не належить людині, кодуючу CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4) і CDR3 (SEQ ID NO: 5), і людську варіабельну каркасну ділянку, кодуючу IGH(V) 1-18. У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділеної молекули полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом DLL4 людини, сформованим поєднанням N-кінцевої ділянки DLL4 людини (SEQ ID NO: 27) і DSL людини (SEQ ID NO: 26), де молекула полінуклеотиду вибрана з групи, що складається з: (a) молекули полінуклеотиду, що кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8, і (b) молекули полінуклеотиду, яка гібридизується з молекулою, комплементарною молекулі полінуклеотиду згідно з (a) в суворих умовах гібридизації. У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділеної молекули полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом DLL4 людини, сформованим поєднанням N-кінцевої ділянки DLL4 людини (SEQ ID NO: 27) і DSL людини (SEQ ID NO: 26), де молекула полінуклеотиду вибрана з групи, що складається з (a) SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 або SEQ ID NO: 15 і (b) молекули полінуклеотиду, яка гібридизується з молекулою, комплементарною молекулі полінуклеотиду згідно з (a) в суворих умовах гібридизації. У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділеної молекули полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом DLL4 людини, сформованим поєднанням N-кінцевої ділянки DLL4 людини (SEQ ID NO: 27) і DSL людини (SEQ ID NO: 26), де антитіло містить ділянку VL, що містить ділянку впізнавання антигена, що не належить людині, кодуючу CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 10) і CDR3 (SEQ ID NO: 11), і людську варіабельну каркасну ділянку, що містить IGK(V) 4-1. У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділеної молекули полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом DLL4 людини, сформованим поєднанням N-кінцевої ділянки DLL4 людини (SEQ ID NO: 27) і DSL людини (SEQ ID NO: 26), де молекула полінуклеотиду вибрана з групи, що складається з: (a) молекули полінуклеотиду, що кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 12 і (b) молекули полінуклеотиду, яка гібридизується з молекулою, комплементарною молекулі полінуклеотиду згідно з (a) в суворих умовах гібридизації. В конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділеної молекули полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом DLL4 людини, сформованим поєднанням N-кінцевої ділянки DLL4 людини (SEQ ID NO: 27) і DSL людини (SEQ ID NO: 26), де молекула полінуклеотиду вибрана з групи, що 23 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 складається з (a) SEQ ID NO: 16 і (b) молекули полінуклеотиду, яка гібридизується з молекулою, комплементарною молекулі полінуклеотиду згідно з (a) в суворих умовах гібридизації. У конкретних варіантах здійснення представлений експресуючий вектор, що містить виділену молекулу полінуклеотиду за даним винаходом. У конкретних варіантах здійснення представлена клітина-господар, що містить експресуючий вектор, що містить виділену молекулу полінуклеотиду за даним винаходом. У конкретних варіантах здійснення даний винахід відноситься до способу лікування раку в пацієнта, що включає введення пацієнтові терапевтично ефективної кількості гуманізованого антитіла за даним описом. У конкретних варіантах здійснення рак включає рак молочної залози, рак ободової й прямої кишки, рак легені, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози або рак голови й шиї. У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується набору, що містить контейнер і композицію, що міститься там, де композиція містить гуманізоване антитіло за даним описом і додатково містить вкладиш в упаковку, який зазначає, що композицію можна використовувати для лікування раку. Крім того, повністю людські антитіла можна отримати безпосередньо з використанням різних способів, відомих у даній галузі. Можна отримати іморталізовані В-лімфоцити людини, імунізовані in vitro або виділені з імунізованого індивідуума, продукуючі антитіло, спрямоване проти антигена-мішені (див., наприклад, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, р. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (l):86-95; і патент США 5750373). Антитіло людини можна також відбирати з фагової бібліотеки, де фагова бібліотека експресує антитіла людини (Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314; Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol, 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol, 222:581). Антитіла людини можна також отримувати в трансгенних мишах, що містять локуси імуноглобулінів людини, які здатні після імунізації продукувати повний репертуар антитіл людини за відсутності продукції ендогенних імуноглобулінів. Цей спосіб описаний у патентах США 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 і 5661016. Цей винахід стосується також біспецифічних антитіл, що специфічно впізнають маркер ракової стволової клітини. Біспецифічні антитіла є антитілами, здатними специфічно впізнавати і зв'язувати щонайменше два різні епітопи. Різні епітопи можуть знаходитися або всередині тієї самої молекули (наприклад, того самого маркерного поліпептиду ракової стволової клітини), або на різних молекулах, так що, наприклад, антитіла можуть специфічно впізнавати і зв'язувати маркер ракової стволової клітини, так само, як, наприклад, 1) ефекторну молекулу на лейкоциті, таку як T-клітинний рецептор (наприклад, CD3) або Fc рецептор (наприклад, CD64, CD32 або CD16), або 2) цитотоксичний засіб, як детально описано нижче. Біспецифічні антитіла можуть бути інтактними антитілами або фрагментами антитіл. Зразкові біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися з двома різними епітопами, щонайменше один з яких походить з поліпептиду за винаходом. Альтернативне анти-антигенне плече молекули імуноглобуліну можна об'єднувати з плечем, яке зв'язується із запускаючою молекулою на лейкоциті, як-от молекула T-клітинного рецептора (наприклад CD2, CD3, CD28 або B7), або Fc рецептори для IgG, так щоб сфокусувати клітинні механізми захисту на клітині, експресуючій конкретний антиген. Біспецифічні антитіла можна також використовувати, щоб спрямовувати цитотоксичні засоби до клітин, які експресують конкретний антиген. Ці антитіла мають антигензв'язуюче плече й плече, що зв'язує цитотоксичний засіб або хелатор радіоактивного ізотопу, такий як EOTUBE, DPTA, DOTA або TETA. Способи одержання біспецифічних антитіл є загальноприйнятими в даній галузі (Millstein et al., 1983, Nature 305:537539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et al., 1991, EMSOJ. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368; і патент США 5731168). Мають на увазі також антитіла більш ніж з двома валентностями. Наприклад, можна отримувати триспецифічні антитіла (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)). У конкретних варіантах здійснення представлений фрагмент антитіла, наприклад, для збільшення проникнення в пухлину. Відомі різні способи для одержання фрагментів антитіл: традиційно ці фрагменти отримують за допомогою протеолітичного розщеплювання інтактних антитіл (наприклад, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81). У конкретних варіантах здійснення фрагменти антитіл отримують рекомбінантним чином. Фрагменти антитіл Fab, Fv і scFv всі можна експресувати в E. coli і секретувати з неї або інших клітин-господарів, таким чином, забезпечуючи одержання великих кількостей цих фрагментів. Такі фрагменти антитіл можна також виділяти з фагових бібліотек антитіл, що обговорюються вище. Фрагмент антитіла може також бути лінійними 24 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитілами, як описано, наприклад, у патенті США 5641870, і може бути моноспецифічним або біспецифічним. Інші способи для одержання фрагментів антитіл будуть очевидними практикуючому фахівцеві в даній галузі. Відповідно до даного винаходу способи можна адаптувати для одержання одноланцюгових антитіл, специфічних для поліпептиду за винаходом (див. патент США № 4946778). Крім того, способи можна адаптувати для конструювання експресуючих бібліотек Fab (Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989)), щоб дозволяти швидку й ефективну ідентифікацію моноклональних фрагментів Fab з бажаною специфічністю для ліганду рецептора Notch DLL4 або його похідних, фрагментів або гомологів. Фрагменти антитіл, що містять ідіотипи до поліпептиду за винаходом, можна отримувати способами з даної галузі, включаючи як необмежуючі приклади: (a) фрагмент F(ab')2, отриманий розщеплюванням пепсином молекули антитіла; (b) фрагмент Fab, отриманий відновленням дисульфідних містків фрагмента F(ab')2; (c) фрагмент Fab, отриманий обробкою молекули антитіла папаїном і поновлюючим засобом, і (d) фрагменти Fv. Може додатково бути бажаним, особливо в разі фрагментів антитіл, модифікувати антитіло, щоб збільшити час його напівжиття в сироватці. Цього можна досягати, наприклад, включенням епітопа зв'язування рецептора порятунку у фрагмент антитіла за допомогою мутації відповідної ділянки фрагмента антитіла або за допомогою включення епітопа в пептидну мітку, яку потім зливають з фрагментом антитіла або на кінці, або всередині (наприклад, за допомогою синтезу ДНК або пептиду). Гетерокон'юговані антитіла також входять в обсяг даного винаходу. Гетерокон'юговані антитіла складені з двох ковалентно зв'язаних антитіл. Такі антитіла запропоновані, наприклад, для націлювання імунних клітин на небажані клітини (патент США № 4676980). Передбачають, що антитіла можна отримувати in vitro з використанням відомих способів хімії синтезу білка, включаючи способи, що включають засоби для перехресного зшивання. Наприклад, імунотоксини можна конструювати з використанням реакції дисульфідного обміну або за допомогою формування тіоефірного зв'язку. Приклади відповідних реагентів для цієї мети включають імінотіолат і метил-4-меркаптобутиримідат. Для цілей даного винаходу слід брати до уваги, що модифіковані антитіла можуть містити будь-який тип варіабельної ділянки, яка забезпечує зв'язок антитіла з поліпептидами DLL4 людини. В цьому відношенні варіабельна ділянка може міститися в будь-якому типі або бути отриманою з будь-якого типа ссавця, якого можна індукувати для підйому гуморальної відповіді й одержання імуноглобулінів проти бажаного асоційованого з пухлиною антигена. Через це варіабельна ділянка модифікованих антитіл може походити, наприклад, з людини, миші, примату, що не належить до людини (наприклад, яванських макак, макак і т.д.), або вовчих. У деяких варіантах здійснення як варіабельні, так і константні ділянки модифікованих імуноглобулінів є людськими. В інших варіантах здійснення варіабельні ділянки відповідних антитіл (як правило, отриманих з джерела, що не стосується людини) можна конструювати або специфічно пристосовувати для поліпшення властивостей зв'язування або зменшення імуногенності молекули. В цьому відношенні варіабельні ділянки, застосовні за даним винаходом, можна гуманізувати або іншим чином змінювати за допомогою включення імпортованих послідовностей амінокислот. Варіабельні домени як у важких, так і в легких ланцюгах змінюють, щонайменше, частковою заміною однієї або декількох CDR і, якщо необхідно, частковою заміною каркасної ділянки й зміною послідовності. Хоча CDR можна отримувати з антитіла того самого класу або навіть підкласу, як і антитіло, з якого отримані каркасні ділянки, передбачають, що CDR будуть отримані з антитіла іншого класу й переважно з антитіла з іншого вигляду. Може не бути необхідним замінювати всі CDR на повні CDR з донорної варіабельної ділянки для перенесення антигензв'язуючої здатності одного варіабельного домену до іншого. Радше, може бути необхідним лише перенести ті залишки, які необхідні для підтримки активності ділянки зв'язування антигена. Зважаючи на пояснення, наведені в патентах США №№5585089, 5693761 і 5693762, це буде повністю в межах компетенції фахівців у даній галузі, або за допомогою виконання загальноприйнятих експериментів, або за допомогою тестування методом спроб і помилок для одержання функціонального антитіла зі зменшеною імуногенністю. Попри зміни у варіабельній ділянці, фахівці в даній галузі братимуть до уваги, що модифіковані антитіла за даним винаходом включатимуть антитіла або їхні імунореактивні фрагменти, в яких щонайменше частина з одного або декількох доменів константної ділянки делетовані або іншим чином змінені для забезпечення бажаних біохімічних характеристик, таких як покращувана локалізація пухлини або зменшений час напівжиття в сироватці в порівнянні з антитілом приблизно такої самої імуногенності, що містить нативну або незмінену константну ділянку. В деяких варіантах здійснення константна ділянка модифікованого антитіла 25 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 міститиме людську константну ділянку. Модифікації константної ділянки, сумісні з цим винаходом, включають додавання, делеції або заміни однієї або декількох амінокислот в одному або декількох доменах. Тобто модифіковані антитіла, описані тут, можуть містити зміни або модифікації одного або декількох з трьох константних доменів важкого ланцюга (CH1, CH2 або CH3) і/або константного домену легкого ланцюга (CL). У деяких варіантах здійснення винаходу передбачають модифіковані константні ділянки, де один або декілька доменів є частково або повністю делетованими. В деяких варіантах здійснення модифіковані антитіла міститимуть конструкції або варіанти з делетованими доменами, де видалений цілий домен CH2 (конструкції ΔCH2). У деяких варіантах здійснення видалений домен константної ділянки замінюватимуть на короткий амінокислотний спейсер (наприклад, 10 залишків), що забезпечує певну частину гнучкості молекули, як правило, забезпечуваною відсутньою константною ділянкою. В даній галузі відомо, що, окрім своєї конфігурації, константна ділянка опосередкує декілька ефекторних функцій. Наприклад, зв'язування компонента комплементу C1 з антитілами активує систему комплементу. Активація комплементу є важливою для опсонізації й лізису клітинних патогенів. Активація комплементу також стимулює запальну відповідь і може також бути залученою в аутоіммунну гіперчутливість. Крім того, антитіла зв'язуються з клітинами через ділянку Fc, за допомогою ділянки рецептора Fc у ділянці Fc антитіла, що зв'язується з рецептором Fc (FсR) на клітині. Існує низька рецепторів Fc, які є специфічними для різних класів антитіла, включаючи IgG (гамма-рецептори), IgE (ета-рецептори), IgA (альфа-рецептори) і IgM (мю-рецептори). Зв'язування антитіла з рецепторами Fc на поверхнях клітин запускає низку важливих і різноманітних біологічних відповідей, включаючи поглинання й руйнування покритих антитілом часток, кліренс імунних комплексів, лізис покритих антитілом клітин-мішеней клітинами-кілерами (називаний антитілозалежною опосередкованою клітинами цитотоксичністю або ADCC), вивільнення медіаторів запалення, передачу через плаценту й контроль продукції імуноглобуліну. Хоча різні рецептори Fc і ділянки рецепторів вивчені до певної міри, існує ще багато невідомого про їх локалізацію, структуру й функціонування. Без обмеження обсягу даного винаходу вважають, що антитіла, що містять константні ділянки, модифіковані, як описано в даному описі, забезпечують змінені ефекторні функції, які, у свою чергу, впливають на біологічний профіль введеного антитіла. Наприклад, делеція або інактивація (за допомогою точкових мутацій або інших способів) домену константної ділянки може зменшувати зв'язування рецептора Fc з циркулюючим модифікованим антитілом, таким чином, покращуючи локалізацію пухлини. В інших випадках може бути наявним те, що модифікації константної ділянки відповідно до даного винаходу зменшують зв'язування комплементу й, таким чином, зменшують час напівжиття в сироватці і неспецифічне зв'язування кон'югованого цитотоксину. Інші модифікації константної ділянки можна використовувати для видалення дисульфідних зв'язків або олігосахаридних груп, що дозволяє покращувану локалізацію завдяки збільшеній антигенній специфічності або гнучкості антитіла. Так само, модифікації константної ділянки згідно з цим винаходом можна легко здійснити з використанням добре відомих біохімічних способів або способів молекулярної інженерії повністю в межах компетенції фахівця в даній галузі. Слід зазначити, що модифіковані антитіла можна конструювати для злиття домену CH3 безпосередньо з шарнірною ділянкою відповідного модифікованого антитіла. В інших конструкціях може бути бажаним надати пептидний спейсер між шарнірною ділянкою й модифікованими доменами CH2 і CH3. Наприклад, можна експресувати сумісні конструкції, де домен CH2 делетований, і залишковий домен CH3 (модифікований або немодифікований) приєднаний до шарнірної ділянки за допомогою спейсера з 5-20 амінокислот. Такий спейсер можна додавати, наприклад, щоб гарантувати, що регуляторні елементи константного домену залишаються вільними й доступними, або що шарнірна ділянка залишається гнучкою. Проте слід зазначити, що в деяких випадках можна довести, що амінокислотні спейсери є імуногенними й викликають небажану імунну відповідь проти конструкції. Відповідно будь-якій спейсер, що додається до конструкції, має бути відносно неімуногенним або навіть зовсім виключеним, якщо можна зберегти бажані біохімічні якості модифікованого антитіла. Слід розуміти, що, окрім делеції цілих доменів константної ділянки, антитіла за даним винаходом можна отримувати за допомогою часткової делеції або заміни декількох або навіть окремої амінокислоти. Наприклад, мутація окремої амінокислоти у вибраних ділянках домену CH2 може бути достатньою, щоб переважно зменшити зв'язування Fc і таким чином поліпшити локалізацію пухлини. Так само, може бути бажаним просто делетувати ту частину одного або декількох доменів константної ділянки, яка контролює ефекторну функцію (наприклад, зв'язування комплементу CLQ), що підлягає модуляції. Такі часткові делеції константних ділянок 26 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 можуть покращувати вибрані характеристики антитіла (час напівжиття в сироватці), в той же час залишаючи незайманими інші бажані функції, зв'язані з даним доменом константної ділянки. Більш того, як згадано вище, константні ділянки описаних антитіл можна модифікувати за допомогою мутації або заміни однієї або декількох амінокислот, що покращує параметри отриманої конструкції. В цьому відношенні може бути можливим порушити активність, що забезпечується консервативною ділянкою зв'язування (наприклад, зв'язування Fc), в той же час по суті зберігаючи конфігурацію й імуногенний профіль модифікованого антитіла. Конкретні варіанти здійснення можуть містити додавання однієї або декількох амінокислот до константної ділянки для посилення бажаних характеристик, таких як ефекторна функція, або забезпечення більшого приєднання цитотоксину або вуглеводу. В таких варіантах здійснення може бути бажаним вставляти або повторювати специфічні послідовності, отримані з вибраних доменів константної ділянки. Крім того, даний винахід стосується варіантів і еквівалентів, які є по суті гомологічними химерним, гуманізованим і людським антитілам або фрагментам цих антитіл, указаним тут. Вони можуть містити, наприклад, мутації - консервативні заміни, тобто заміну однієї або декількох амінокислот на схожі амінокислоти. Наприклад, консервативна заміна відноситься до заміни однієї амінокислоти на іншу всередині того самого загального класу, наприклад, однієї кислої амінокислоти на іншу кислу амінокислоту, однієї основної амінокислоти на іншу основну амінокислоту або однієї нейтральної амінокислоти на іншу нейтральну амінокислоту. Що мають на увазі під консервативною амінокислотною заміною, добре відомо в даній галузі. Винахід стосується також імунокон'югатів, що містить антитіло, кон'юговане з цитотоксичним засобом. Цитотоксичні засоби включають хіміотерапевтичні засоби, що інгібують зростання засобу, токсини (наприклад, ферментативний активний токсин, що походить з бактерій, грибів, рослин або тварин, або його фрагменти), радіоактивні ізотопи (тобто радіокон'югат) і так далі. Хіміотерапевтичні засоби, застосовні для одержання таких імунокон'югатів, включають, наприклад, метотрексат, адріаміцин, доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин C, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалюючі засоби. Ферментативні активні токсини та їхні фрагменти, які можна використовувати, включають ланцюг A дифтерійного токсину, незв'язуючі активні фрагменти дифтерійного токсину, ланцюг A екзотоксину, ланцюг A рицину, ланцюг A абрину, ланцюг A модецину, альфа-сарцин, білки Aleurites fordii, білки-діантини, білки Phytolaca americana (PAPI, PAPII і PAP-S), інгібітор momordica charantia, курцин, кротин, інгібітор sapaonaria officinalis, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени. В деяких варіантах здійснення антитіла можна кон'югувати з радіоактивними ізотопами, такими як 90 125 131 123 111 105 153 67 67 166 177 186 188 Y, I, I, I, In, Rh, Sm, Cu, Ga, Ho, Lu, Re і Re, з використанням будьякого з низки добре відомих хелаторів або прямого мічення. В інших варіантах здійснення описані композиції можуть містити антитіла, приєднані до лікарських засобів, проліків або лімфокінів, як-от інтерферон. Кон'югати антитіла й цитотоксичного засобу отримують з використанням безлічі біфункціональних засобів для зшивання білків, таких як N-сукцинімідил3-(2-піридилдитіол)пропіонат (SPDP), імінотіолан (IT), біфункціональні похідні імідоефірів (такі як диметиладипімідат HCl), активні складні ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі як глутаральдегід), біс-азидосполуки (такі як біс(п-азидобезоїл)гександіамін), похідні бісадіазонію (такі як біс-(п-діазонійбезоїл)етилендіамін), діізоціанати (такі як толуол-2,6-діізоціанат) і біс-активні сполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Кон'югати антитіла й одного або декількох низькомолекулярних токсинів, таких як каліхеаміцин, майтанзиноїди, трихотецен і CC1065, і похідних цих токсинів, що мають активність токсину, також можна використовувати. В деяких варіантах здійснення можна отримувати комплекси модифікованих антитіл з іншими імунологічно активними лігандами (наприклад, антитілами або їхніми фрагментами), де отримана молекула зв'язується як з неопластичною клітиною, так і з ефекторною клітиною, якот T-клітина. Незалежно від того, яким чином отримані застосовні параметри, антитіла за даним винаходом можна використовувати в будь-якій з низки кон'югованих (тобто імунокон'югат) або некон'югованих форм. Альтернативно антитіла за даним винаходом можна використовувати в некон'югованій або "голій" формі, щоб використовувати природні механізми захисту суб'єкта, включаючи комплемент-залежну цитотоксичність (CDC) і антитілозалежну клітинну токсичність (ADCC) для знищення злоякісних клітин. Вибір, яке з кон'югованого або некон'югованого модифікованого антитіла використовувати, залежатиме від типу й стадії раку, використання допоміжного лікування (наприклад, хіміотерапії або зовнішнього опромінення) й стану пацієнта. Слід розуміти, що фахівець у даній галузі може легко зробити такий вибір з урахуванням пояснень тут. 27 UA 110315 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіла за даним винаходом можна аналізувати за імуноспецифічним зв'язуванням за допомогою будь-якого способу, відомого в даній галузі. Імуноаналізи, які можна використовувати, включають як необмежуючі приклади, конкурентні й неконкурентні системи аналізу з використанням таких способів, як аналіз BIAcore, аналіз FACS, імунофлуоресценція, імуноцитохімія, Вестерн-блотинг, радіоімунні аналізи, ELISA, "сендвіч"-імуноаналізи, аналізи імунопреципітації, реакції преципітації, реакції преципітації з дифузією в гелі, аналізи імунодифузії, аналізи аглютинації, аналізи зв'язування комплементу, імунорадіометричні аналізи, флуоресцентні імуноаналізи й імуноаналізи з білком A. Такі аналізи є загальноприйнятими й добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, наведений тут як посилння в повному обсязі). У деяких варіантах здійснення імуноспецифічність антитіла проти маркера ракової стволової клітини визначають з використанням ELISA. Аналіз ELISA включає одержання антигена, покриття лунок 96-лункового мікропланшета для титрування антигеном, додавання антитіла проти маркера ракової стволової клітини, кон'югованого зі сполукою, що піддається детекції, якот субстрат ферменту (наприклад, пероксидази хріну або лужної фосфатази), в лунки, інкубацію протягом певного часового проміжку й детекцію наявності антигену. В деяких варіантах здійснення антитіло проти маркера ракової стволової клітини не є кон'югованим зі сполукою, що піддається детекції, але замість цього в лунку додають вторинне кон'юговане антитіло, яке впізнає антитіло проти маркера ракової стволової клітини. В деяких варіантах здійснення замість покриття лунки антигеном лунки можна покривати антитілом проти маркера ракової стволової клітини, і вторинне антитіло, кон'юговане зі сполукою, що піддається детекції, можна додавати після додавання антигена в покриту лунку. Фахівець в даній галузі буде обізнаний як про параметри, які можна модифікувати для збільшення детектованого сигналу, так і про інші варіанти ELISA, відомі в даній галузі (див., наприклад, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1). Афінність зв'язування антитіла з антигеном-маркером ракової стволової клітини і швидкість дисоціації при взаємодії антитіло-антиген можна визначати за допомогою конкурентних аналізів зв'язування. Одним прикладом конкурентного аналізу зв'язування є радіоімунний аналіз, що 3 125 включає інкубацію міченого антигена (наприклад, H або I), або його фрагмента або варіанту, з антитілом, що становить інтерес, за наявності збільшуваних кількостей неміченого антигену, з подальшою детекцією антитіла, пов'язаного з міченим антигеном. Афінність антитіла проти маркера ракової стволової клітини й швидкості дисоціації при зв'язуванні можна визначити з даних за допомогою аналізу графіка Ськетчарда. В деяких варіантах здійснення аналіз кінетики BIAcore використовують для визначення швидкостей зв'язування й дисоціації антитіл проти маркера ракової стволової клітини. Аналіз кінетики BIAcore включає аналіз зв'язування й дисоціації антитіл по чіпах з імобілізованими антигенами - маркерами ракової стволової клітини на їх поверхні. У конкретних варіантах здійснення винахід стосується виділених полінуклеотидів, які кодують поліпептид, що містить антитіло або його фрагмент, проти DLL4 людини. Таким чином, термін "полінуклеотид, що кодує поліпептид" стосується полінуклеотиду, що включає лише кодуючі послідовності для поліпептиду, так само як полінуклеотиду, що включає додаткові кодуючі й некодуючі послідовності. Полінуклеотиди за винаходом можуть бути присутніми у формі РНК або у формі ДНК. ДНК включає кДНК, геномну ДНК й синтетичну ДНК і може бути дволанцюжковою або одноланцюжковою, і, якщо є однолнцюжковою, може бути кодуючим ланцюгом або некодуючим (антисмисловим) ланцюгом. Крім того, даний винахід стосується варіантів описаних тут вище полінуклеотидів, що кодують, наприклад, фрагменти, аналоги й похідні. Варіант полінуклеотиду може бути алельним варіантом полінуклеотиду, що зустрічається в природі, або варіантом полінуклеотиду, що не зустрічається в природі. В конкретних варіантах здійснення полінуклеотид може мати кодуючу послідовність, що є алельним варіантом, що зустрічається в природі, кодуючої послідовності описаних поліпептидів. Як відомо в даній галузі, алельний варіант є альтернативною формою послідовності полінуклеотиду, що має, наприклад, заміну, делецію або додавання одного або декількох нуклеотидів, які по суті не змінюють функцію кодованого поліпептиду. У конкретних варіантах здійснення полінуклеотиди містять кодуючу послідовність для зрілого поліпептиду, злитого в тій самій рамці зчитування з полінуклеотидом, що допомагає, наприклад, експресії й секреції поліпептиду з клітини-господаря (наприклад, лідерна послідовність, яка функціонує як секреторна послідовність для контролю транспорту поліпептиду з клітини). Поліпептид, що має лідерну послідовність, являє собою пребілок і може мати лідерну послідовність, що відщеплюєтьсяклітиною-господарем для формування зрілої 28