Коагоніст глюкагонового рецептора/glp-1-рецептора

Реферат: Винахід належить до пептиду або його фармацевтично прийнятної солі, які демонструють підвищену активність на GLP-1-рецепторі, порівняно з нативним глюкагоном, фармацевтичної композиції, що містить вказаний пептид або його фармацевтично прийнятну сіль, способу лікування та їх застосування. UA 114792 C2 (12) UA 114792 C2 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднені заявки [0001] Ця заявка претендує на пріоритет за попередньою заявкою на патент США № 61/500,027, поданою 22 червня 2011 року, і попередньою заявкою на патент США № 61/547,360, поданою 14 жовтня 2011 року, зміст яких включений у цей опис у повному обсязі шляхом посилання. Включення шляхом посилання матеріалу, представленого в електронному вигляді [0002] Шляхом посилання в повному обсязі включений зчитуваний комп'ютером лістинг нуклеотидних/амінокислотних послідовностей, представлений водночас із цією заявкою та ідентифікований у такий спосіб: текстовий файл АСИ розміром 15 кілобайт, який має ім'я "07012KLJPCT_JSequence_Listing.txt", створений 25 травня 2012 року. Передумови створення винаходу [0003] Препроглюкагон являє собою поліпептид-попередник, що складається зі 158 амінокислот, піддається процесингу в різних тканинах з утворенням низки різних проглюкагонових пептидів, у тому числі глюкагона, глюкагоноподобного пептиду-1 (GLP-1), глюкагоноподобного пептиду-2 (GLP-2) та оксинтомодуліна (ОХМ), які беруть участь у різноманітних фізіологічних процесах, у тому числі в глюкозному гомеостазі, секреції інсуліну, випорожненні шлунка, розвитку кишечника, а також у регулюванні споживання їжі. Глюкагон являє собою пептид, який складається із 29 амінокислот, які відповідають амінокислотам 33-61 препроглюкагона, у той час як GLP-1 продукується у вигляді пептиду довжиною у 37 амінокислот, які відповідають амінокислотам 72-108 препроглюкагона. Амід GLP-1 (7-36) або кислота GLP-1 (7-37) є біологічно активними формами GLP-1, що демонструють по суті еквівалентну активність на GLP-1-рецепторі. [0004] При гіпоглікемії, коли рівень глюкози у крові падає нижче нормального рівня, глюкагон сигналізує печінці про необхідність розщеплення глікогену та виділення глюкози, що викликає підвищення вмісту глюкози у крові до нормального рівня. Гіпоглікемія являє собою поширений негативний ефект інсулінової терапії у хворих з гіперглікемією (підвищеним рівнем глюкози), викликаною діабетом. Таким чином, найбільш визнаною роллю глюкагона в системі глюкозної регуляції є нейтралізація впливу інсуліну та підтримка рівня глюкози у крові на постійному рівні. [0005] GLP-1 має іншу біологічну активність у порівнянні з глюкагоном. До числа його впливів належить стимулювання синтезу та секреції інсуліну, пригнічення секреції глюкагона та зменшення споживання їжі. Було показано, що GLP-1 знижує тяжкість гіперглікемії у хворих на діабет. Екзендин-4, - пептид з отрути ящірок, амінокислотний склад якого майже на 50 % збігається з амінокислотним складом GLP-1, - активує GLP-1-рецептор і, як було показано, знижує тяжкість гіперглікемії у хворих на діабет. [0006] Є також дані про те, що GLP-1 і екзендин-4 можуть зменшувати споживання їжі та стимулювати зниження маси тіла, тобто чинити вплив, що є благотворним не тільки для хворих на діабет, але й для пацієнтів, які страждають на ожиріння. У пацієнтів, які страждають на ожиріння, спостерігається підвищений ризик розвитку діабету, гіпертензії, гіперліпідемії, серцево-судинних захворювань і захворювань опорно-рухового апарату. Сутність винаходу [0007] У цьому описі винаходу розкриті пептиди та варіантні пептиди, які демонструють активність на глюкагоновому рецепторі, активність на GLP-1-рецепторі або активність як на глюкагоновому, так і на GLP-1 -рецепторі. У певних прикладах здійснення цього винаходу розкриті в цьому описі пептиди та варіантні пептиди демонструють підвищену активність на GLP-1-рецепторі у порівнянні з нативним глюкагоном. За певними аспектами цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють щонайменше 100-разову селективність до GLP-1 рецептора людини у порівнянні з GIP-рецептором. [0008] У цьому описі також пропонуються кон'югати, які містять будь-які з пептидів і варіантних пептидів, розкритих у цьому описі, при чому ці пептиди та варіантні пептиди кон'юговані в гетерологічну складову. За певними аспектами цього винаходу гетерологічна складова є пептидом або білком, і згаданий кон'югат є гібридним пептидом або химерних пептидом. За типовими аспектами цього винаходу гетерологічна складова являє собою полімер, наприклад, поліетиленгліколь. У цьому описі також розкриті димери і мультимери, які містять будь-який із пептидів або варіантних пептидів, розкритих у цьому описі. [0009] Крім того, в цьому описі розкриті фармацевтичні композиції, які містять будь-який із пептидів і варіантних пептидів, розкритих у цьому описі, і фармацевтично прийнятний носій, а також спосіб лікування або попередження захворювання чи стану (наприклад, метаболічного синдрому, діабету, ожиріння. стеатозу печінки, нейродегенеративного захворювання, гіпоглікемії) у пацієнта. Спосіб включає введення хворому розкритих у цьому описі пептидів або варіантних пептидів, факультативно введених до складу фармацевтичної композиції, у кількості, ефективній для лікування згаданого захворювання або стану. 1 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Короткий опис фігур [0010] Фіг. 1 являє собою графік зміни сукупної маси тіла (у грамах) DIO мишей (мишей з ожирінням, викликаним дієтою), яким вводили контрольний носій або дозу пептиду SEQ ID NO: 12, 17, 18 або 19, як детально розкрито в Прикладі 7. [0011] Фіг. 2 являє собою графік базального рівня глюкози (мг/дл) DIO мишей, яким вводили контрольний носій або дозу пептиду SEQIDNO: 12, 17, 18 або 19, як детально розкрито в Прикладі 7. [0012] Фіг. 3А являє собою графік зміни сукупної маси тіла (%) макак-резус, які страждають на ожиріння та яким вводили контрольний носій, ліраглютид (Lira) або дозу пептиду SEQ ID NO: 17 чи 20, як детально розкрито в Прикладі 8. [0013] Фіг. 3В являє собою графік сукупного споживання їжі (вираженого як відсоток від споживання їжі за День 0) макак-резус, які страждають на ожиріння та яким вводили контрольний носій, ліраглютид або дозу пептиду SEQIDNO: 17 чи 20, як детально розкрито в Прикладі 8. [0014] Фіг. 4 являє собою графік рівня глюкози у крові (мг/дл) макак-резус, які страждають на діабет та яким вводили контрольний носій або дозу пептиду SEQ ID NO: 17, як детально розкрито в Прикладі 9. Детальний опис Визначення [0015] Термін "приблизно", вжитий в цьому описі, означає, що значення або діапазон значень більші або менші зазначеного на 10 %, але він не призначений для позначення будьякого значення або діапазону значень тільки цим більш широким визначенням. Кожне(-ен) значення або діапазон значень, якому передує термін "приблизно", також охоплює варіант здійснення цього винаходу, що відповідає згаданому абсолютному значенню або діапазону значень. [0016] Термін "фармацевтично прийнятний носій", вжитий в цьому описі, охоплює будь-який із звичайних фармацевтичних носіїв, таких як забуферений фосфатом сольовий розчин, вода, емульсії (такі як емульсія олії у воді або емульсія води в олії) і зволожуючі засоби різних типів. Згаданий термін охоплює також будь-який з агентів, схвалених органом регулювання Федерального уряду США або наведених у Фармакопеї США для застосування на тваринах, включаючи людей. [0017] Термін "фармацевтично прийнятна сіль", вжитий в цьому описі, означає солі сполук, які зберігають біологічну активність вихідної сполуки і які не є небажаними ані в біологічному, ні в інших відношеннях. Багато сполук, розкритих у цьому описі, здатні утворювати кислі та/або основні солі внаслідок присутності аміногруп і/або карбоксильних груп чи груп, подібних до них. [0018] Фармацевтично прийнятні солі приєднання основи можуть бути отримані з неорганічних і органічних основ. До солей, що походять від неорганічних основ, належать (тільки як приклад) солі натрію, калію, літію, амонію, кальцію і магнію. До солей, що походять від органічних основ, належать (але без обмеження ними) солі первинних, вторинних і третинних амінів. [0019] Термін "лікування", вжитий в цьому описі, охоплює профілактику певного розладу чи стану або полегшення тяжкості симптомів, пов'язаних із певним розладом чи станом, та/або запобігання або ліквідацію згаданих симптомів. Наприклад, термін "лікування діабету", вжитий в цьому описі, загалом стосуватиметься зміни рівня глюкози у крові в напрямку нормального рівня, і може охоплювати підвищення або зниження рівня глюкози у крові, залежно від ситуації. [0020] Термін "ефективна" кількість або "терапевтично ефективна" кількість глюкагонового пептиду, вжитий в цьому описі, означає нетоксичну, але достатню кількість пептиду для забезпечення досягнення бажаного ефекту. Наприклад, одним із бажаних ефектів було б запобігання або лікування гіперглікемії, дієвість якого визначають, наприклад, за зміною рівня глюкози у крові ближче до нормального, або ініціювання зменшення маси тіла/запобігання приросту маси тіла, дієвість яких визначають, наприклад, за зменшенням маси тіла, або запобігання або зниження приросту маси тіла, або нормалізація розподілу жирової тканини. Кількість, яка є "ефективною", буде відрізнятися від суб'єкта до суб'єкта залежно від віку і загального стану індивіда, способу введення тощо. Таким чином, не завжди можливо визначити точну "ефективну" кількість". Однак прийнятна "ефективна" кількість у будь-якому окремому випадку може бути визначена фахівцем у цій галузі на основі загальноприйнятої практики експериментування. [0021] Термін "парентерально" означає введення не через травний тракт, а якимось іншим шляхом, наприклад, підшкірним, внутрішньом'язовим, інтраспинальним або внутрішньовенним. [0022] Термін "пептид", вжитий в цьому описі, означає послідовність із 3 або більше амінокислот, як правило, менше ніж 100 амінокислот, де згадані амінокислоти є природними, 2 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або кодованими, або штучними, або некодованими, амінокислотами. Термін "штучні амінокислоти" означає амінокислоти, які не зустрічаються in vivo у природних умовах, але які, тим не менш, можуть бути включені в пептидні структури, розкриті в цьому описі. Термін "некодована", вжитий в цьому описі, має відношення до амінокислот, які не є L-ізомером будьякої з наведених далі 20 амінокислот: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr. Термін "кодована", вжитий в цьому описі, має відношення до амінокислот, які є L-ізомером будь-якої з наступних 20 амінокислот: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Туг. У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди і варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, мають приблизно таку саму довжину, як SEQ ID NO: I (яка має довжину 29 амінокислот), наприклад, довжину 25-35 амінокислот. Наприклад, пептид може мати довжину 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,49 або 50 амінокислот. [0023] Як правило, поліпептиди і білки мають полімери, довжина яких більша ніж довжина "пептидів". [0024] Усі посилання в описі на певні номери положень амінокислоти (наприклад, положення 28) мають відношення до амінокислоти в цьому положенні в нативному глюкагоні (послідовність SEQ ID NO: 1) або до положення відповідної амінокислоти в будь-якому з його аналогів. Наприклад, посилання в описі на "положення 28" означатиме відповідне положення 27 для аналога глюкагона, у якому перша амінокислота послідовності SEQ ID NO: 1 була вилучена. Так само посилання в описі на "положення 28" означатиме відповідне положення 29 для аналога глюкагона, в якому перед N-кінцем послідовності SEQ ID NO: 1 була додана одна амінокислота. Термін "амінокислотна модифікація", вжитий в цьому описі, означає (і) заміщення або заміну амінокислоти SEQ ID NO: 1 іншою амінокислотою (природною, або кодованою, або некодованою, або штучною амінокислотою), (іі) додавання амінокислоти (природної, або кодованої, або некодованої, або штучної амінокислоти) у SEQ ID NO: 1 або (ііі) видалення однієї або кількох амінокислот із SEQ ID NO: 1. [0025] Термін "відсоток ідентичності" по відношенню до двох амінокислотних послідовностей означає кількість амінокислот першої послідовності, які збігаються (ідентичні) з амінокислотами у другій еталонній послідовності, поділену на довжину цієї еталонної послідовності, коли згадані дві послідовності вибудувані в такий спосіб, щоб досягти максимальної відповідності (наприклад, для оптимального вирівнювання можуть бути введені розриви). [0026] Термін амінокислотна "модифікація" означає введення, видалення або заміщення однієї амінокислоти на іншу. У певних варіантах здійснення цього винаходу заміщення або заміна амінокислоти є консервативним амінокислотним заміщенням, наприклад, консервативним заміщенням амінокислоти в одному або кількох положеннях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 або 29. Термін "консервативне амінокислотне заміщення", вжитий в цьому описі, означає заміну однієї амінокислоти іншою амінокислотою, що має подібні властивості, наприклад, розмір, заряд, гідрофобність, гідрофільність і/або ароматичність, і охоплює перестановки всередині однієї з таких п'яти груп: I. Невеликі аліфатичні, неполярні або трохи полярні, залишки: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; II. Полярні, негативно заряджені, залишки та їх аміди й складні ефіри: Asp, Asn, Glu, Gin, цистеїнова кислота та гомоцистеїнова кислота; llІ. Полярні, позитивно заряджені, залишки: His, Arg, Lys; орнітин (Οπα) IV. Великі аліфатичні неполярні залишки: Met, Leu, He, Val, Cys, норлейцин (Nle), гомоцистеїн V. Великі ароматичні залишки: Phe, Туг, Тгр, ацетилфенілаланін. [0027] У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислотне заміщення не є консервативним амінокислотним заміщенням, будучи, наприклад, неконсервативним амінокислотним заміщенням. [0028] Термін "заряджена амінокислота" або "заряджений залишок", вжитий в цьому описі, означає амінокислоту, яка містить бічний ланцюг, негативно заряджений (тобто депротонований) або позитивно заряджений (тобто протонований), у водному розчині при фізіологічному рН. Наприклад, до негативно заряджених амінокислот належать аспарагінова кислота, глутамінова кислота, цистеїнова кислота, гомоцистеїнова кислота і гомоглутамінова кислота, у той час як до позитивно заряджених амінокислот належать аргінін, лізин та гістидин. До заряджених амінокислот належать заряджені амінокислоти з числа 20 кодованих амінокислот, а також атипові або штучні, чи некодовані, амінокислоти. [0029] Термін "кисла амінокислота", вжитий в цьому описі, означає амінокислоту, яка містить другу кислу складову (за винятком карбокислотної групи амінокислоти), включаючи, наприклад, карбокислотну або сульфокислотну групи. 3 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0030] Термін "ацильована амінокислота", вжитий в цьому описі, означає амінокислоту, яка містить ацильну групу, що не є нативною для природної амінокислоти, незалежно від того, яким способом вона отримана (наприклад, ацилювання перед включенням амінокислоти в пептид або ацилювання після включення в пептид). [0031] Термін "алкілована амінокислота", вжитий в цьому описі, означає амінокислоту, яка містить алкільну групу, що не є нативною для природної амінокислоти, незалежно від того, яким способом вона отримана. Відповідно, ацильовані та алкіловані амінокислоти цього опису є некодованими амінокислотами. [0032] Термін "селективність" молекули до першого рецептора відносно другого рецептора, вжитий в цьому описі, означає таке відношення: ECso молекули на другому рецепторі, поділена на ЕС50 молекули на першому рецепторі. Наприклад, молекула, яка має ЕС501 нМ на першому рецепторі та ЕС50 100 нМ на другому рецепторі, має 100-разову селективність до першого рецептора відносно другого рецептора. [0033] Термін "нативний глюкагон", вжитий в цьому описі, означає пептид, що містить послідовність SEQIDNO:1;, а термін "нативний GLP-1" являє собою узагальнюючий термін, що означає амід GLP-1(7-36), кислоту GLP-1(1-37) або суміш двох цих сполук. [0034] Термін "ефективність глюкагона" або "ефективність у порівнянні з нативним глюкагоном" молекули, вжитий в цьому описі, означає зворотне відношення: ЕС50 молекули на глюкагоновому рецепторі, поділена на ЕС50 нативного глюкагона на глюкагоновому рецепторі. [0035] Термін "ефективність GLP-1" або "ефективність у порівнянні з нативним GLP-1" молекули, вжитий в цьому описі, означає зворотне відношення: ЕС50 молекули на GLP-1рецепторі, поділена на ЕС50 нативного GLP-1 на GLP-1-рецепторі. Варіанти здійснення винаходу [0036] У цьому описі винаходу розкриті пептиди та варіантні пептиди, які демонструють активність на GLP-1-рецепторі, на глюкагоновому рецепторі або як на GLP-1-рецепторі, так і на глюкагоновому рецепторі. У цьому відношенні в описі винаходу розкриті пептиди-агоністи GLP-1 -рецептора, пептиди-агоністи глюкагонового рецептора та пептиди-коагоністи GLP-1рецептораУглюкагонового рецептора. У певних прикладах здійснення цього винаходу розкриті в цьому описі пептиди і варіантні пептиди демонструють підвищену активність або більш високу ефективність на GLP-1-рецепторі у порівнянні з нативним глюкагоном людини (SEQIDNO:1). У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють більш високу ефективність на GLP-1-рецепторі у порівнянні з нативним GLP-1 людини (SEQ ID NO: 2) або одній з його активних форм (SEQ ID NO: 5 та 6). У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють більш високу ефективність на глюкагоновому рецепторі у порівнянні з нативним GLP-1 людини. У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють більш високу ефективність на глюкагоновому рецепторі у порівнянні з нативним глюкагоном людини. [0037] У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють інші поліпшення у властивостях відносно нативного глюкагона або нативного GLP-1, як то більш висока стабільність, більш висока розчинність, пролонгований напівперіод існування в системі кровообігу, відтермінований початок дії, збільшена тривалість дії, притуплений пік (наприклад, відносно знижене середнє пікове значення концентрації в плазмі) і покращена стійкість до протеазів, таких як DPP-IV. [0038] Пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, мають в основі амінокислотну послідовність нативного глюкагона людини (SEQIDNO: 1), і розкриті в цьому описі як "пептиди", "варіантні пептиди", "аналоги глюкагона", "аналоги" або "глюкагонові пептиди". Слід мати на увазі, що такі терміни як "аналог", або "варіант", або "модифікація" охоплюють пептиди чи протеши, що синтезовані de novo і не потребують проведення якого-небудь етапу модифікації. За деякими аспектами цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, містять модифіковану амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, що містить 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 амінокислотних модифікацій відносно SEQ ID NO: 1, і в певних випадках 16 або більше (наприклад, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26) амінокислотних модифікацій, як описано нижче. Подальший опис аналогів глюкагона та/або глюкагонових пептидів, таким чином, може застовуватися до будь-яких описаних тут пептидів і варіантних пептидів, незалежно від ступеня подібності між нативним глюкагоном людини (SEQ ID NO: 1) і пептидом або варіантним пептидом, що відповідають цьому опису. [0039] Передбачається, що кожна з пептидних послідовностей, розкритих у цьому описі, може бути надалі змінена шляхом включення додаткових амінокислотних модифікацій; наприклад, шляхом включення будь-якох з модифікацій, розкритих у цьому описі, наприклад, у положеннях, розкритих у цьому описі, або шляхом включення консервативних заміщень, або 4 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шляхом повернення до амінокислоти нативного глюкагона (дивися SEQ ID NO: 1) в цьому положенні. У певних прикладах здійснення цього винаходу до модифікацій відносяться, наприклад, ацилювання, алкілування, пегілювання, укорочення на С-кінці, заміщення амінокислоти в одному або кількох із положень 1, 2, З, 7, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 27, 28 і 29. Наприклад, у місці, де будь-яка з пептидних послідовностей, розкритих у цьому описі, містить Cys для пегілювання, варіантний пептид може використовувати іншу амінокислоту для пегілювання. Як інший приклад, варіантний пептид може бути пегільваний в іншому положенні (наприклад, заміною існуючого Cys іншою амінокислотою, вставленням нового Cys у запропонованому положенні пегілювання і пегілюванням нового Cys). Як ще один приклад, у місці, де будь-яка з пептидних послідовностей, розкритих у цьому описі, включає Lys для ацилювання, згаданий Lys може бути переміщений в інше положення, і в цьому новому положенні ацильований. У будь-якому з варіантів здійснення цього винаходу, розкритих у цьому описі, варіантні пептиди можуть бути, наприклад, на 80 %, 85 %, 90 % або 95 % ідентичні вихідним пептидам за довжиною вихідних пептидів або за амінокислотами 1-29 вихідного пептиду (наприклад, можуть включати 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових модифікацій у порівнянні з вихідним пептидом). [0040] Кон'югати, гібридні білки і мультімери будь-якої з послідовностей пептидів, описаних в цьому документі, також охоплюються цим винаходом. Активність пептидів та варіантних пептидів Агоністична активність на глюкагоновому рецепторі [0041] У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють ЕС50 на глюкагоновому рецепторі приблизно 1000 мкМ або менше (наприклад, приблизно 750 мкМ або менше, приблизно 500 мкМ або менше, приблизно 250 мкМ або менше, приблизно 100 мкМ або менше, приблизно 75 мкМ або менше, приблизно 50 мкМ або менше, приблизно 25 мкМ або менше, приблизно 10 мкМ або менше, приблизно 5 мкМ або менше, приблизно 1 мкМ або менше). У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють ЕС50 для активації глюкагонового рецептора, яка знаходиться в наномолярному діапазоні. Наприклад, розкриті в цьому описі пептиди та варіантні пептиди демонструють ЕС50 на глюкагоновому рецепторі, яка складає приблизно 1000 нМ або менше (наприклад, приблизно 750 нМ або менше, приблизно 500 нМ або менше, приблизно 250 нМ або менше, приблизно 100 нМ або менше, приблизно 75 нМ або менше, приблизно 50 нМ або менше, приблизно 25 нМ або менше, приблизно 10 нМ або менше, приблизно 5 нМ або менше, приблизно 1 нМ або менше). У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють ЕС 50 на глюкагоновому рецепторі, яка знаходиться в пікомолярному діапазоні. Відповідно, за деякими аспектами цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють ЕС 50 для активації глюкагонового рецептора приблизно 1000 пМ або менше (наприклад, приблизно 750 пМ або менше, приблизно 500 пМ або менше, приблизно 250 пМ або менше, приблизно 100 пМ або менше, приблизно 75 пМ або менше, приблизно 50 пМ або менше, приблизно 25 пМ або менше, приблизно 10 пМ або менше, приблизно 5 пМ або менше, приблизно 1 пМ або менше). Зрозуміло, що більш низька ЕС50 є ознакою більш високої активності чи ефективності на згаданому рецепторі. [0042] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналоги глюкагона, розкриті в цьому описі, демонструють ЕС50 на глюкагоновому рецепторі, яка складає приблизно 0,001 пМ або більше, приблизно 0,01 пМ або більше чи приблизно 0,1 пМ або більше. Активація глюкагонового рецептора (активність глюкагонового рецептора) може бути визначена з використанням in vitro досліджень, вимірюванням індукції цАМФ у клітинах НЕК293, гіперекспресуючих глюкагоновий рецептор, наприклад, шляхом дослідження клітин НЕК293, котрансфікованих ДНК, що кодує глюкагоновий рецептор і ген люциферази, пов'язаний із цАМФчутливим елементом, як розкрито в Прикладі 2. [0043] У певних прикладах здійснення цього винаходу розкриті в цьому описі пептиди та варіантні пептиди демонструють приблизно 0,001 % або більше, приблизно 0,01 % або більше, приблизно 0,1 % або більше, приблизно 0,5 % або більше, приблизно 1 % або більше, приблизно 5 % або більше, приблизно 10 % або більше, приблизно 20 % або більше, приблизно 30 % або більше, приблизно 40 % або більше, приблизно 50 % або більше, приблизно 60 % або більше, приблизно 75 % або більше, приблизно 100 % або більше, приблизно 125 % або більше, приблизно 150 % або більше, приблизно 175 % або більше, приблизно 200 % або більше, приблизно 250 % або більше, приблизно 300 % або більше, приблизно 350 % або більше, приблизно 400 % або більше, приблизно 450 % або більше чи приблизно 500 % або більше активність на глюкагоновому рецепторі відносно нативного глюкагона (глюкагонова ефективність). У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, 5 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розкриті в цьому описі, демонструють приблизно 5000 % або менше чи приблизно 10000 % або менше активність на глюкагоновому рецепторі відносно нативного глюкагона. Активність аналогів глюкагона на рецепторі відносно нативного ліганда рецептора обчислюють як обернене відношення ЕС50 для аналога глюкагона до нативного ліганда. [0044] У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють істотну активність (ефективність) тільки на глюкагоновому рецепторі і практично повну відсутність активності на GLP-1 рецепторі. Відповідно, у певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди розглядають як "чисті агоністи глюкагонового рецептора" або не розглядають як "коагоністи глюкагонового рецептора/GLP-l-рецептора". У певних варіантах здійснення цього винаходу згадані пептиди та варіантні пептиди демонструють будь-який із рівнів активності чи ефективності на глюкагоновому рецепторі, розкритому в цьому описі, але мають значно нижчу активність (ефективність) на GLP-1рецепторі. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона демонструє ЕС 50 на GLP-1-рецепторі, яка у 100 разів або більше перевищує ЕС50 на глюкагоновому рецепторі. Агоністична активність на GLP-1-рецепторі [0045] У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють ЕС50 для активації GLP-1-рецептора приблизно 1000 мкМ або менше (наприклад, приблизно 750 мкМ або менше, приблизно 500 мкМ або менше, приблизно 250 мкМ або менше, приблизно 100 мкМ або менше, приблизно 75 мкМ або менше, приблизно 50 мкМ або менше, приблизно 25 мкМ або менше, приблизно 10 мкМ або менше, приблизно 5 мкМ або менше чи приблизно 1 мкМ або менше). У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють ЕС50 на GLP-1-рецепторі приблизно 1000 нМ або менше (наприклад, приблизно 750 нМ або менше, приблизно 500 нМ або менше, приблизно 250 нМ або менше, приблизно 100 нМ або менше, приблизно 75 нМ або менше, приблизно 50 нМ або менше, приблизно 25 нМ або менше, приблизно 10 нМ або менше, приблизно 5 нМ або менше чи приблизно 1 нМ або менше). У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди мають ЕС50 на GLP-1-рецепторі, яка знаходиться в пікомолярному діапазоні. Відповідно, у певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють ЕС50 для активації GLP-1-рецептора приблизно 1000 пМ або менше (наприклад, приблизно 750 пМ або менше, приблизно 500 пМ або менше, приблизно 250 пМ або менше, приблизно 100 пМ або менше, приблизно 75 пМ або менше, приблизно 50 пМ або менше, приблизно 25 пМ або менше, приблизно 10 пМ або менше, приблизно 5 пМ або менше чи приблизно 1 пМ або менше). Слід мати на увазі, що більш низька ЕС50 свідчить про вищу активність чи ефективність на рецепторі. [0046] У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють ЕС 50 на GLP-1-рецепторі, яка складає приблизно 0,001 пМ або більше, приблизно 0,01 пМ або більше чи приблизно 0,1 пМ або більше. Активація GLP-1 рецептора (активність GLP-1-рецептора) може бути визначена з використанням in vitro досліджень вимірюванням індукції цАМФ у клітинах НЕК293, гіперекспресуючих GLP-1рецептор, наприклад, дослідженням клітин НЕК293, котрансфікованих ДНК, що кодує GLP-1 рецептор і ген люциферази, пов'язаний із цАМФ-чутливим елементом, як розкрито в Прикладі 2. [0047] У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють приблизно 0,001 % або більше, приблизно 0,01 % або більше, приблизно 0,1 % або більше, приблизно 0,5 % або більше, приблизно 1 % або більше, приблизно 5 % або більше, приблизно 10 % або більше, приблизно 20 % або більше, приблизно 30 % або більше, приблизно 40 % або більше, приблизно 50 % або більше, приблизно 60 % або більше, приблизно 75 % або більше, приблизно 100 % або більше, приблизно 125 % або більше, приблизно 150 % або більше, приблизно 175 % або більше, приблизно 200 % або більше, приблизно 250 % або більше, приблизно 300 % або більше, приблизно 350 % або більше, приблизно 400 % або більше, приблизно 450 % або більше чи приблизно 500 % або більше активність на GLP-1-рецепторі відносно нативного GLP-1 (GLP-1 ефективність). У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють приблизно 5000 % або менше чи приблизно 10000 % або менше активність на GLP-1-рецепторі у порівнянні з нативним GLP-1 (GLP-1-ефективність). [0048] У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють істотну активність (ефективність) тільки на GLP-1-рецепторі і практично ніякої активності на глюкагоновому рецепторі. У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди розглядають як "чисті агоністи GLP-1-рецептора" або не розглядають як "коагоністи глюкагонового рецептора/GLP-l-рецептора". У певних варіантах здійснення цього винаходу згадані пептиди та варіантні пептиди демонструють будь-який із рівнів активності чи 6 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ефективності на GLP-1-рецепторі, розкритому в цьому описі, але мають значно меншу активність (ефективність) на глюкагоновому рецепторі. У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють ЕС50 на глюкагоновому рецепторі, яка 100-разово або більше перевищує ЕС50 на GLP-1-рецепторі. Агоністична активність на GLP-1-рецепторі та глюкагоновому рецепторі [0049] У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють активність як на GLP-1 -рецепторі, так і на глюкагоновому рецепторі, і можуть розглядатися як "коагоністи глюкагонового рецептора/GLP-l-рецептора". У певних прикладах здійснення цього винаходу активність (наприклад, ЕС50, відносна активність, або ефективність) пептидів та варіантних пептидів на глюкагоновому рецепторі відрізняється в приблизно 50 разів, приблизно 40 разів, приблизно 30 разів, приблизно 20 разів, приблизно 10 разів або приблизно 5 разів (більше або менше) від його активності (наприклад, ЕС 50, відносної активності, або ефективності) на GLP-1-рецепторі. За деякими аспектами цього винаходу глюкагонова ефективність пептиду або варіантного пептиду відрізняється в приблизно 25, приблизно 20, приблизно 15, приблизно 10 або приблизно 5 разів (більше або менше) від його GLP-1ефективності. За деякими аспектами цього винаходу глюкагонова ефективність пептиду або варіантного пептиду менша в приблизно 25, приблизно 20, приблизно 15, приблизно 10 або приблизно 5 разів, ніж його GLP-1-ефективність. [0050] У певних прикладах здійснення цього винаходу коагоніст має приблизно рівну ефективність або відносно більш ефективний на GLP-1-рецепторі, ніж на глюкагоновому рецепторі. Наприклад, відношення відносної активності, EC50, або ефективності пептиду або варіантного пептиду на глюкагоновому рецепторі до відносної активності, ЕС 50, або ефективності пептиду або варіантного пептиду на GLP-1-рецепторі менше або приблизно дорівнює X, де X вибраний зі 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 або 5. У певних прикладах здійснення цього винаходу відношення ЕС50, ефективності, або відносної активності пептиду чи варіантного пептиду на глюкагоновому рецепторі до ЕС50, ефективності, або відносної активності пептиду чи варіантного пептиду на GLP-1 -рецепторі приблизно дорівнює 1 і менше ніж 5 (наприклад, приблизно 4, приблизно 3, приблизно 2, приблизно 1). У певних прикладах здійснення цього винаходу відношення ЕСбо, або ефективності, або відносної активності пептиду або варіантного пептиду на GLP-1-рецепторі до ЕС50, ефективності, або відносної активності пептиду чи варіантного пептиду на глюкагоновому рецепторі менше ніж 5 (наприклад, приблизно 4, приблизно 3, приблизно 2, приблизно 1). У певних прикладах здійснення цього винаходу відношення глюкагонової ефективності пептиду або варіантного пептиду до GLP-1-ефективності пептиду або варіантного пептиду менше або приблизно дорівнює Y, де Υ вибраний із 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 і 5. У певних прикладах здійснення цього винаходу відношення глюкагонової ефективності пептиду або варіантного пептиду до GLP-1-ефективності пептиду або варіантного пептиду менше ніж 5 (наприклад, приблизно 4, приблизно 3, приблизно 2, приблизно 1). У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона має ЕС50 на глюкагоновому рецепторі, яка у 2-Ю разів (наприклад, у 2 рази, у 3 рази, у 4 рази, у 5 разів, у 6 разів, у 7 разів, у 8 разів, у 9 разів, у 10 разів) більша, ніж ECsoHa GLP-1-рецепторі. [0051] У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди, насамперед, є агоністами глюкагону і є відносно більш ефективними на глюкагоновому рецепторі, ніж на GLP-1-рецепторі (наприклад, пептид у 5 або більше разів ефективніший на глюкагоновому рецепторі у порівнянні з GLP-1-рецептором). Наприклад, відношення відносної активності, ефективності, або ЕС 50 пептиду або варіантного пептиду на GLP-1-рецепторі до відносної активності, ефективності, або ЕС50 пептиду або варіантного пептиду на глюкагоновому рецепторі менше або приблизно дорівнює V, де V вибраний із 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 або 5. У певних варіантах здійснення цього винаходу відношення GLP-1-ефективності пептиду або варіантного пептиду до глюкагонової ефективності пептиду або варіантного пептиду менше або приблизно дорівнює W, де W вибраний із 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 і 5. У певних варіантах здійснення цього винаходу пептид або варіантний пептид демонструє щонайменше 0,1 % (наприклад, приблизно 0,5 % або більше, приблизно 1 % або більше, приблизно 5 % або більше, приблизно 10 % або більше, або більше) від активності нативного GLP-1 на GLP-1 -рецепторі (GLP-1-ефективність), а також демонструє щонайменше 0,1 % (наприклад, приблизно 0,5 % або більше, приблизно 1 % або більше, приблизно 5 % або більше, приблизно 10 % або більше, чи більше) від активності нативного глюкагона на глюкагоновому рецепторі (глюкагонова ефективність). Активність на GIP-рецепторі [0052] Поряд з активністю на глюкагоновому рецепторі та/або GLP-1-рецепторі, пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, за деякими аспектами цього винаходу демонструють 7 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 низьку агоністичну активність на GIP-рецепторі. За такими аспектами цього винаходу переважно такі пептиди та варіантні пептиди є щонайменше 100-разово селективними для GLP-1рецептора у порівнянні з GIP-рецептором. [0053] Однак в інших аспектах цього винаходу пептид або варіантний пептид демонструє помітну активність на GIP-рецепторі, наприклад, ЕС50 аналога на GIP-рецепторі менше ніж 50разово відрізняється від його ЕС50 на GLP-1-рецепторі, факультативно за цими аспектами, де GIP ефективність аналога знаходиться в межах 50-разової GLP-1-ефективності аналога. У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди демонструють ЕС 50 для активації GIPрецептора приблизно 1 мкМ або менше, чи 100 нМ або менше, чи приблизно 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 нМ або менше. Слід звернути увагу, що більш низька ЕС50 свідчить про вищу активність чи ефективність на рецепторі. У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють ЕС 50 на GIP-рецепторі, яка складає приблизно 0,001 нМ, 0,01 нМ або 0,1 нМ. У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють ЕС 50 на GIP-рецепторі, яка складає не більше ніж приблизно 100 нМ. Активація рецептора може бути визначена з використанням in vitro досліджень, через вимірювання індукції цАМФ у клітинах НЕК293, гіперекспресуючих GLP1-рецептор, наприклад, через дослідження клітин НЕК293, котрансфікованих ДНК, що кодує GLP-1-рецептор і ген люциферази, пов'язаний із цАМФ-чутливим елементом, як розкрито в Прикладі 2. [0054] У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють щонайменше приблизно 0,1 %, 1 %, 10 %, 50 %, 100 %, 150 %, 200 % або вищу активність на GIP-рецепторі у порівнянні з нативним GIP (GIP ефективність). У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють не більше ніж 1000 %, 10000 %, 100000 % або 1000000 % активність на GIP-рецепторі відносно нативного GIP. Активність (ефективність) глюкагонового пептиду на рецепторі у порівнянні з нативним лігандом рецептора розраховується як зворотне відношення ЕС50 для пептиду до нативного ліганду. [0055] Таким чином, за одним з аспектів цього винаходу пропонуються пептиди та варіантні пептиди, які демонструють активність і на глюкагоновому, і на GIP-рецепторі ("коагоністи глюкагон/GIP"). У певних варіантах здійснення цього винаходу ЕС50 пептиду на GIP-рецепторі менше ніж у приблизно 50 разів, 40 разів, 30 разів або 20 разів відрізняється (у більший або менший бік) від його ЕС50 на глюкагоновому рецепторі. У певних варіантах здійснення цього винаходу GIP-ефективність пептиду менше ніж у приблизно 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10 або 5 разів відрізняється (у більший або менший бік) від його глюкагонової ефективності. У певних варіантах здійснення цього винаходу GLP-1-активність значно знижена або пригнічена, - наприклад, шляхом амінокислотної модифікації в положенні 7, видаленням амінокислоти(-от), розташованої(-их) у С-кінцевому напрямку відносно амінокислоти в положенні 27 або 28, або їх комбінації. [0056] За альтернативними аспектами цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють активність на GLP-1 і GIP-рецепторах, але не демонструють значної активності на глюкагоновому рецепторі ("коагоністи GIP/GLP-1"), наприклад, внаслідок амінокислотної модифікації Gin у положенні 3. Наприклад, заміщення в цьому положенні кислою, основною або гідрофобною амінокислотою (глутаміновою кислотою, орнітином, норлейцином) знижує глюкагонову активність. За іншими аспектами цього винаходу пептиди та варіантні пептиди демонструють активність на кожному з рецепторів: глюкагоновому, GIP та і GLP-1-рецепторі ("тріагоністи глюкагон/GIP/GLP-l"). Наприклад, за будьяким з цих останніх аспектів цього винаходу ЕС 50 пептиду на GIP-рецепторі в менше ніж приблизно 50 разів, 40 разів, 30 разів або 20 разів відрізняються (у більший або менший бік) від його ЕС50 на GLP-1-рецепторі. У певних варіантах здійснення цього винаходу GIP ефективність пептиду менше ніж у приблизно 25, 20, 15, 10 або 5 разів відрізняється (у більший або менший бік) від його GLP-1 ефективності. У певних варіантах здійснення цього винаходу ці пептиди мають приблизно 10 % або менше активності нативного глюкагона на глюкагоновому рецепторі, наприклад, приблизно 1-10 %, або приблизно 0,1-10 %, або більше ніж приблизно 0,1 %, але менше ніж приблизно 10 %. Активність кон 'югатів [0057] У певних варіантах здійснення цього винаходу пептиди та варіантні пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють активність або ефективність на глюкагоновому рецепторі, та/або активність на GLP-1-рецепторі, та/або активність на GIP-рецепторі, як було розкрито вище, і, коли пептид і варіантний пептид є частиною кон'югата (наприклад, кон'югований і з гетерологичною складовою, наприклад, гідрофільною складовою, наприклад, 8 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліетиленгліколем), пептид або варіантний пептид демонструє активність, яка є нижчою (тобто нижчу ефективність або вищу ЕС50), ніж коли цей пептид або варіантний пептид не є частиною кон'югата. За деякими аспектами цього винаходу пептид або варіантний пептид, коли він не є частиною кон'югата, демонструє ефективність на глюкагоновому рецепторі та/або GLP-1рецепторі, яка в приблизно 10 або більше разів перевищує ефективність цього пептиду або варіантного пептиду, коли він є частиною кон'югата. За деякими аспектами цього винаходу пептид або варіантний пептид, коли він некон'югований, демонструє ефективність на глюкагоновому рецепторі та/або GLP-1-рецепторі, яка в приблизно 10 разів, приблизно 15 разів, приблизно 20 разів, приблизно 25 разів, приблизно 30 разів, приблизно 35 разів, приблизно 40 разів, приблизно 45 разів, приблизно 50 разів, приблизно 100 разів або навіть більше разів перевищує ефективність цього пептиду або варіантного пептиду, коли він кон'югований. Структура аналогів глюкагона [0058] Ацилювання [0059] Відповідно до певних варіантів здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить ацильовану амінокислоту (наприклад, некодовану ацильовану амінокислоту (наприклад, амінокислоту, яка містить ацильну групу, що не є нативною для природної амінокислоти)). Ацильована амінокислота в певних варіантах здійснення цього винаходу надає аналогу глюкагона одну або більше з таких характеристик, як (і) збільшений напівперіод існування в системі кровообігу, (іі) відстрочений початок дії, (ііі) збільшена тривалість дії, (iv) поліпшена резистентність до протеазів, таких як DPP-IV, і (ν) підвищена ефективність на GLP-1-рецепторі та/або глюкагоновому рецепторі. Як розкрито в цьому описі, ацильовані аналоги глюкагона не демонструють знижену активність на глюкагоновому рецепторі та GLP-1-рецепторі у порівнянні з відповідним неацильованим аналогом глюкагона. Швидше, у певних випадках ацильовані аналоги глюкагона фактично демонструють підвищену активність на GLP-1-рецепторі та глюкагоновому рецепторі. Таким чином, ефективність ацильованих аналогів глюкагона порівнянна, якщо не вища, за ефективність неацильованих варіантів аналогів глюкагона. [0060] Згідно з одним з варіантів здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить ацильну групу, яка приєднана до аналогу глюкагона через складноефірний, тіоефірний або амідний зв'язок із метою збільшення напівперіоду існування в системі кровообігу, та/або відтермінування початку дії, та/або збільшення тривалості дії, та/або поліпшення резистентності до протеазів, таких як DPP-IV. [0061] Ацилювання можна здійснювати в будь-якому положенні в межах аналога глюкагона, включаючи будь-яке з положень 1-29, положення в С-кінцевому напрямку відносно 29-ї амінокислоти (наприклад, положення 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 тощо, положення в межах С-кінцевого подовжувального сегмента або на С-кінці), за умови, що глюкагонова та/або GLP-1 активність зберігається, якщо не збільшується. Необмежувальні приклади вибирають з групи, яку складають положення 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 або 29. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить ацильовану амінокислоту в одному або кількох положеннях, вибраних із групи, яку складають положення 9, 10, 12, 16 і 20. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить ацильовану амінокислоту в одному або кількох положеннях, вибраних із групи, яку складають положення 10, 12 і 16. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить ацильовану амінокислоту в одному або кількох положеннях, вибраних із групи, яку складають положення 9, 10, 12, 16 і 20. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить ацильовану амінокислоту в одному або кількох положеннях із положень 10 і 12. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить ацильовану амінокислоту в положенні 12. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить Скінцевий подовжувальний сегмент і ацильовану амінокислоту в одному або кількох положеннях, вибраних із групи, яку складають положення 9, 10, 12, 16, 20 і 37-43 (наприклад, 40). У певних варіантах здійснення цього винаходу ацилювання відбувається в положенні 10 аналога глюкагона, і цей аналог глюкагона не має внутрішньомолекулярного містка, наприклад, ковалентного внутріпшьомолекулярного містка (наприклад, лактамного містка). Такі ацильовані аналоги глюкагона, що не мають внутрішньомолекулярного містка, демонструють підвищену активність на GLP-1-рецепторі і глюкагоновому рецепторі у порівнянні з відповідними неацильованими аналогами, які не мають ковалентного внутрішньомолекулярного містка, і у порівнянні з відповідними аналогами, які не мають внутрішньомолекулярного містка, і які ацельовані в будь-якому положенні, крім положення 10. Як розкрито в цьому описі, ацилювання в положенні 10 може навіть перетворити аналог глюкагона, що має невелику активність на 9 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 глюкагоновому рецепторі, на аналог глюкагона, що має активність як на глюкагоновому рецепторі, так і на GLP-1-рецепторі. Отже, положення, у якому відбувається ацилювання, може змінювати загальний профіль активності аналога глюкагона. [0062] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона ацильований у тому ж амінокислотному положенні, в якому приєднана гідрофільна складова, або в іншому амінокислотному положенні. До необмежувальних прикладів належать ацилювання в положенні 10 і пегілювання в одному або кількох положеннях в С-кінцевій частині аналога глюкагона, наприклад, у положенні 24, 28 або 29, у межах С-кінцевого подовжувального сегмента або на Скінці (наприклад, шляхом додавання С-кінцевого Cys). [0063] Ацильна група може бути ковалентно пов'язана безпосередньо з амінокислотою аналога глюкагона або опосередковано з амінокислотою аналога глюкагона через спейсер, який розташований між амінокислотою аналога глюкагона та ацильною групою. [0064] В одному з конкретних аспектів цього винаходу для введення ацильної групи аналог глюкагона модифікований шляхом прямого ацилювання аміногрупи, гідроксильної групи або тіолової групи бічного ланцюга амінокислоти аналога глюкагона. У певних варіантах здійснення цього винаходу ацилювання здійснюється в положенні 10, 20, 24 або 29 аналога глюкагона. Таким чином, ацильований аналог глюкагона може містити амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1 або її модифіковану амінокислотну послідовність, яка містить одну або більше амінокислотних модифікацій, розкритих у цьому описі, із щонайменше однією з амінокислот у положеннях 10, 20, 24 і 29 згаданого аналога, модифікованої в амінокислоту, яка містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу бічного ланцюга. У певних певних варіантах здійснення цього винаходу пряме ацилювання аналогу глюкагона здійснюється через аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу бічного ланцюга амінокислоти в положенні 10. [0065] У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислотою, що містить аміногрупу в бічному ланцюзі, є амінокислота Формули І: [Формула І]. У деяких прикладах здійснення цього винаходу амінокислотою Формули І є амінокислота, де n - 4 (Lys) або n - 3 (Orn). [0066] В інших варіантах здійснення цього винаходу амінокислотою, що містить гідроксильну групу в бічному ланцюзі, є амінокислота Формули II: [Формула II]. У деяких прикладах виконання цього винаходу амінокислотою Формули II є амінокислота, де n - 1 (Ser). [0067] В інших варіантах здійснення цього винаходу амінокислотою, яка містить тіолову групу в бічному ланцюзі, є амінокислота Формули III: 10 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 [Формула III]. У деяких прикладах здійснення цього винаходу амінокислотою Формули III є амінокислота, де n - 1 (Cys). [0068] В інших варіантах здійснення цього винаходу амінокислота, що містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу в бічному ланцюзі, являє собою дизаміщену амінокислоту, що має ту саму структуру Формули І, Формули II або Формули III, за винятком того, що атом водню, пов'язаний з альфа-атомом вуглецю амінокислоти Формули І, Формули II або Формули III, замінений другим бічним ланцюгом. [0069] В одному з варіантів здійснення цього винаходу ацильований глюкагон містить спейсер між згаданим аналогом і згаданою ацильною групою. У деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона ковалентно пов'язаний зі згаданим спейсером, який ковалентно пов'язаний зі згаданою ацильною групою. [0070] У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданим спейсером є амінокислота, яка містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу бічного ланцюга, або ж дипептид чи трипептид, що містить амінокислоту, яка містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу бічного ланцюга. Амінокислотою, до якої приєднаний згаданий спейсер, може бути будьяка амінокислота (наприклад, α-моно- або α-дизаміщена амінокислота), що містить складову, яка забезпечує можливість приєднання до спейсера. Прийнятною, наприклад, є амінокислота, яка містить NH2, -ОН або -СООН бічного ланцюга (наприклад, Lys, Orn, Ser, Asp або Glu). Відповідно, ацильований аналог глюкагона може містити амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1 або її модифіковану амінокислотну послідовність, яка містить одну або більше амінокислотних модифікацій, розкритих у цьому описі, де щонайменше одна з амінокислот у положеннях 10, 20, 24 і 29 модифікована до будь-якої амінокислоти, яка містить аміногрупу, гідроксильну групу або карбоксилатну групу бічного ланцюга. [0071] У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданим спейсером є амінокислота, яка містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу бічного ланцюга, або ж дипептид чи трипептид, що містить амінокислоту, яка містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу бічного ланцюга. [0072] У разі здійснення ацилювання через аміногрупу спейсера, ацилювання може відбуватися через альфа-аміногрупу амінокислоти або аміногрупу бічного ланцюга. У разі ацилювання альфа-аміногрупи, амінокислотою спейсера може бути будь-яка амінокислота. Наприклад, амінокислотою спейсера може бути гідрофобна амінокислота, наприклад, Gly, Ala, Val, Leu, He, Tip, Met, Phe, Tyr, 6-аміногексанова кислота, 5-аміновалеріанова кислота, 7аміногептанова кислота і 8-амінооктанова кислота. Альтернативно амінокислотою спейсера може бути кислий залишок, наприклад, Asp і Glu, гомоглутамінова кислота, гомоцистеїнова кислота, цистеїнова кислота, гамма-глутамінова кислота. [0073] У тому випадку, коли ацилюють аміногрупу бічного ланцюга амінокислоти спейсера, цією амінокислотою спейсера є амінокислота, яка містить аміногрупу в бічному ланцюзі, наприклад, амінокислота Формули І (наприклад, Lys або От). У цьому випадку ацилювання можливе як для альфа-аміногрупи, так і для аміногрупи бічного ланцюга амінокислоти спейсера, у результаті чого аналог глюкагона деацілюється, Певні варіанти здійснення цього винаходу включають згадані деацільовані молекули. [0074] Коли ацилювання здійснене через гідроксильну групу спейсера, згаданою амінокислотою або однією зі згаданих амінокислот дипептиду або трипептиду може бути амінокислота Формули II. У певному прикладі здійснення цього винаходу згаданою амінокислотою є Ser. [0075] Якщо ацилювання відбувається через тіолову групу спейсера, згаданою амінокислотою або однією зі згаданих амінокислот дипептиду або трипептиду може бути амінокислота Формули III. У певному прикладі здійснення цього винаходу згаданою амінокислотою є Cys. 11 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0076] У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий спейсер являє собою гідрофільний біфункціональний спейсер. У певних варіантах здійснення цього винаходу гідрофільний біфункціональний спейсер містить дві або більше реакційноздатні групи, наприклад, аміногрупу, гідроксильну групу, тіолову групу і карбоксильну групу або будь-яку їх комбінацію. У певних варіантах здійснення цього винаходу гідрофільний біфункціональний спейсер містить гідроксильну групу і карбоксилат. В інших варіантах здійснення цього винаходу гідрофільний біфункціональний спейсер містить аміногрупу і карбоксилат. В інших варіантах здійснення цього винаходу гідрофільний біфункціональний спейсер містить тіолову групу і карбоксилат. У певних варіантах здійснення цього винаходу спейсер містить амінополі(алкілокси)карбоксилат. У цьому випадку спейсер може містити, наприклад, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, де m являє собою будь-яке ціле число від 1 до 6, і η становить будь-яке ціле число від 2 до 12, наприклад, 8-аміно-3,6-діоксаоктанову кислоту, яку постачає на ринок компанія Peptides International, Inc. (Louisville, штат Кентуккі). [0077] У певних варіантах здійснення цього винаходу спейсер являє собою гідрофобний біфункціональний спейсер. Гідрофобні біфункціональні спейсери відомі в цій галузі. Дивись, наприклад, джерело Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996), яке включене в цей опис у повному обсязі шляхом посилання. У певних варіантах здійснення цього винаходу гідрофобний біфункціональний спейсер містить дві або більше реакційноздатні групи, наприклад, аміногрупу, гідроксильну групу, тіолову групу і карбоксильну групу або будь-яку їх комбінацію. У певних варіантах здійснення цього винаходу гідрофобний біфункціональний спейсер містить гідроксильну групу і карбоксилат. В інших варіантах здійснення цього винаходу гідрофобний біфункціональний спейсер містить аміногрупу і карбоксилат. В інших варіантах здійснення цього винаходу гідрофобний біфункціональний спейсер містить тіолову групу і карбоксилат. Придатні гідрофобні біфункціональні спейсери, які містять карбоксилат і гідроксильну групу або тіолову групу, відомі в цій галузі і включають, наприклад, 8-гідроксиоктанову кислоту і 8- меркаптооктанову кислоту. [0078] У певних варіантах здійснення цього винаходу біфункціональний спейсер не є дикарбоновою кислотою, яка містить нерозгалужений метилен з 1-7 атомами вуглецю між карбоксилатними групами. У певних варіантах здійснення цього винаходу біфункціональний спейсер є дикарбоновою кислотою, яка містить нерозгалужений метилен з 1-7 атомами вуглецю між карбоксилатними групами. [0079] Спейсер (наприклад, амінокислота, дипептид, трипептид, гідрофільний біфункціональний спейсер або гідрофобний біфункціональний спейсер) у конкретних варіантах здійснення цього винаходу має в довжину від 3 атомів до 10 атомів (наприклад, від 6 атомів до 10 атомів (наприклад, 6 атомів, 7 атомів, 8 атомів, 9 атомів або 10 атомів)). У більш конкретних варіантах здійснення цього винаходу довжина спейсера складає від приблизно 3 атомів до 10 атомів (наприклад, від 6 атомів до 10 атомів), і ацильна група являє собою ацильну групу С12С18 жирних кислот, наприклад, ацильну групу С14 жирної кислоти, ацильну групу С16 жирної кислоти, так що загальна довжина спейсера та ацильної групи складає від 14 атомів до 28 атомів, наприклад, приблизно 14 атомів, 15 атомів, 16 атомів, 17 атомів, 18 атомів, 19 атомів, 20 атомів, 21 атом, 22 атоми, 23 атоми, 24 атоми, 25 атомів, 26 атомів, 27 атомів або 28 атомів. У певних варіантах здійснення цього винаходу довжина спейсера та ацильної групи складає від 17 атомів до 28 атомів (наприклад, від 19 атомів до 26 атомів, від 19 атомів до 21 атома). [0080] Згідно з певними розкритими вище варіантами здійснення цього винаходу згаданий біфункціональний спейсер може бути синтетичною або природною амінокислотою (включаючи (але без обмеження ними) будь-яку з розкритих цьому описі), що містить амінокислотний каркас довжиною від 3 атомів до 10 атомів (наприклад, 6-аміногексанова кислота, 5-аміновалеріанова кислота, 7-аміногептанова кислота і 8-амінооктанова кислота). Альтернативно згаданий спейсер може бути дипептидним або тріпептидним спейсером, що має пептидний каркас довжиною від 3 атомів до 10 атомів (наприклад, від 6 атомів до 10 атомів). Кожна амінокислота дипептидного або трипептидного спейсера може бути такою самою або відмінною від іншої(их) амінокислоти(от) дипептиду або трипептиду і може незалежно бути вибрана з групи, яку складають природні, або кодовані, та/або некодовані, або штучні, амінокислоти, у тому числі, наприклад, будь-який з D- або L-ізомерів природних амінокислот (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Тут) або будь-який із D або L ізомерів штучних, або некодованих, амінокислот, вибраний із групи, яку складають: β-аланін (β-Ala), Ν-αметилаланін (Me-Ala), аміномасляна кислота (Abu), γ-аміномасляна кислота (γ-Abu), аміногексанова кислота (ε-Ahx), аміноізомасляна кислота (Aib), амінометилпіролкарбонова кислота, амінопіперидинкарбоновя кислота, аміносерин (Ams), амінотетрагідропіран-4карбонова кислота, аргінін-ІЧГ-метокси-М-метиламід, β-аспарагінова кислота (β-Asp), 12 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 азетидинкарбонова кислота, 3-(2-бензотіазоліл)аланін, а-тгаре/и-бутилгліцін, 2-аміно-5-уреїдон-валеріанова кислота (цитрулін, Cit), β-циклогексилаланін (Cha), ацетамідометилцистеїн, діаміномасляна кислота (Dab), діамінопропіонова кислота (Dpr), дигідроксифенілаланін (DOPA), диметилтіазолідин (DMTA), γ-глутамінова кислота (γ-Glu), гомосерин (Hse), гідроксипролін (Hyp), ізолейцин-]\Г-метокси-М-метиламід, метилізолейцин (Меііе), ізоніпекотинова кислота (Isn), метиллейцин (MeLeu), метиллізин, диметиллізин, триметиллізин, метанопролін, метіонінсульфоксид (Мех(О)), метіонінсульфон (МеЇ(Ог)), норлейцин (Nle), метилнорлейцин (Me-Nle), норвалін (Nva), орнітин (Огп), параамінобензойна кислота (РАВА), пеніциламін (Pen), метілфенілаланін (MePhe), 4-хлорофенілаланін (Phe(4-Cl)), 4-фторофенілаланін (Phe(4-F)), 4нітрофеншаланін (Phe(4-NU2)), 4-ціанофенілаланін ((Phe(4-CN)), фенілгліцин (Phg), піперидинілаланін, піперидинілгліцин, 3,4-дегідропролін, пірролідинілаланін, саркозин (Sar), селеноцистеїн (Sec), О-бензилфосфосерин, 4-аміно-З-гідрокси-6-метилгептанова кислота (Sta), 4-аміно-5-циклогексил-3-гідроксипентанова кислота (АСНРА), 4-аміно-3-гідрокси-5фенілпентанова кислота (АНРРА), 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-3-карбонова кислота (Tic), тетрагідропірангліцин, тіенілаланін (Тhi), О-бензилфосфотирозин, О-фосфотирозин, метокситирозин, етокситирозин, О-(біс-диметиламінофосфоно)тирозин, тетрабутиламін тирозинсульфата, метилвалін (MeVal) і алкілована 3-меркаптопропіонова кислота. [0081] У певних варіантах здійснення цього винаходу спейсер має загальний негативний заряд, наприклад, містить одну або дві негативно заряджені амінокислоти. У певних варіантах здійснення цього винаходу дипептидом є не будь-який із дипептидів загальної структури А-В, де А вибраний із групи, яку складають Gly, Gin, Ala, Arg, Asp, Asn, He, Leu, Val, Phe і Pro, а В вибраний із групи, яку складають Lys, His, Trp. У певних варіантах здійснення цього винаходу дипептидний спейсер вибраний із групи, яку складають Ala-Ala, P-Ala-P-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γаміномасляна кислота-у-аміномасляна кислота, Glu-Glu та y-Glu-y-Glu. [0082] У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона для введення ацильної групи модифікований ацилюванням аміногрупи, гідроксильної групи або тіолової групи спейсера, де спейсер приєднаний до бічного ланцюга амінокислоти в положенні 10,20, 24 чи 29 або до С-кінцевої амінокислоти аналога глюкагона. [0083] У ще більш конкретних варіантах здійснення цього винаходу ацильна група приєднана до амінокислоти в положенні 10 аналога глюкагона, і довжина спейсера та ацильної групи складає від 14 атомів до 28 атомів. Амінокислотою в положенні 10, за певними аспектам цього винаходу, є амінокислота Формули І, наприклад, Lys, або дизаміщена амінокислота, яка відповідає Формулі І. У більш конкретних варіантах здійснення цього винаходу в аналога глюкагона відсутній внутрішньомолекулярний місток, наприклад, ковалентний внутрішньомолекулярний місток. Згаданим аналогом глюкагона, наприклад, може бути аналог глюкагона, що містить одну або більше альфа, альфа-дизаміщених амінокислот, наприклад, АІВ, для стабілізації альфа-спіралі згаданого аналога. [0084] Прийнятні способи ацилювання пептидів через аміногрупи, гідроксильні групи та тіолові групи відомі в цій галузі. Див., наприклад, Приклад 19 (способи ацилювання через аміногрупу), Miller, Biochem. Biophys. Res. Commun. 218:377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, Int. J. Pept. Protein Res. 19:54-62 (1982); та Previero et al., Biochim. Biophys. Ada 263: 713 (1972) (способи ацилювання через гідроксильну групу); та San and Silvius, J. Pept. Res. 66:169-180 (2005) (способи ацилювання через тіолову групу); Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" crop. 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmaceutical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No:2, crop. 171-176 (1989). [0085] Ацильна група ацильованої амінокислоти може мати будь-яку величину, наприклад, вуглецевий ланцюг будь-якої довжини, і може бути лінійною або розгалуженою. У деяких конкретних варіантах здійснення цього винаходу ацильною групою є С4-С30 жирна кислота. Наприклад, ацильною групою може бути будь-яка з таких кислот: С4 жирна кислота, С6 жирна кислота, С8 жирна кислота, С10 жирна кислота, С12 жирна кислота, С14 жирна кислота, С16 жирна кислота, С18 жирна кислота, С20 жирна кислота, С22 жирна кислота, С24 жирна кислота, С26 жирна кислота, С28 жирна кислота або С30 жирна кислота. У певних варіантах здійснення цього винаходу ацильною групою є С8-С20 жирна кислота, наприклад, С14 жирна кислота або С16 жирна кислота. [0086] В альтернативному варіанті здійснення цього винаходу ацильною групою є жовчна кислота. Згаданою жовчною кислотою може бути будь-яка відповідна жовчна кислота, у тому числі (але без обмеження ними) холева кислота, хенодіоксихолева кислота, деоксихолева кислота, літохолева кислота, таурохолева кислота, глікохолева кислота і холестеринова кислота. 13 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 [0087] У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий аналог глюкагона містить ацильовану амінокислоту, введену ацилюванням довголанцюгового алкана аналогом глюкагона. За певними аспектами цього винаходу згаданий довголанцюговий алкан містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу (наприклад, октадециламін, тетрадеканол і гексадекантіол), яка реагує з карбоксильною групою (або її активованою формою) згаданого аналога глюкагона. Карбоксильная група (або її активована форма) аналога глюкагона може бути складовою частиною бічного ланцюга амінокислоти (наприклад, глутамінової кислоти, аспарагінової кислоти) аналога глюкагона або може бути складовою частиною каркаса згаданого аналога. [0088] У певних варіантах здійснення цього винаходу для введення ацильної групи аналог глюкагона модифікований ацилюванням довголанцюгового алкана спейсером, який приєднаний до аналога глюкагона. За певними аспектами даного винаходу згаданий довголанцюговий алкан містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу, яка реагує з карбоксильною групою (або її активованою формою) згаданого спейсера. Прийнятні спейсери, які містять карбоксильну групу (або її активовану форму), розкриті в цьому описі та включають, наприклад, біфункціональні спейсери, наприклад, амінокислоти, дипептиди, трипептиди, гідрофільні біфункціональні спейсери та гідрофобні біфункціональні спейсери. [0089] Термін "активована форма карбоксильної групи", вжитий в цьому описі, означає карбоксильну групу загальної формули R(C=O)X, де X являє собою групу, що відщеплюється, a R являє собою аналог глюкагона або спейсер. Наприклад, активовані форми карбоксильних груп можуть включати (але без обмеження ними) ацилхлориди, ангідриди та складні ефіри. У певних варіантах здійснення цього винаходу активованою карбоксильною групою є складний ефір із групою, що відщеплюється, N-гідроксисукцинімідним складним ефіром (NHS). [0090] Беручи до уваги аспекти цього винаходу, згідно з якими довголанцюговий алкан ацильований аналогом глюкагона або спейсером, довголанцюговий алкан може мати будь-яку довжину і та може містити вуглецевий ланцюг будь-якої довжини. Згаданий довголанцюговий алкан може бути лінійним або розгалуженим. За певними аспектами цього винаходу довголанцюговий алкан являє собою С4-С30 алкан. Наприклад, довголанцюговим алканом може бути будь-який із таких алканів: С4 алкан, С6 алкан, С8 алкан, С10 алкан, С12 алкан, С14 алкан, С16 алкан, С18 алкан, С20 алкан, С22 алкан, С24 алкан, С26 алкан, С28 алкан або С30 алкан. У певних варіантах здійснення цього винаходу довголанцюговий алкан являє собою С8С20 алкан, наприклад, С14 алкан, С16 алкан або СІ8 алкан. [0091] Крім того, у певних варіантах здійснення цього винаходу аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу аналога глюкагона ацилюють холестериновою кислотою. У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий аналог глюкагона приєднаний до холестеринової кислоти через алкілований дезаміно-Cys спейсер, тобто через спейсер, що являє собою алкіловану З-меркапропропіонову кислоту. Згаданим алкілованим дезаміно-Cys спейсером може бути, наприклад, дезаміно-Cys спейсер, що містить додекаетиленгліколеву складову. В одному з варіантів здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить структуру: [0092] Ацильовані аналоги глюкагона, розкриті в цьому описі, можна також модифікувати з включенням гідрофільної складової. У деяких конкретних варіантах здійснення цього винаходу згадана гідрофільна складова може містити поліетиленгліколевий (PEG) ланцюг. Введення гідрофільної складової можна здійснити будь-яким прийнятним способом, таким як будь-який спосіб, розкритий в цьому описі. У цьому випадку ацильований аналог глюкагона може містити послідовність SEQ Ш N0: 1, що включає будь-яку з модифікацій, розкритих у цьому описі, де 14 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 щонайменше одна з амінокислот у положенні 10, 20, 24 і 29 згаданого аналога містить ацильну групу, і щонайменше одна з амінокислот у положенні 16, 17, 21, 24 або 29, положенні в межах С-кінцевого подовжувального сегмента або С-кінцева амінокислота модифіковані до Cys, Lys, Orn, гомо-Cys або Ac-Phe, і бічний ланцюг амінокислоти ковалентно пов'язаний і гідрофільною складовою (наприклад, PEG). У певних варіантах здійснення цього винаходу ацильна група приєднана в положенні 10, факультативно через спейсер, що містить Cys, Lys, Orn, гомо-Cys або Ac-Phe, і гідрофільна складова приєднана на Cys залишку в положенні 24. [0093] Альтернативно ацильований аналог глюкагона може містити спейсер, ацильований і модифікований із включенням гідрофільної складової. Необмежувальні приклади прийнятних спейсерів включають спейсер, що містить одну або більше амінокислот, вибраних із групи, яку складають Cys, Lys, Orn, гомо-Cys та Ac-Phe. Алкілування [0094] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить алкіловану амінокислоту (наприклад, некодовану алкіловану амінокислоту (наприклад, амінокислоту, яка містить алкільну групу, яка не є нативною для природної амінокислоти)). Не дотримуючись жодної конкретної теорії, автори вважають, що алкілуванням аналогів глюкагона будуть досягнуті подібні, якщо не такі самі, результати, як і у випадку ацилювання аналогів глюкагона, наприклад, збільшений напівперіод існування в системі кровообігу, відстрочений початок дії, збільшена тривалість дії, поліпшена резистентність до протеазів, таких як DPP-IV, і підвищена ефективність на GLP-1рецепторі та глюкагоновому рецепторі. [0095] Алкілування може бути здійснене в будь-якому з положень у межах аналога глюкагона, охоплюючи будь-яке з положень, розкритих у цьому описі як ділянка, придатна для ацилювання, включаючи, але без обмеження ними, будь-яке з положень амінокислот 1-29, положення амінокислоти в С-кінцевому напрямку 29-го залишку, наприклад, положення 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 тощо, положення в межах С-кінцевого подовжувального сегмента або на С-кінці, за умови, що глюкагонова активність або GLP-1 активність зберігається. Необмежувальні приклади включають положення 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 або 29. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить алкіловану амінокислоту в одному або кількох положеннях, вибраних із групи, яку складають положення 9, 10, 12, 16 і 20. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить алкіловану амінокислоту в одному або кількох положеннях, вибраних із групи, яку складають положення 10, 12 і 16. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить алкіловану амінокислоту в одному або кількох положеннях, вибраних із групи, яку складають положення 9, 10, 12, 16 і 20. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить алкіловану амінокислоту в одному або кількох і положень 10 і 12. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить алкіловану амінокислоту в положенні 12. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить С-кінцевий подовжувальний сегмент і алкіловану амінокислоту в одному або кількох положеннях, вибраних із групи, яку складають положення 9, 10, 12, 16, 20 і 37-43 (наприклад, 40). Алкільна група може бути ковалентно пов'язана безпосередньо з амінокислотою аналога глюкагона або опосередковано з амінокислотою аналога глюкагона через спейсер, де згаданий спейсер розташований між амінокислотою аналога глюкагона та алкільною групою. Аналог глюкагона можна алкілювати в тому самому амінокислотному положенні, до якого приєднана гідрофільна складова, або в іншому амінокислотному положенні. Необмежувальні приклади включають алкілування в положенні 10 і пегілювання в одному або кількох положеннях на С-кінцевій ділянці аналога глюкагона, наприклад, у положенні 24, 28 або 29, в межах С-кінцевого подовжувального сегмента або на С-кінці (наприклад, шляхом додавання С-кінцевого Cys). [0096] За конкретним аспектом цього винаходу аналог глюкагона модифікують із включенням алкільної групи шляхом безпосереднього алкілування аміногрупи, гідроксильної групи або тіолової групи бічного ланцюга амінокислоти аналога глюкагона. У певних варіантах здійснення цього винаходу алкілування відбувається в положенні 10, 20, 24 або 29 аналога глюкагона. У цьому випадку алкілований аналог глюкагона може містити амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2 або її модифіковану амінокислотну послідовність, що містить одну або більше амінокислотних модифікацій, розкритих у цьому описі, де щонайменше одна з амінокислот у положеннях 10, 20, 24 і 29 модифікована до будь-якої амінокислоти, що містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу бічного ланцюга. У певних конкретних варіантах здійснення цього винаходу безпосереднє алкілування глюкагонового пептиду 15 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відбувається через аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу бічного ланцюга амінокислоти в положенні 10. [0097] У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислотою, що містить аміногрупу в бічному ланцюзі, є амінокислота Формули І. У певних прикладах здійснення цього винаходу амінокислотою Формули І є амінокислота, де η - 4 (Lys) або η - 3 (Orn). [0098] В інших варіантах здійснення цього винаходу амінокислотою, що містить гідроксильну групу в бічному ланцюзі, є амінокислота Формули II. У певних прикладах здійснення цього винаходу амінокислотою Формули II є амінокислота, де η - 1 (Ser). [0099] В інших варіантах здійснення цього винаходу амінокислотою, яка містить тіолову групу в бічному ланцюзі, є амінокислота Формули III. У певних прикладах здійснення цього винаходу амінокислотою Формули III є амінокислота, де η - 1 (Cys). [00100] В інших варіантах здійснення цього винаходу амінокислота, що містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу в бічному ланцюзі, являє собою дизаміщену амінокислоту, яка містить ту саму структуру Формули І, Формули II або Формули III, за винятком того, що атом водню, пов'язаний з альфа-вуглецем амінокислоти Формули І, Формули II або Формули III, замінений другим бічним ланцюгом. [00101] В одному з варіантів здійснення цього винаходу алкілований аналог глюкагона містить спейсер між аналогом та алкільною групою. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона ковалентно пов'язаний із спейсером, який ковалентно пов'язаний з алкільною групою. У певних прикладах здійснення цього винаходу аналог глюкагона модифікований із включенням алкільної групи шляхом алкілування аміногрупи, гідроксильної групи або тіолової групи спейсера, де спейсер приєднаний до бічного ланцюга амінокислоти в положенні 10, 20, 24 або 29 аналога глюкагона. Амінокислотою, до якої приєднаний спейсер, може бути будь-яка амінокислота, що містить складову, яка забезпечує можливість приєднання до спейсера. Прийнятною, наприклад, є амінокислота, яка містить NH2, -ОН або -СООН бічного ланцюга (наприклад, Lys, Orn, Ser, Asp або Glu). У цьому випадку алкілований аналог глюкагона може містити модифіковану амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, що містить одну або більше амінокислотних модифікацій, розкритих у цьому описі, де щонайменше одна з амінокислот у положеннях 10, 20, 24 і 29 модифікована до будь-якої амінокислоти, що містить аміногрупу, гідроксильну групу або карбоксилатну групу бічного ланцюга. [00102] У певних варіантах здійснення цього винаходу спейсером є амінокислота, яка містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу бічного ланцюга, або ж дипептид чи трипептид, що містить амінокислоту, яка містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу бічного ланцюга. [00103] У разі здійснення алкілування через аміногрупу спейсера, алкілування може відбуватись через альфа-аміногрупу амінокислоти або аміногрупу бічного ланцюга. У разі алкілування альфа-аміногрупи амінокислотою спейсера може бути будь-яка амінокислота. Наприклад, амінокислотою спейсера може бути гідрофобна амінокислота, наприклад, Gly, Ala, Val, Leu, He, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-аміногексанова кислота, 5-аміновалеріанова кислота, 7аміногептанова кислота і 8-амінооктанова кислота. Альтернативно амінокислотою спейсера може бути кислий залишок, наприклад, Asp і Glu, за умови, що алкілування відбувається на альфа-аміногрупі кислого залишку. У тому випадку, коли алкілована аміногрупа бічного ланцюга амінокислоти спейсера, цією амінокислотою спейсера є амінокислота, яка містить аміногрупу в бічному ланцюзі, наприклад, амінокислота Формули І (наприклад, Lys або Orn). У цьому випадку алкілування можливе як для альфа-аміногрупи, так і для аміногрупи бічного ланцюга амінокислоти спейсера, так що аналог глюкагона діалкілується. Варіанти виконання цього винаходу охоплюють такі діалкіловані молекули. [00104] Коли алкілування відбувається через гідроксильну групу спейсера, амінокислотою або однією з амінокислот дипептида чи трипептида може бути амінокислота Формули II. У конкретному прикладі здійснення цього винаходу згаданою амінокислотою є Ser. [00105] У разі здійснення алкілування через тіолову групу спейсера, амінокислотою або однією з амінокислот дипептида чи трипептида може бути амінокислота Формули III. У конкретному прикладі здійснення цього винаходу згаданою амінокислотою є Cys. [00106] У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий спейсер являє собою гідрофільний біфункціональний спейсер. У певних варіантах здійснення цього винаходу гідрофільний біфункціональний спейсер містить дві або більше реакційноздатні групи, наприклад, аміногрупу, гідроксильну групу, тіолову групу і карбоксильну групу або будь-яку їх комбінацію. У певних варіантах здійснення цього винаходу гідрофільний біфункціональний спейсер містить гідроксильну групу і карбоксилат. В інших варіантах здійснення цього винаходу 16 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 гідрофільний біфункціональний спейсер містить аміногрупу і карбоксилат. В інших варіантах здійснення цього винаходу гідрофільний біфункціональний спейсер містить тіолову групу і карбоксилат. У певних варіантах здійснення цього винаходу спейсер містить амінополі(алкілокси) карбоксилат. У цьому випадку спейсер може містити, наприклад, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, де m являє собою будь-яке ціле число від 1 до 6, а п являє собою будь-яке ціле число від 2 до 12, наприклад, 8-аміно-3,6-діоксиоктанову кислоту, яку постачає на ринок компанія Peptides International, Inc. (Louisville, штат Кентуккі). [00107] У певних варіантах здійснення цього винаходу спейсер являє собою гідрофобний біфункціональний спейсер. У певних варіантах здійснення цього винаходу гідрофобний біфункціональний спейсер містить дві або більше реакційноздатні групи, наприклад, аміногрупу, гідроксильну групу, тіолову групу і карбоксильну групу або будь-яку їх комбінацію. У певних варіантах здійснення цього винаходу гідрофобний біфункціональний спейсер містить гідроксильну групу і карбоксилат. В інших варіантах здійснення цього винаходу гідрофобний біфункціональний спейсер містить аміногрупу і карбоксилат. В інших варіантах здійснення цього винаходу гідрофобний біфункціональний спейсер містить тіолову групу і карбоксилат. Прийнятні гідрофобні біфункціональні спейсери, які містять карбоксилат і гідроксильну групу або тіолову групу, відомі в цій галузі і включають, наприклад, 8-гідроксиоктанову кислоту і 8меркаптооктанову кислоту. [00108] У певних конкретних варіантах здійснення цього винаходу спейсер (наприклад, амінокислота, дипептид, трипептид, гідрофільний біфункціональний спейсер або гідрофобний біфункціональний спейсер) має довжину від 3 атомів до 10 атомів (наприклад, від 6 атомів до 10 атомів (наприклад, 6 атомів, 7 атомів, 8 атомів, 9 атомів або 10 атомів)). У більш конкретних варіантах здійснення цього винаходу довжина спейсера складає приблизно від 3 атомів до 10 атомів (наприклад, від 6 атомів до 10 атомів), і алкільна група являє собою С12-С18 алкільну групу, наприклад, С14 алкільну групу, С16 алкільну групу, так що загальна довжина спейсера та алкільної групи складає від 14 атомів до 28 атомів, наприклад, приблизно 14 атомів, 15 атомів, 16 атомів, 17 атомів, 18 атомів, 19 атомів, 20 атомів, 21 атом, 22 атоми, 23 атоми, 24 атоми, 25 атомів, 26 атомів, 27 атомів або 28 атомів. У певних варіантах здійснення цього винаходу довжина спейсера та алкільної групи складає від 17 атомів до 28 атомів (наприклад, від 19 атомів до 26 атомів, від 19 атомів до 21 атома). [00109] Згідно з певними розкритими вище варіантами здійснення цього винаходу згаданий біфункціональний спейсер може бути синтетичною, або штучною, або некодованою амінокислотою, що містить амінокислотний каркас довжиною від 3 атомів до 10 атомів (наприклад, 6-аміногексановою кислотою, 5-аміновалеріановою кислотою, 7-аміногептановою кислотою і 8-амінооктановою кислотою). Альтернативно згаданий спейсер може бути дипептидним або трипептидним спейсером, що має пептидний каркас довжиною від 3 атомів до 10 атомів (наприклад, від 6 атомів до 10 атомів). Дипептидний або трипептидний спейсер може складатися з природних, або кодованих, та/або некодованих, або штучних амінокислот, включаючи, наприклад, будь-яку з амінокислот, розкритих у цьому описі. У певних варіантах здійснення цього винаходу спейсер має загальний негативний заряд, наприклад, містить одну або дві негативно заряджені амінокислоти. У певних варіантах здійснення цього винаходу дипептидний спейсер вибирається із групи, яку складають Ala-Ala, β-Ala-P-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γ-аміномасляна кислота-у-аміномасляна кислота і y-Glu-y-Glu. [00110] Прийнятні способи алкілування пептидів через аміногрупи, гідроксильні групи і тіолові групи відомі в цій галузі. Наприклад, утворення ефірного зв'язку між гідроксильною групою аналога ппокагона та алкільною групою може відбуватися за реакцією Вільямсона. Наслідком реакції нуклеофільного заміщення між пептидом і алкілгалогенідом також може бути утворення будь-якого, а саме ефірного, тіоефірного або амінного, зв'язку. [00111] Алкільна група алкілованого глюкагонового аналога може мати будь-яку величину, наприклад, являти собою вуглецевий ланцюг будь-якої довжини, і той може бути лінійним або розгалуженим. У певних варіантах здійснення цього винаходу алкільною групою є С4-С30 алкіл. Наприклад, алкільною групою може бути будь-яка з таких груп: С4 алкіл, С6 алкіл, С8 алкіл, С10 алкіл, СІ2 алкіл, С14 алкіл, С16 алкіл, С18 алкіл, С20 алкіл, С22 алкіл, С24 алкіл, С26 алкіл, С28 алкіл або СЗО алкіл. У певних варіантах здійснення цього винаходу алкільною групою є С8-С20 алкіл, наприклад, С14 алкіл або СІ6 алкіл. [00112] У певних конкретних варіантах здійснення цього винаходу алкільна група містить стероїдну складову жовчної кислоти, наприклад, холевої кислоти, - хенодіоксихолевої кислоти, деоксихолевої кислоти, літохолевої кислоти, таурохолевої кислоти, глікохолевої кислоти і холестеринової кислоти. 17 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [00113] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить амінокислоту, алкіловану шляхом введення в реакцію нуклеофільного довголанцюгового алкана з аналогом глюкагона, де згаданий аналог глюкагона містить групу, яка відщеплюється та є придатною для нуклеофільного заміщення. Згідно з певними конкретними аспектами цього винаходу нуклеофільна група довголанцюгового алкана містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу (наприклад, октадециламін, тетрадеканол і гексадекантіол). Група аналога глюкагона, яка відщеплюється, може бути частиною бічного ланцюга амінокислоти або може бути частиною пептидного каркаса. Прийнятні групи, які відщеплюються, включають, наприклад, N-гідроксисукцинімід, галогени і сульфоновані складні ефіри. [00114] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона для включення алкільної групи модифікований шляхом введення в реакцію нуклеофільного довголанцюгового алкана зі спейсером, який приєднаний до аналогу глюкагона, де згаданий спейсер містить групу, яка відщеплюється. Згідно з певними конкретними аспектами цього винаходу довголанцюговий алкан містить аміногрупу, гідроксильну групу або тіолову групу. У певних варіантах здійснення цього винаходу спейсер, що містить групу, яка відщеплюється, може бути будь-яким спейсером, розкритим в цьому описі, наприклад, таким як амінокислоти, дипептиди, трипептиди, гідрофільні біфункціональні спейсери і гідрофобні біфункціональні спейсери, які також містять відповідну групу, яка відщеплюється. [00115] Беручи до уваги аспекти цього винаходу, згідно з якими довголанцюговий алкан алкілований аналогом глюкагона або спейсером, довголанцюговий алкан може мати будь-яку довжину і може містити вуглецевий ланцюг будь-якої довжини. Довголанцюговий алкан може бути лінійним або розгалуженим. У певних аспектах цього винаходу довголанцюговий алкан являє собою С4-С30 алкан. Наприклад, довголанцюговим алканом може бути будь-який із наступних алканів: С4 алкан, С6 алкан, С8 алкан, С10 алкан, С12 алкан, С14 алкан, С16 алкан, С18 алкан, С20 алкан, С22 алкан, С24 алкан, С26 алкан, С28 алкан або С30 алкан. У певних варіантах здійснення цього винаходу довголанцюговий алкан являє собою С8-С20 алкан, наприклад, С14 алкан, С16 алкан або С18 алкан. [00116] Крім того, у певних варіантах здійснення цього винаходу алкілування може відбуватися між аналогом глюкагона і холестериновою складовою. Наприклад, гідроксильна група холестерину може витісняти групу довголанцюгового алкана, яка відщеплюється, із утворенням продукту, холестерин-глюкагонового аналога. [00117] Алкіловані аналоги глюкагона, розкриті в цьому описі, можуть також бути модифіковані з включенням гідрофільної складової. У певних конкретних варіантах здійснення цього винаходу гідрофільна складова може містити поліетиленгліколевий (PEG) ланцюг. Додавання гідрофільної складової можна здійснювати будь-яким прийнятним способом, наприклад, будь-яким способом, розкритим у цьому описі. Відповідно, алкілований аналог глюкагона може містити модифіковану послідовність SEQIDNO: 1, яка містить одну або більше амінокислотних модифікацій, розкритих у цьому описі, де щонайменше одна з амінокислот у положенні 10, 20, 24 і 29 містить алкільну групу, і щонайменше одна з амінокислот у положенні 16, 17, 21, 24 і 29, положенні в межах С-кінцевого подовжувального сегмента або С-кінцева амінокислота модифіковані до Cys, Lys, Orn, гомо-Cys або Ac-Phe, і бічний ланцюг амінокислоти ковалентно пов'язаний із гідрофільною складовою (наприклад, PEG). У певних варіантах здійснення цього винаходу алкільна група приєднана в положенні 10, факультативно через спейсер, що містить Cys, Lys, Orn, гомо-Cys або Ac-Phe, а гідрофільна складова додана на Cys залишку в положенні 24. [00118] За альтернативним варіантом здійснення цього винаходу алкілований глюкагоновий пептид може містити спейсер, алкілований і модифікований з включенням гідрофільної складової. До необмежувальних прикладів прийнятних спейсерів належить спейсер, який містить одну або більше амінокислот, вибраних з групи, що включає Cys, Lys, Orn, гомо-Cys та Ac-Phe. Стабілізація альфа-спіралі та амінокислоти, які активують альфа-спіраль [00119] Без посилання на будь-яку конкретну теорію, аналоги глюкагона, розкриті в цьому описі, містять спіральну структуру, наприклад, альфа-спіраль. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить амінокислоти, які стабілізують структуру альфаспіралі. Відповідно, за певними аспектами цього винаходу аналог глюкагона містить одну або більше амінокислот, які активують альфа-спіраль. Термін "амінокислота, яка активує альфаспіраль", вжитий в цьому описі, означає амінокислоту, що забезпечує підвищену стабільність альфа-спіралі аналога глюкагона, частиною якої вона є. Амінокислоти, які активують альфаспіраль, відомі в цій галузі. Дивись, наприклад, Lyu et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88: 53175320 (1991); Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, Garland Publishing, New York, NY, 18 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1991; Fasman, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, ed. Fasman, Plenum, NY, - 1989). До амінокислот, які активують альфа-спіраль і відповідають цілям цього винаходу, належать (але без обмеження ними): аланін, норвалін, норлейцин, альфааміномасляна кислота, альфа-аміноізомасляна кислота, лейцин, ізолейцин, валін і подібні до них. У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислота, яка активує альфа-спіраль, являє собою будь-яку амінокислоту, яка є частиною альфа-спіралі, наявної в природному білку, наприклад, Leu, Phe, Ala, Met, Gly, He, Ser, Asn, Glu, Asp, Lys, Arg. [00120] У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислота, яка активує альфаспіраль, забезпечує підвищену стабільність альфа-спіралі у порівнянні з гліцином або аланіном. У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислота, яка активує альфа-спіраль, являє собою альфа, альфа-дизаміщену амінокислоту. Альфа-спіраль: Положення амінокислот, які активують альфа-спіраль [00121] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить амінокислотну послідовність, яка подібна послідовності нативного глюкагона (SEQ ID NO: 1), і вказаний аналог глюкагона містить щонайменше одну амінокислоту, яка активує альфа-спіраль. У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислота, яка активує альфа-спіраль, розташована в будь-якому з положень з 12 по 29 (відповідно з нумерацією нативного глюкагона (SEQ ID NO: 1). У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона, який містить модифіковану амінокислотну послідовність SEQIDNO:1, містить щонайменше одну амінокислоту, яка активує альфа-спіраль, наприклад, в одному або більше положеннях 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить амінокислоту, яка активує альфа-спіраль, в одному, двох, трьох або всіх положеннях 16, 17, 20 і 21. Альфа-спіраль: Альфа, альфа-дизаміщені амінокислоти [00122] У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислота, що активує альфаспіраль, являє собою альфа, альфа-дизаміщену амінокислоту. У певних варіантах здійснення 1 2 цього винаходу альфа, альфа-дизаміщена амінокислота містить R та R , кожен із яких 1 2 пов'язаний з альфа-вуглецем, де кожен із R та R незалежно один від одного вибраний із групи, яку складають С1-С4-алкіл, факультативно заміщений гідроксилом, амідом, тіолами, галогеном, або R та R разом з альфа-вуглецем, до якого вони приєднані, утворюють кільце (наприклад, С31 2 С8-кільце). У певних варіантах здійснення цього винаходу кожен із R та R вибраний з групи, яку складають: метил, етил, пропіл і н-бутил, або R та R разом утворюють циклооктан або циклогептан (наприклад, 1-аміноциклооктан-1-карбоксильну кислоту). У певних варіантах 1 2 1 здійснення цього винаходу R та R однакові. У певних варіантах здійснення цього винаходу R 2 1 2 відрізняється від R . За певними аспектами цього винаходу кожен із R та R являє собою С11 2 С4-алкіл. За деякими аспектами цього винаходу кожен із R та R являє собою СІ-алкіл або С2алкіл. У певних варіантах здійснення цього винаходу кожен із R та R являє собою метил, так що згадана альфа, альфа-дизаміщена амінокислота є альфа-аміноізомасляною кислотою (АІВ). [00123] У певних аспектах цього винаходу аналоги глюкагона, розкриті в цьому описі, містять одну або більше альфа, альфа-дизаміщених амінокислот, і згадані аналоги глюкагона, зокрема, не мають ковалентного внутрішньомолекулярного містка (наприклад, лактамного), оскільки альфа, альфа-дизаміщена амінокислота здатна стабілізувати альфа-спіраль за відсутності ковалентного містка. За деякими аспектами цього винаходу аналог глюкагона містить одну або більше альфа, альфа-дизаміщених амінокислот на С-кінці (навколо положень 12-29). У певних варіантах здійснення цього винаходу одне, два, три, чотири або більше з положень 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 28 або 29 аналога глюкагона заміщені α,α-дизаміщеною амінокислотою, наприклад, аміноізомасляною кислотою (АІВ), амінокислотою, дизаміщеною однаковими або відмінними групами, вибраними з метилу, етилу, пропілу та н-бутилу, або циклооктаном чи циклогептаном (наприклад, 1-аміноциклооктан-1 -карбоновою кислотою). Наприклад, заміщення положення 16 аміноізомасляною кислотою посилює GLP-1 активність за відсутності внутрішньомолекулярного містка, наприклад, нековалентного внутрішньомолекулярного містка (наприклад, сольового) або ковалентного внутрішньомолекулярного містка (наприклад, лактамного). У певних варіантах здійснення цього винаходу одне, два, три або більше з положень 16, 20, 21 або 24 заміщені аміноізомасляною кислотою. У певних варіантах здійснення цього винаходу одна чи обидві амінокислоти, відповідні положенням 2, 16 нативного глюкагона людини (SEQIDNO: 1), заміщені альфа, альфа-дизаміщеною кислотою, такою як АІВ. [00124] Згідно з певними варіантами здійснення цього винаходу аналог глюкагона, у якого відсутнй внутрішньомолекулярний місток, містить одне або більше заміщень в амінокислотних положеннях 12-29 альфа, альфа-дизаміщеною амінокислотою, і ацильну або алкільну групу, ковалентно приєднану до бічного ланцюга амінокислоти в положенні 10 аналога глюкагона. У 19 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 певних варіантах здійснення цього винаходу ацильна або алкільна група не зустрічаються у природних амінокислотах. За певними аспектами цього винаходу ацильна або алкільна група не є нативною для амінокислоти в положенні 10. Такі ацильовані або алкіловані глюкагонові пептиди, у яких відсутній внутрішньомолекулярний місток, демонструють підвищену активність на GLP-1 і глюкагоновому рецепторах порівняно з неацильованими пептидними аналогами. Подальше збільшення активності на GLP-1 і глюкагоновому рецепторах може бути отримане шляхом ацилювання глюкагонових пептидів, у яких відсутній внутрішньомолекулярний місток, шляхом вбудовування спейсера між ацильною або алкільною групою і бічним ланцюгом амінокислоти в положенні 10 згаданого аналога. Ацилювання та алкілування, із вбудовуванням спейсерів або без нього, розкрите нижче в цьому описі. Альфа-спіраль: Внутрішньомолекулярні містки [00125] У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислота, що активізує альфаспіраль, являє собою амінокислоту, яка пов'язана з іншою амінокислотою аналога глюкагона через внутрішньомолекулярний місток. У таких варіантах здійснення цього винаходу кожна з цих двох амінокислот, пов'язаних через внутрішньомолекулярний місток, вважається амінокислотою, що активізує альфа-спіраль. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить один або два внутрішньомолекулярних містка. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить один внутрішньомолекулярний місток у комбінації із щонайменше однією іншою амінокислотою, яка активізує альфа-спіраль, наприклад, альфа, альфа-дизаміщеною амінокислотою. [00126] У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий внутрішньомолекулярний місток являє собою місток, який з'єднує дві частини аналога глюкагона шляхом використання нековалентних зв'язків, у тому числі, наприклад, ван-дер-ваальсових взаємодій, водневих зв'язків, іонних зв'язків, гідрофобних взаємодій, диполь-дипольних взаємодій тощо. Тому аналог глюкагона за певними аспектами цього винаходу містить нековалентний внутрішньомолекулярний місток. У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий нековалентний внутрішньомолекулярний місток є сольовим містком. [00127] У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий внутрішньомолекулярний місток являє собою місток, який з'єднує дві частини згаданого аналога ковалентними зв'язками. Тому аналог глюкагона за певними аспектами цього винаходу містить ковалентний внутрішньомолекулярний місток. [00128] У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий внутрішньомолекулярний місток (наприклад, нековалентний внутрішньомолекулярний місток, ковалентний внутрішньомолекулярний місток) утворюється між двома амінокислотами, які відокремлені одна від одної трьома амінокислотами, наприклад, амінокислотами в положеннях і та і+4, де і являє собою будь-яке ціле число між 12 і 25 (наприклад, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 та 25). Більш конкретно, бічні ланцюги амінокислотних пар 12 і 16, 16 і 20, 20 і 24 або 24 і 28 (амінокислотні пари, у яких i-12, 16,20 або 24) пов'язані між собою і тому стабілізують альфаспіраль глюкагона. Альтернативно і може дорівнювати 17. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить внутрішньомолекулярний місток між амінокислотами 17 і 21. У певних конкретних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить внутрішньомолекулярний місток між амінокислотами в положеннях 16 і 20 або 12 і 16 та другий внутрішньомолекулярний місток між амінокислотами в положеннях 17 і 21. У цьому описі розглянуті аналоги глюкагона, які містять один або більше внутрішньомолекулярних містків. У певних варіантах здійснення цього винаходу у випадках, коли амінокислоти в положеннях і та і+4 з'єднані внутрішньомолекулярним містком, величина лінкера складає приблизно 8 атомів або приблизно 7-9 атомів. [00129] В інших варіантах здійснення цього винаходу внутрішньомолекулярний місток утворюється між двома амінокислотами, відокремленими одна від одної двома амінокислотами, наприклад, амінокислотами в положеннях j та j+3, де/ являє собою будь-яке ціле число між 12 і 26 (наприклад, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 і 26). У певних конкретних варіантах здійснення цього винаходу j=17. У певних варіантах здійснення цього винаходу у випадках, коли амінокислоти в положеннях j та j+3 з'єднані внутрішньомолекулярним містком, величина лінкера складає приблизно 6 атомів або приблизно 5-7 атомів. [00130] В інших варіантах здійснення цього винаходу внутрішньомолекулярний місток утворюються між двома амінокислотами, які відокремлені одна від одної 6 амінокислотами, наприклад, амінокислотами в положеннях k та k+1, де к являє собою будь-яке ціле число між 12 і 22 (наприклад, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 і 22). Згідно з певними конкретними варіантами здійснення цього винаходу k=12, 13 або 17. У певному прикладі здійснення цього винаходу k=17. 20 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Альфа-спіраль: Амінокислоти, залучені до внутрішньомолекулярних містків [00131] До прикладів амінокислотних пар, здатних пов'язуватися (ковалентно або нековалентно) з утворенням шестиатомного зв'язувального містка, належать Оrn і Asp, Glu і амінокислота Формули І, де n=2, і гомоглутамінова кислота та амінокислота Формули І, де n=1, і де Формула І має такий вигляд: [Формула І]. [00132] До прикладів амінокислотних пар, здатних пов'язуватися з утворенням семиатомного лінкерного містка, належать Orn-Glu (лактамне кільце); Lys-Asp (лактам) або гомо-Ser-roMO-Glu (лактон). До прикладів амінокислотних пар, які можуть утворювати восьмиатомний лінкер, належать Lys-Glu (лактам); гомо-Lys-Asp (лактам); Оrn-гомо-Glu (лактам); 4-aMiHO-Phe-Asp (лактам) або Tyr-Asp (лактон). До прикладів амінокислотних пар, які можуть утворювати дев'ятиатомний лінкер, належать гомо-Lys-Glu (лактам); Lys-roMO-Glu (лактам); 4-aMiHO-Phe-Glu (лактам) або Tyr-Glu (лактон). Будь-який із бічних ланцюгів цих амінокислот може бути також заміщений додатковими хімічними групами, за умови, що тривимірна структура альфа-спіралі не порушується. Фахівець у цій галузі може представити альтернативні пари або альтернативні аналоги амінокислот, у тому числі хімічно модифіковані похідні, які могли б утворити стабілізуючу структуру подібного розміру та бажаної дії. Наприклад, дисульфідний місток гомоцистеїн-гомоцистеїн, який має довжину 6 атомів, для забезпечення бажаного ефекту потім може бути модифікований. [00133] Навіть без утворення ковалентного зв'язку вищеописані амінокислотні пари (або аналогічні пари, які може уявити фахівець у цій галузі) також можуть забезпечити додаткову стабільність альфа-спіралі нековалентними зв'язками, наприклад, через утворення сольових містків або водневих зв'язків. Відповідно, сольові містки можуть бути утворені між: Оrn і Glu; Lys і Asp; гомосерином і гомоглутаматом; Lys і Glu; Asp і Arg; гомо-Lys і Asp; Orn і гомоглутаматом; 4-аміно-РЬе і Asp; Tyr і Asp; гомо-Lys і Glu; Lys і гомо-Glu; 4-аміно-Рnе і Glu; або Туr і Glu. У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий аналог містить сольовий місток між будьякими з таких пар амінокислот: Оrn і Glu; Lys і Asp; Lys і Glu; Asp і Arg; гомо-Lys і Asp: Orn і гомоглутамат; гомо-Lys і Glu; і Lys і гомо-Glu. Сольові містки можуть бути утворені між іншими парами протилежно заряджених бічних ланцюгів. Дивись, наприклад, Kallenbach et al., Role of the Peptide Bond in Protein Structure and Folding, у виданні The Amide Linkage: Structural Significance in Chemistry, Biochemistry, and Materials Science, John Wiley & Sons, Inc. (2000). [00134] У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий нековалентний внутрішньомолекулярний місток являє собою гідрофобний місток. Відповідно до одного з варіантів здійснення цього винаходу альфа-спіраль згаданого аналога стабілізована шляхом включення гідрофобних амінокислот у положеннях j та /+3 або j та j+4. Наприклад, і може бути Туr, а i+4 може бути Val або Leu; і може бути Phe, а i+4 може бути Met; або і може бути Phe, а i+4 може бути Не. Слід мати на увазі, що для цілей цього винаходу вищевказані амінокислотні пари можуть бути перевернуті, так що вказана амінокислота в положенні і може альтернативно бути розташована в положенні i+4, у той час як амінокислота в положенні i+4 може бути розташована в положенні i. Слід також розуміти, що відповідні амінокислотні пари можуть бути сформовані для j та j +3. Альфа-спіраль: Ковалентний внутрішньомолекулярний місток [00135] У певних варіантах здійснення цього винаходу ковалентний внутрішньомолекулярний місток є лактамним кільцем або лактамним містком. Розмір лактамного кільця може варіювати залежно від довжини бічних ланцюгів амінокислоти, і в одному з варіантів здійснення цього винаходу лактам формується шляхом зв'язування бічних ланцюгів орнітина з бічним ланцюгом аспарагінової кислоти. Лактамні містки та методи їх формування відомі в цій галузі. Дивись, наприклад, Houston, Jr., et al., J.Peptide Sci 1: 274-282 21 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (2004), і наведений у цьому описі Приклад 1. У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий аналог містить модифіковану послідовність SEQ ID NO: 1 і лактамний місток між i та i+4, де і відповідає вищенаведеному визначенню. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить два лактамні містки: один між амінокислотами в положеннях 16 і 20 та інший між амінокислотами в положеннях 17 і 21. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить один лактамний місток і один сольовий місток. Інші приклади здійснення цього винаходу описані нижче в розділі "ПРИКЛАДИ". Інші приклади здійснення винаходу включають такі пари, які факультативно містять лактамний місток: Glu в положенні 12 з Lys в положенні 16; нативний Lys в положенні 12 з Glu в положенні 16; Glu в положенні 16 з Lys в положенні 20; Lys в положенні 16 з Glu в положенні 20; Glu в положенні 20 з Lys в положенні 24; Lys в положенні 20 з Glu в положенні 24; Glu в положенні 24 з Lys в положенні 28; Lys в положенні 24 з Glu в положенні 28. [00136] У певних варіантах здійснення цього винаходу ковалентний внутрішньомолекулярний місток є лактоном. Прийнятні способи формування лактонового містка відомі в цій галузі. Дивись, наприклад, Sheehan et al., J Am Chem Soc 95: 875-879 (1973). [00137] За деякими аспектами цього винаходу олефіновий метатезис застосовується для зшивання одного або двох витків альфа-спіралі згаданого аналога із залученням системи утворення повністю вуглеводневого поперечного зв'язку. Аналог глюкагона в цьому випадку містить α-метиловані амінокислоти, що мають олефінові бічні ланцюги різної довжини та R або S стереохімічної конфігурації в положеннях j та j +3 або і та i+4. У певних варіантах здійснення цього винаходу олефіновий бічний ланцюг містить (СН 2)n, де n - будь-яке ціле число від 1 до 6. У певних варіантах здійснення цього винаходу η дорівнює 3 для поперечного зв'язку довжиною 8 атомів. У певних варіантах здійснення цього винаходу η дорівнює 2 для поперечного зв'язку довжиною 6 атомів. Приклад аналога глюкагона, що містить олефіновий поперечний зв'язок, описаний у цій заявці як SEQIDNO:17. Описи прийнятних способів формування таких внутрішньомолекулярних містків відомі в цій галузі. Дивись, наприклад, Schafmeister etal., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000) та Walensky et al, Science 305: 1466-1470 (2004). В альтернативних варіантах здійснення цього винаходу згаданий аналог містить залишки О-алілSer, розташовані на сусідніх витках спіралі, які з'єднані між собою містком, утвореним шляхом каталізованого рутенієм метатезиса із закриванням циклу. Такі процедури утворення поперечних зв'язків описані, наприклад, у Blackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284 (1998). [00138] За конкретиними аспектами цього винаходу для зшивання одного витка альфаспіралі використовується штучна тіодіаланінова амінокислота, лантіонін, яка набула значного поширення як пептидоміметик цистину. Прийнятні методи циклізації на основі лантіоніна відомі в цій галузі. Дивись, наприклад, Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky et al., J.Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., J. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 22272240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996); та Osapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993). [00139] У певних варіантах здійснення цього винаходу для стабілізації альфа-спіралі аналога використовують α,ώ-діаміноалканові зв'язки (наприклад, 1,4- діамінопропан і 1,5діамінопентан) між двома залишками Glu в положеннях і та i+7. Такі зв'язки викликають утворення містка з 9 атомів або більше, залежно від довжини діаміноалканового зв'язку. Описи відповідних методів отримання пептидів, зшитих такими зв'язками, відомі в цій галузі. Дивись, наприклад, Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119:455-460(1997). [00140] В інших варіантах здійснення цього винаходу для зшивання одного або двох витків альфа-спіралі згаданого аналога використовується дисульфідний місток. Альтернативно для стабілізації альфа-спіралі цього аналога використовується модифікований дисульфідний місток, у якому один або обидва атоми сірки замінені метиленовою групою, наслідком чого є ізостерична макроциклізація. Відповідні способи модифікації пептидів дисульфідними містками або циклізацією на основі сірки описані, наприклад, у Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 93919392 (1991) та Rudinger and Jost, Experiential20: 570-571 (1964). [00141] В інших варіантах здійснення цього винаходу альфа-спіраль згаданого аналога стабілізована шляхом зв'язування атома металу двома залишками His або парою His і Cys, які займають положення j та j+3 або і та і+4. Цим атомом металу може бути, наприклад, Ru(III), Cu(II), Zn(II) або Cd(II). Такі методи стабілізації альфа-спіралі на основі зв'язування металу відомі в цій галузі. Дивись, наприклад, Andrews and Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990); та Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997). 22 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [00142] Альфа-спіраль згаданого аналога альтернативно може бути стабілізована іншими методами циклізації пептидів, огляд яких наведений у Davies, У. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003). Альфа-спіраль може бути стабілізована утворенням амідного містка, містка з простого тіоефіру, містка зі складного тіоефіру, сечовинного містка, карбаматного містка, сульфонамідного містка тощо. Наприклад, місток із складного тіоефіру може бути утворений між С-кінцем і бічним ланцюгом залишку Cys. Альтернативно складний тіоефір може бути утворений бічними ланцюгами амінокислот, що мають тіол (Cys) і карбонову кислоту (наприклад, Asp, Glu). Згідно з іншим методом зшивальний агент, такий як дикарбонова кислота, наприклад, суберинова кислота (октандіова кислота) тощо, може вводити зв'язок між двома функціональними групами бічного ланцюга амінокислоти, як то вільна аміногрупа, гідроксильна група, тіольна група та їх комбінації. Пептиди, стійкі до DPP-IV [00143] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить у положенні 1 або 2 чи в обох положеннях 1 і 2 амінокислоту, яка забезпечує стійкість аналога глюкагона до розщеплення дипептидилпептидазою-IV (DPP-IV). У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить в положенні 1 амінокислоту, вибрану з групи, яку складають: D-гістидин, дезаміногістидин, гідроксил-гістидин, ацетил-гістидин, гомо-гістидин, Nметилгістидин, альфа-метилгістидин, імідазолоцтова кислота, або альфа, альфадиметилімідазолоцтова кислота (DMIA). У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить в положенні 2 амінокислоту, вибрану з групи, яку складають: D-серин, Dаланін, валін, гліцин, N-метилсерин, N-метилаланін або альфа-аміноізомасляна кислота. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить у положенні 2 амінокислоту, яка забезпечує стійкість аналога глюкагона до DPP-IV, і ця амінокислота, яка забезпечує стійкість аналога глюкагона до DPP-IV, не є D-серином. [00144] За деякими аспектами цього винаходу аналог глюкагона, що містить амінокислоту, яка забезпечує стійкість аналога глюкагона до DPP-IV, також містить амінокислотну модифікацію, яка стабілізує альфа-спіраль, що знаходиться в С-кінцевій ділянці глюкагона, наприклад, за допомогою ковалентного зв'язку між амінокислотами в положеннях "i" та "i+4 ", наприклад, 12 і 16, 16 і 20 або 20 і 24. У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий ковалентний зв'язок є лактамним містком між глутаміновою кислотою в положенні 16 і лізином в положенні 20. У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданий ковалентний зв'язок є внутрішньомолекулярним містком, але не лактамним містком. Наприклад, до прийнятних методів ковалентного зв'язування належить будь-який один або більше з таких методів як олефіновий метатезис, циклізація на основі лантіоніна, утворення дисульфідного містка або модифікованого сірковмісного містка, використання α,ω-диаміноалканових зв'язків, утворення містків метал-атом та інші методи циклізації пептиду. Модифікація положення 1 [00145] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить (a) амінокислотне заміщення His у положенні 1 великою ароматичною амінокислотою та (b) внутрішньомолекулярний місток, який стабілізує альфа-спіраль на С-кінцевій ділянці молекули (наприклад, навколо положень 12-29). У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислота в положенні 1 замінена Tyr, Phe, Trp, аміно-Phe, нітро-Phe, хлоро-Phe, сульфоPhe, 4-піридил-Аlа, метил-Туr або З-аміно-Tyr. У певних варіантах здійснення цього винаходу внутрішньомолекулярний місток є будь-яким із розкритих у цьому описі. За деякими аспектами цього винаходу внутрішньомолекулярний місток формується між бічними ланцюгами двох амінокислот, які розділені трьома проміжними амінокислотами, тобто між бічними ланцюгами амінокислот і та i+4. У певних варіантах здійснення цього винаходу внутрішньомолекулярний місток є лактамним містком. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить велику ароматичну амінокислоту в положенні 1 і лактамний місток між амінокислотами в положеннях 16 і 20 згаданого аналога. Такий аналог глюкагона за деякими аспектами цього винаходу також містить одну або більше (наприклад, дві, три, чотири, п'ять або більше) інших модифікацій, розкритих у цьому описі. Наприклад, аналог глюкагона може містити амід на місці С-кінцевого карбоксилата. У певних варіантах здійснення цього винаходу такий аналог глюкагона також містить одну або більше великих аліфатичних кислот у положенні 17, імідазолвмісну амінокислоту в положенні 18 і позитивно заряджену амінокислоту в положенні 19. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналоги глюкагона, що містять модифікацію в положенні 1 і внутрішньомолекулярний місток, також містять амінокислотну послідовність IleHis-Gln у положеннях 17-19. Такі модифікації можуть відбуватись без придушення активності аналога глюкагона на GLP-1-рецепторі та глюкагоновому рецепторі. У певних варіантах 23 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 здійснення цього винаходу аналог глюкагона додатково містить ацильований або алкілований амінокислотний залишок. Модифікація положення 3 [00146] У певних варіантах здійснення цього винаходу третя амінокислота послідовності SEQ ID NO: 1 (Gln3) заміщена залишком кислої, основної або гідрофобної амінокислоти, і така модифікація викликає зниження активності глюкагонового рецептора. У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданою кислою, основною або гідрофобною амінокислотою є глутамінова кислота, орнітин, норлейцин. За деякими аспектами цього винаходу модифікація одним із цих залишків призводить до того, що аналог глюкагона демонструє істотно знижену або ліквідовану активність на глюкагоновому рецепторі або не демонструє взагалі. Аналоги глюкагона, які заміщені, наприклад, глутаміновою кислотою, орнітином або норлейцином, за деякими аспектами цього винаходу мають приблизно 10 % або менше активності нативного глюкагона на глюкагоновому рецепторі, наприклад, приблизно 1-10 %, або приблизно 0,1-10 %, або більше ніж приблизно 0,1 %, але менше ніж приблизно 10 %, у той самий час демонструючи щонайменше 20 % активності GLP-1 на GLP-1-рецепторі. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналоги глюкагона демонструють приблизно 0,5 %, приблизно 1 % або приблизно 7 % активності нативного глюкагона, у той самий час демонструючи щонайменше 20 % активності GLP-1 на GLP-1-рецепторі. [00147] У певних варіантах здійснення цього винаходу глутамін у положенні З послідовності SEQ ID NO: 1 аналога глюкагона заміщений аналогом глутаміну без істотної втрати активності на глюкагоновому рецепторі, і, у певних випадках, із збільшенням активності глюкагонового рецептора. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глутаміну являє собою природну або штучну, або некодовану, амінокислоту, яка містить бічний ланцюг Структури І, II Структури або Структури III: 1 2 4 3 4 де R – С0-3-алкіл або С0-3-гетероалкіл; R -NHR або С1-3-алкіл; R - Сі-з-алкіл; R - Η або С1-34 3 3 алкіл; X - ΝΗ, О або S; та Υ - NHR , SR або OR . У певних варіантах здійснення цього винаходу 4 1 X-NH або Υ - NHR . У певних варіантах здійснення цього винаходу R – С0-2-алкіл або С1-гетеро 2 4 алкіл. У певних варіантах здійснення цього винаходу R -NHR або Сі-алкіл. У певних варіантах здійснення цього винаходу R - Η або С1-алкил. У певних прикладах здійснення цього винаходу 1 2 передбачена амінокислота, що містить бічний ланцюг Структури І, де R -CH2-S, X-NH, і R - СН3 1 2 (ацетамідометилцистеїн, C(Acm)); R - СН2, X-NH, та R – СН3 (ацетилдиамінобутанова кислота, 1 2 4 4 Dab(Ac)); R - С0-алкіл, X-NH, R -NHR , та R - Η (карбамоїлдиамінопропанова кислота, 1 Dap(urea)); або R - СН2-СН2, X - NH, та R – СН3 (ацетилорнітин, Оrn(Ас)). У певних прикладах здійснення цього винаходу передбачена амінокислота, що містить бічний ланцюг Структури II, 1 де R - СН2, Υ - NHR, та R - СН3 (метилглутамін, Q(Me));. В інших прикладах здійснення цього 1 4 винаходу передбачена амінокислота, що містить бічний ланцюг Структури III, де R - СН2 та R Η (метіонінсульфоксид, М(О));. У конкретних варіантах здійснення цього винаходу амінокислота в положенні 3 заміщена Dab(Ac). Наприклад, агоністи глюкагона можуть містити модифіковану амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 595, SEQIDNO:601, SEQIDNO:603, SEQ ID NO: 604, SEQ ID NO: 605 і SEQ ID NO: 606 лістингу послідовностей із Міжнародної патентної заявки PCT/US2009/047438, поданої 16 червня 2009 року, зміст якої в усій повноті включений у цей опис шляхом посилання, де ці амінокислотні послідовності модифіковані, як буде розкрито нижче. Наприклад, модифіковані так, щоб містити щонайменше три амінокислоти, які активують альфа-спіраль, модифіковані так, щоб містити (і) ацильовану або алкіловану амінокислоту в 24 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 положенні 10, (іі) амінокислоту, яка активує альфа-спіраль, у положенні 16, - (ііі) аліфатичну амінокислоту в положенні 17 та/або 18, та (іν) щонайменше одну заряджену кислоту, розташовану в С-кінцевому напрямку відносно положення 27, і факультативно інші модифікації; модифіковані так, щоб містити щонайменше три амінокислоти з амінокислот 18-24 екзендина-4 (SEQ IDNO: 8) у відповідних положеннях аналога глюкагона. Модифікація положення 7 [00148] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить модифіковану послідовність SEQ ID NO: 1 з амінокислотною модифікацією в положенні 7. За деякими аспектами цього винаходу амінокислота в положенні 7 послідовності SEQ ID NO: 1 (Thr) заміщена великою аліфатичною амінокислотою, наприклад, lie, Leu, Ala тощо. Вважається, що такі модифікації значно знижують активність аналога глюкагона на GLP-1-рецепторі. Модифікація положення 15 [00149] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналоги глюкагона містять модифіковану послідовність SEQ ID NO: 1 з амінокислотною модифікацією в положенні 15, яка покращує стабільність. За деякими аспектами цього винаходу амінокислота в положенні 15 послідовності SEQIDNO:1 видалена або заміщена глутаміновою кислотою, гомоглутаміновою кислотою, цистеїновою кислотою або гомоцистеїновою кислотою. Такі модифікації знижують деградацію або розщеплення згаданого аналога з часом, особливо в кислих або лужних буферах, наприклад, буферах з рН від 5,5 до 8. У певних варіантах здійснення цього винаходу аналоги глюкагона, що містять цю модифікацію, зберігають щонайменше 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % вихідного аналога через 24 години при температурі 25 °C. Модифікація положення 16 [00150] Згідно з одним з варіантів здійснення цього винаходу пропонуються аналоги глюкагона, які мають підвищену ефективність і факультативно поліпшену розчинність та стабільність. В одному з варіантів здійснення цього винаходу покращена глюкагонова та GLP-1 ефективність забезпечуються амінокислотною модифікацією в положенні 16 нативного глюкагона (SEQ ID NO: 1). Як необмежувальний приклад, така поліпшена ефективність може бути забезпечена заміщенням природного серина в положенні 16 глутаміновою кислотою або іншою негативно зарядженою амінокислотою, що має бічний ланцюг довжиною 4 атоми, або альтернативно будь-якою амінокислотою з ряду глутаміна, гомоглутамінової кислоти, або гомоцистеїнової кислоти, або зарядженої амінокислоти, що має бічний ланцюг, який містить щонайменше один гетероатом (наприклад, Ν, О, S, Ρ), причому довжина бічного ланцюга складає приблизно 4 атоми (або 3-5 атомів). У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить модифіковану послідовність SEQIDNO: 1, що містить заміщення Ser у положенні 16 амінокислотою, вибраною з групи, яку складають глутамінова кислота, глутамін, гомоглутамінова кислота, гомоцистеїнова кислота, треонін або гліцин. За певними аспектами цього винаходу залишок серину в положенні 16 заміщений амінокислотою, вибраною з групи, яку складають глутамінова кислота, глутамін, гомоглутамінова кислота і гомоцистеїнова кислота. За певними конкретними аспектами цього винаходу залишок серину в положенні 16 заміщений глутаміновою кислотою або її консервативним заміщенням (наприклад, амінокислотою екзендина-4). [00151] В альтернативних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить модифіковану послідовність SEQIDNO: 1, яка модифікована заміщенням Ser у положенні 16 треоніном (Thr), або аміноізомасляною кислотою (АІВ), або іншою амінокислотою, що активує альфа-спіраль, як було показано вище. У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислота, що активує альфа-спіраль, утворює нековалентний внутрішньомолекулярний місток з амінокислотою в J+3 або г+4. Модифікація в положеннях 17-18 [00152] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить модифіковану послідовність SEQ ID NO: 1, у якій видалена двоосновна ділянка Arg-Arg у положеннях 17 і 18. Не дотримуючись жодної конкретної теорії, вважається, що видалення двоосновної ділянки в певних варіантах здійснення цього винаходу покращує in vivo ефективність аналога глюкагона. За деякими аспектами цього винаходу аналог глюкагона відповідно модифікований заміщенням однієї або обох амінокислот у положеннях 17 і 18 послідовності SEQIDNO:1 амінокислотою, яка не є основною, наприклад, аліфатичною амінокислотою. У певних варіантах здійснення цього винаходу одна з амінокислот у положеннях 17 або 18 видалена або між положеннями 17 та 18 вбудована інша амінокислота. У певних варіантах здійснення цього винаходу Arg у положенні 17 заміщений іншою амінокислотою, як розкрито в цьому описі, наприклад, Gin, амінокислотою, що містить гідрофільну складову, амінокислотою, що активує альфа-спіраль. У певних варіантах здійснення цього винаходу 25 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислота, що активує альфа-спіраль, утворює нековалектний внутрішньомолекулярний місток з амінокислотою в j+3 або і+4. У певних варіантах здійснення цього винаходу Arg у положенні 18 заміщений іншою амінокислотою, як розкрито в цьому описі. За деякими аспектами цього винаходу амінокислота в положенні 18 є альфа, альфа-дизаміщеною амінокислотою, наприклад, АІВ. За деякими аспектами цього винаходу амінокислота в положенні 18 є невеликою аліфатичною амінокислотою, наприклад, Ala. За деякими конкретними аспектами цього винаходу амінокислота в положенні 18 є невеликою аліфатичною амінокислотою, наприклад, Ala, і Arg у положенні 17 залишається немодифікованим. Модифікація положення 20 [00153] Підвищена активність на GLP-1-рецепторі також забезпечується амінокислотною модифікацією в положенні 20. У певних варіантах здійснення цього винаходу глутамін у положенні 20 заміщений амінокислотою, що активує альфа-спіраль, наприклад, АІВ, як описано вище. У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислота, що активує альфа-спіраль, утворює нековалентний внутрішньомолекулярний місток з амінокислотою в 7-3 або z-4. У певних конкретних варіантах здійснення цього винаходу амінокислотою є гідрофільна амінокислота, що має бічний ланцюг, яка або заряджена, або має здатність до утворення водневого зв'язку, і має довжину щонайменше 5 (або приблизно 4-6) атомів, наприклад, лізин, цитрулін, аргінін або орнітин, і факультативно утворює сольовий місток з іншою амінокислотою, яка активізує альфа-спіраль у положенні 16, наприклад, негативно зарядженою амінокислотою. Такі модифікації за певними конкретними аспектами цього винаходу знижують деградацію, яка відбувається внаслідок дезамідування Gin і, у певних варіантах здійснення цього винаходу, збільшують активність аналога глюкагона на GLP-1-рецепторі. За деякими аспектами цього винаходу амінокислота в положенні 20 являє собою Glu, або Lys, або АІВ. Модифікація в положеннях 21, 23, 24 та 28 [00154] У певних варіантах здійснення цього винаходу положення 21 та/або положення 24 модифікуються заміщенням амінокислотою, якаактивізує альфа-спіраль. У певних варіантах здійснення цього винаходу амінокислота, яка активізує альфа-спіраль, утворює нековалентний внутрішньомолекулярний місток з амінокислотою в положенні j-3 або в положенні і-4. За певними аспектами цього винаходу амінокислотою, яка активує альфа-спіраль, є АІВ. [00155] У певних прикладах здійснення цього винаходу амінокислотою в положенні 23 є Не. [00156] У певних аспектах цього винаходу амінокислота в положенні 28 є альфа, альфадизамішеною амінокислотою, наприклад, АІВ. [00157] Заряджений С-кінець [00158] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона модифікований амінокислотними заміщеннями та/або приєднаннями, які вбудовують заряджену амінокислоту в С-кінцеву частину згаданого аналога. У певних варіантах здійснення цього винаходу такі модифікації збільшують стабільність і розчинність. Термін "заряджена амінокислота" або "заряджений залишок", вжитий в цьому описі, означає амінокислоту, яка містить бічний ланцюг, і є негативно зарядженою (тобто, депротонована) або позитивно зарядженою (тобто, протонована) у водному розчині при фізіологічному рН. За певними аспектами цього винаходу згадані амінокислотні заміщення та/або приєднання, які вбудовують заряджені амінокислотні модифікації, відбуваються в положенні, розташованому в С-кінцевому напрямку відносно положення 27 послідовності SEQ ID NO: I. У певних варіантах здійснення цього винаходу одна, дві або три (а в певних випадках більше ніж три) заряджені амінокислоти вбудовані в С-кінцеву ділянку (наприклад, в положенні(-ях), розташованому(-их) в С-кінцевому напрямку відносно положення 27). Згідно з певними варіантами здійснення цього винаходу нативна(-і) амінокислота(-и) в положеннях 28 та/або 29 заміщені зарядженими амінокислотами, та/або в іншому варіанті здійснення цього винаходу від однієї до трьох заряджених амінокислот також додані до С-кінця згаданого аналога. У певних прикладах здійснення цього винаходу одна, дві або всі заряджені амінокислоти є негативно зарядженими. Згаданими негативно зарядженими амінокислотами в певних варіантах здійснення цього винаходу є аспарагінова кислота, глутамінова кислота, цистеїнова кислота, гомоцистеїнова кислота або гомоглутамінова кислота. За деякими аспектами цього винаходу ці модифікації збільшують розчинність, наприклад, забезпечують щонайменше 2-, 5-, 10-, 15-, 25-, 30-разову або більше розчинність відносно нативного глюкагона при заданому рівні рН між 5,5 і 8, наприклад, рН 7 при вимірюванні через 24 години при 25 °C. С-кінцеве усічений [00159] Згідно з певними варіантами здійснення цього винаходу аналоги глюкагона, розкриті в цьому описі, модифіковані шляхом усічення С-кінця на один або два амінокислотні залишки. Такі модифіковані глюкагонові пептиди, як показано в цьому описі, зберігають аналогічну 26 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активність і ефективність на глюкагоновому рецепторі та GLP-1-рецепторі. У зв'язку з цим глюкагонові пептиди можуть містити амінокислоти 1-27 або 1-28 аналога нативного глюкагона (SEQ ID NO: 1), факультативно з будь-якою з додаткових модифікацій, розкритих у цьому описі. Незарядженип С-кінець [00160] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона містить модифіковану послідовність SEQ ID NO: 1, у якій карбонова кислота С-кінця замінена незарядженою групою, такою як амід або складний ефір. Не дотримуючись жодної конкретної теорії, такі модифікації в певних аспектах цього винаходу збільшують активність аналога глюкагона на GLP-1-рецепторі. Відповідно, в певних варіантах здійснення цього винаходу аналог глюкагона є амідованим пептидом, так що С-кінцевий залишок містить амід замість альфа-карбоксилату амінокислоти. У значенні, вживаному в цьому описі, загальне посилання на пептид або аналог охоплює пептиди, які мають модифікований(-і) амінокінець та/або карбоксильний кінець. Наприклад, амінокислотний ланцюг, що утворює амідну групу замість кінцевої карбонової кислоти, включається до складу амінокислотної послідовності, що позначає стандартні амінокислоти. Інші модифікації [00161] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналоги глюкагона додатково або альтернативно містять такі амінокислотні модифікації: (і) заміщення серину (Ser) в положенні 2 аланіном (Ala); (іі) заміщення тирозину (Тyr) у положенні 10 валіном (Val), або фенілаланіном (Phe), або триптофаном (Тrр); (ііі) заміщення лізину (Lys) в положенні 12 аргініном (Arg); (iv) заміщення аргініну (Arg) у положенні 17 глутаміном (Gin) або невеликою аліфатичною амінокислотою, наприклад, аланіном (Ala), або великою аліфатичною кислотою, наприклад, ізолейцином (Не); (ν) заміщення аргініну (Arg) у положенні 18 невеликою аліфатичною амінокислотою, наприклад, аланіном (Ala); або імідазол-вмісною амінокислотою, наприклад, гістидином (His); (vi) заміщення аланіну (Ala) у положенні 19 позитивно зарядженою амінокислотою, наприклад, глутаміном (Gin); (vii) заміщення валіну (Val) у положенні 23 ізолейцином (Не), і (viii) заміщення треоніну (Thr) у положенні 29 гліцином (Gly) або глутаміном (Gin). [00162] У певних варіантах здійснення цього винаходу стабільність аналога глюкагона підвищена модифікуванням метіоніну в положенні 27, наприклад, заміщенням лейцином або норлейцином. Такі модифікації можуть знижувати окиснювальну деградацію. Стабільність також може бути підвищена модифікуванням глутаміну (Gin) у положенні 20, або 24, або 28, наприклад, заміщенням аланіном (Ala), серином (Ser), треоніном (Thr) або аміноізомасляною кислотою (АІВ). Такі модифікації можуть знижувати деградацію, яка відбувається внаслідок деамідування глутаміну (Gin). Стабільність може бути збільшена модифікацією аспарагінової кислоти (Asp) у положенні 21, наприклад, заміщенням іншим кислим залишком, наприклад, глутаміновою кислотою (Glu). Такі модифікації можуть знижувати деградацію, яка відбувається внаслідок дегідрування аспарагінової кислоти (Asp) для утворення циклічних сукцинімідних проміжних сполук із подальшою ізомеризацією в ізоаспартат. [00163] У певних варіантах здійснення цього винаходу аналоги глюкагона, розкриті в цьому описі, глікозильовані, амідовані, карбоксильовані, фосфорильовані, перетворені на складний ефір, N-ацильовані, циклізовані за допомогою, наприклад, дисульфідного містка, або перетворені на сіль (наприклад, сіль приєднання кислоти, сіль приєднання основи), та/або факультативно димеризовані, мультимеризовані, полімеризовані або кон'юговані. [00164] Будь-яка з модифікацій, розкритих у цьому описі, охоплюючи, наприклад, модифікації, які підвищують або знижують активність глюкагонового рецептора і які підвищують активність GLP-1-рецептора, можуть бути застосовані індивідуально або в комбінації. Комбінації модифікацій, які збільшують активність GLP-1-рецептора, можуть забезпечувати більш високу активність GLP-1, ніж будь-яка з таких модифікацій окремо. Приклади здійснення винаходу [00165] Цим винаходом пропонуються пептиди, які містять структуру, подібну до структури нативного глюкагона людини, і які демонструють підвищену агоністичну активність на GLP-1рецепторі порівняно з нативним глюкагоном людини. Глюкагон, як правило, має приблизно 1 % активності нативного GLP-1 на GLP-1-рецепторі, тоді як GLP-1, як правило, має менше ніж приблизно 0,01 % активності нативного глюкагона на глюкагоновому рецепторі. Відповідно, пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють більше ніж 1 % активності нативного GLP-1 на GLP-1-рецепторі. У певних прикладах здійснення цього винаходу пептиди, розкриті в цьому 27 UA 114792 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 описі, демонструють більше ніж або приблизно 5 %, більше ніж або приблизно 10 %, більше ніж або приблизно 15 %, більше ніж або приблизно 20 %, більше ніж або приблизно 25 %, більше ніж або приблизно 30 %, більше ніж або приблизно 35 %, більше ніж або приблизно 40 %, більше ніж або приблизно 45 %, більше ніж або приблизно 50 %, більше ніж або приблизно 55 %, більше ніж або приблизно 60 %, більше ніж або приблизно 65 %, більше ніж або приблизно 70 %, більше ніж або приблизно 75 %, більше ніж або приблизно 80 %, більше ніж або приблизно 85 %, більше ніж або приблизно 90 % або більше ніж або приблизно 95 % активності нативного GLP-1 на GLP-1-рецепторі. За деякими аспектами цього винаходу пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють активність на GLP-1-рецепторі, яка є більшою за активність нативного GLP-1. Відповідно, за деякими аспектами цього винаходу пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють більше ніж або приблизно 100 % активності нативного GLP-1 на GLP-1-рецепторі. За деякими аспектами цього винаходу пептиди, розкриті в цьому описі, демонструють більше ніж або приблизно 150 %, більше ніж або приблизно 200 %, більше ніж або приблизно 250 %, більше ніж або приблизно 300 %, більше ніж або приблизно 350 %, більше ніж або приблизно 400 %, більше ніж або приблизно 450 %, більше ніж або приблизно 500 %, більше ніж або приблизно 550 %, більше ніж або приблизно 600 %, більше ніж або приблизно 650 %, більше ніж або приблизно 700 %, більше ніж або приблизно 750 %, більше ніж або приблизно 800 %, більше ніж або приблизно 850 %, більше ніж або приблизно 900 %, більше ніж або приблизно 950 % чи більше ніж або приблизно 1000 % активності нативного GLP-1 на GLP-1-рецепторі. [00166] У певних прикладах здійснення цього винаходу пептид містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 12. [00167] У певних прикладах здійснення цього винаходу пептид містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 13. [00168] У певних прикладах здійснення цього винаходу пептид містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 14. [00169] У певних прикладах здійснення цього винаходу пептид містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 15. [00170] У певних прикладах здійснення цього винаходу пептид містить амінокислотну послідовність SEQIDNO:16 і демонструє щонайменше 100-разову селективність для GLP-1рецептора людини порівняно з GIP-рецептором. [00171] У певних прикладах здійснення цього винаходу пептид містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 17. [00172] Цим винаходом також пропонуються варіантні пептиди, які містять амінокислотну послідовність, що значною мірою подібна до амінокислотної послідовності одного з пептидів, розкритих у цьому описі. У певних прикладах здійснення цього винаходу варіантний пептид, розкритий в цьому описі, містить амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 80 %, 85 %, 90 % або 95 % ідентична амінокислотам 1-29 амінокислотної послідовності пептиду будь-якої з послідовностей SEQIDNO: 12-17, де варіантний пептид зберігає активність вихідного пептиду на GLP-1-рецепторі, глюкагоновому рецепторі і GIP-рецепторі (наприклад, демонструє щонайменше 100-разову селективність для GLP-1-рецептора людини з у порівнянні з GIPрецептором), і а також факультативно зберігає ефективність GLP-1 приблизно 1 %; або де ЕС50 пептиду на GIP-рецепторі менше ніж 100-разово відрізняється від його ЕС50 на GLP-1рецепторі). У певних прикладах здійснення цього винаходу варіантний пептид, розкритий в цьому описі, демонструє в щонайменше в 100 разів більшу селективність до GLP-1-рецептора людини у порівнянні з GIP-рецептором. [00173] У певних прикладах здійснення цього винаходу варіантний пептид, розкритий в цьому описі, містить амінокислотну послідовність, засновану на амінокислотній послідовності пептиду, розкритому в цьому описі, але відрізняється за одним або кількома амінокислотними положеннями, включаючи, але без обмеження ними, положення 1, положення 2, положення 3, положення 7, положення 10, положення 12, положення 15, положення 16, положення 17, положення 18, положення 20, положення 21, положення 23, положення 24, положення 27, положення 28, положення 29. За певними аспектами цього винаходу варіантний пептид може містити консервативне заміщення, яке відповідає вихідному пептиду, може містити будь-яку з амінокислотних модифікацій, розкритих у цьому описі, або може містити амінокислотну модифікацію, яка повертає до амінокислоти, присутньої в цьому положенні в послідовності нативного глюкагона (SEQ ID NO: 1). За деякими аспектами цього винаходу варіантний пептид, розкритий в цьому описі, містить амінокислотну послідовність, засновану на амінокислотній послідовності пептиду, розкритій в цьому описі, але відрізняється за одніює або більше наведеними нижче ознаками: 28